Abstract
Bakgrunn
Flere studier har vist den prognostiske og prediktive potensialet av molekylære markører i en kombinert behandling for lungekreft. De fleste av dem er nevnt, men å opererbar tidlig stadium NSCLC. Målet med denne studien er å relatere uttrykk for flere mRNA markører i bronkoskopi fått kreftprøver med klinisk utfall av avansert lungekreft.
Metoder
bronkoskopi kreftprøver ble tatt fra 123 pasienter med radiologisk diagnose av avansert lunge svulst. Ut av 123 pasienter 50 ble diagnostisert med plateepitelkreft, 17 med adenokarsinom, 12 med NOS, 32 med SCLC og ett med stor celle neuroendocrinal kreft. I 11 pasienter andre svulster ble diagnostisert. Gruppen var heterogen med hensyn til klinisk stadium, ytelse av pasientene og behandling. Kvantitativ real time PCR ble utført av ABI 7900 HT maskin, med Universal Probe Library (Roche) fluorescerende prober. Genene er valgt for analysen var ERCC1, EGFR, BRCA1, CSF1, CA9, DUSP6, STAT1, ErbB3, MMD, FN1, og CDKN1B.
Resultater
Mer enn 50 ng av RNA ( mengden anses tilstrekkelig for analyse) ble isolert i 82 ut av 112 lungekreft prøver (73%), inkludert 60/80 (75,0%) av NSCLC-prøver og 22/32 (68,7%) av SCLC prøver. Den høyeste Cohens κ koeffisient for diskriminering mellom liten celle, plateepitelkarsinom og adenokarsinom ble funnet for CDKN1B, CSF og EGFR1 (κ = 0,177, p = 0,0041). En multivariat Cox regresjonsmodell har vist en betydelig innvirkning på klinisk stadium (p 0,001, RR = 4,19), ERCC1 (p = 0,01, RR = 0,43) og CA9 (p = 0,03, RR = 2,11) uttrykk på total overlevelse i en gruppe på 60 pasienter med NSCLC.
Konklusjon
Disse resultatene viser muligheten for multippel analyse av genuttrykk i bronkoskopi fått kreftprøver som prognostiske markører i strålebehandling og kjemoterapi for avansert lungekreft. En begrensende faktor var forholdsvis høy andel av prøver fra hvilken tilstrekkelig mengde av RNA ikke kunne isoleres
relasjon:. Suwinski R, Klusek A, Tyszkiewicz T, Kowalska M, Szczesniak-Klusek B, Gawkowska-Suwinska M, et al. (2012) Gene Expression fra Bronkoskopi innhentet Tumorprøver som en prediktor for utfallet i Advanced ubrukelig lungekreft. PLoS ONE syv (7): e41379. doi: 10,1371 /journal.pone.0041379
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 23 april 2012; Godkjent: 20 juni 2012; Publisert: 27.07.2012
Copyright: © Suwinski et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble sponset av et forskningsstipend NN 403 290636 gitt av departementet for vitenskap og høyere utdanning i republikken Polen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Flere studier viste potensialet i genuttrykk profiler for prediksjon av utfallet i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [1] – [8]. De fleste av disse studiene er nevnt, men for å kirurgisk behandlet tidlig stadium sykdom. Tilgjengeligheten og kvaliteten på kreftprøver innhentet ved kirurgi gjør denne tilnærmingen ble foreslått gjennomførbart, og dermed ulike prognostiske signaturer for tidlig stadium sykdommen.
Dessverre er lungesvulster ofte diagnostisert i avansert klinisk stadium, der strålebehandling og /eller kjemoterapi er sjef behandlingstilbud. Også den patologiske diagnose av småcellet lungekreft (SCLC) utelukker bruk av kirurgi i de fleste av tilfellene. Følgelig kan prognostiske signaturer som refererer til de pasienter som behandles med kirurgi har begrenset, om noen, anvendbarhet til enkeltpersoner og datasett som kjemoterapi og /eller kjemoterapi er hoved terapeutisk alternativ. Man kan forvente at de samme genene som disponerer kreftceller til dårlig differensiering, og dermed til tilbøyelighet for formidling etter operasjonen, kan medføre økt Radiosensitivity og /eller kjemosensitivitet grunnet kort cellefornyelsen. Slike forskjeller understreke behovet for analyser som evaluerer genuttrykk fra bronkoskopi innhentet vevsprøver, og forholde uttrykket til klinisk utfall. Utviklingen av prognostiske underskrifter for avanserte ubrukelige svulster har ligget, men bak tilsvarende forsøk med kirurgisk innhentet prøver [9]. Dette skapte grunnlaget for denne studien.
Metoder
Pasient
Utvalgskriterier inkluderte pasienter med radiologisk diagnosen lunge svulst som var mistenkt for malignitet. Bare pasienter med bronkoskopi tilgjengelige avanserte svulster, anses ubrukelig ved første diagnose, ble vurdert. En informert samtykke var nødvendig for inkludering i studien. En protokoll av denne forskningen ble godkjent av den lokale Bioetisk komiteen i henhold til nasjonale bestemmelser.
Mellom november 2006 og april 2009 viste prøver tatt ble oppnådd under rutine bronkoskopi i 123 pasienter. Prøvene ble utbygd umiddelbart etter biopsi og en del av prøven ble brukt til patologisk undersøkelse, mens den resterende delen ble lagret for analyse av genuttrykk.
Av 123 pasienter 50 (40,6%) ble diagnostisert med plateepitelkreft , 17 (13,8%) med adenokarsinom, 12 (9,7%) med NOS (ikke annet er angitt) NSCLC, 32 (26,0%) med små-celle lungekreft og en med stor celle neuroendocrinal kreft. I 7 pasienter andre krefttyper ble diagnostisert, inkludert 2 tilfeller av lymfom og 5 metastatiske svulster. I 2 pasienter svulst ikke synes å være ondartet, og i 3 tilfeller definitive patologisk diagnose kunne ikke opprettes.
I sammendraget 112 ut av 123 prøver (91,1%) ble brukt i studien. Dette inkluderte 80 prøver av ikke-småcellet lungekreft, og 32 av småcellet lungekreft.
Gene Expression Analysis
Tumorprøver ble plassert i 5 ml RNA senere og lagret i -20 ° C før analyse. Isolering av RNA ble utført med RNeasy Midi Kit (Qiagen) etter standard prosedyrer. Renset RNA ble lagret i -70 ° C. Konsentrasjonen av RNA ble bestemt ved spektrofotometri (260 nm absorpsjon) ved hjelp av Nanodrop ND-1000. Kvaliteten på RNA ble vurdert ved kapillær elektroforese i Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) ved hjelp av RNA 6000 Nano analysen. En grad av RNA-degradering ble bestemt ved beregning av RNA Integrity Number (RIN). cDNA ble syntetisert på RNA matrise ved revers transkripsjon hjelp Omniscript Kit (Qiagen).
Kvantitativ Real Time PCR ble utført av ABI 7900 HT maskin, med Universal Probe Library (Roche). Uttrykket av målgener var normalisert i forhold til seks referansegener (UBE2D2, PGK1, HADHA, EIF3S10, CCT7 og B2M)
Elleve gener ble valgt for analyse. ERCC1, EGFR, BRCA1, CSF1, CA9, DUSP6, STAT1, ErbB3, MMD, FN1, og CDKN1B. Slike valg var basert på publiserte prognostiske signaturer, de fleste som henvises til kirurgisk rekke pasienter med NSCLC. Tabell 1 oppsummerer den sannsynlige virkningsmekanismen til disse genene, i tillegg til det forventede resultatet relatert til over-ekspresjon av genet. Vi merker oss at det forventede resultatet viser, hovedsakelig, til tidlig stadium svulster, og ikke til pasienter med avansert inoperabel sykdom.
Statistical Analysis
Hovedmålet med analysen var å kategorisere svulster i henhold til klinisk prognose, utnytte dataene på genuttrykk. Gruppen var imidlertid heterogen med hensyn til tumor patologi, kliniske karakteristika og behandling som kan ha betydelig innvirkning på klinisk utfall, uavhengig av genuttrykk. Derfor statistiske metoder tillates justering for konfunderende kliniske faktorer.
Påvirkningen av genekspresjon på overlevelse ble analysert ved hjelp av univariat og multivariat Cox regresjonsmodell. Normalisert genekspresjon ble dikotomisert, slik at det ble kodet som 0 (lav) eller 1 (høy) ved hjelp av medianverdien uttrykk som en cut-off [2] .Samlet overlevelse ble beregnet som tiden fra diagnose til død (usensurert) eller som tiden fra diagnose til den siste oppfølging (sensurert). Vurderer utforskende hensikten med denne forskningen og relativt liten utvalgsstørrelse, ble Cox f test som brukes til å vurdere betydningen av forskjeller i overlevelse mellom to grupper. Denne testen er beregnet for analyse av små grupper, i motsetning til log-rank test som blir brukt for analyse av store kliniske datasett.
A univariate Cox-modellen av overlevelse ble anvendt for å beregne relative risiko (RR) for død hos dikotomisert grupper. Bare de variablene som dukket opp betydelig, eller som viste en trend for signifikans (RR 0,7 eller RR 1,3 og p 0,15) ble vurdert i en multivariat modell. Utvalg basert på statistiske trender er rettferdiggjort av klinisk heterogenitet i gruppen som, når rede, kan forvirre mulig prognostisk virkningen av genuttrykk. En multivariat Cox proporsjonal hazard regresjonsmodell identifisert de variablene som betydelig og uavhengig påvirket overlevelse. Modellen ble optimalisert ved hjelp bakover trinnvis regresjon. Variablene som betydelig og uavhengig påvirket total overlevelse ble brukt til å konstruere en prognostisk signatur basert på resultater fra en multivariat studie.
Siden den kliniske prognose og behandling av SCLC variere helt fra NSCLC overlevelse i disse to gruppene ble analysert separat.
For å identifisere gener som kan diskriminere mellom 3 store patologiske undergrupper (plateepitelkreft, adenokarsinom og småcellet lungekreft) t-test ble brukt på utbruddet. For ytterligere å undersøke mulige forhold mellom genekspresjon og patologisk typen av tumor-k-middel-metoden ble anvendt. Denne metoden representerer den klyngeanalyse som tar sikte på oppdeling av n observasjoner i k klynger, hvor hver observasjon tilhører gruppen med den nærmeste midlere [10]. Den beste sammenheng mellom uttrykk av gener og patologisk type svulsten ble etablert ved hjelp av Cohens κ koeffisient som er et statistisk mål på inter-rater avtale for kategoriske elementer [11]. Vi merker oss at genene analysert i denne studien ble valgt som potensielle prognostiske faktorer i kjemoterapi og ikke som potensielle discriminators mellom tumortyper.
Resultater
Kvaliteten på RNA
Mer enn 50 ng RNA (det anses tilstrekkelig for analyse mengde) ble isolert i 82 ut av 112 lungekreft prøver (73%), inkludert 60/80 (75,0%) av NSCLC prøver og 22/32 (68,7%) av SCLC prøver. Blant pasienter med plateepitelkreft en tilstrekkelig mengde RNA ble oppnådd i 38/50 (76,0%) sammenlignet med 12/17 (70,6%) med adenokarsinom og til 10/12 (83,3%) med NOS NSCLC. Meget god integritet RNA (RIN 8-10) ble oppnådd på bare 12,3% av prøvene. Disse viser at analysen av bronkoskopi innhentet vevsprøver krever ytterligere optimalisering før klinisk implementering. Analysen, som vist, var basert på genekspresjon status evaluert i 82 prøver fra hvem tilstrekkelig mengde RNA ble isolert (60 NSCLC og 22 SCLC).
Gene Expression Ifølge patologi av tumoren
t-test avslørte at BRCA1, CDKN1B og CSF uttrykk skilte seg mellom småcellet og ikke-småcellet lungekreft (p-verdier på 0,01, henholdsvis 0,02 og 0,02). To andre gener (EGFR1, STAT1) har vist en trend. (P-verdier 0,07 og 0,09 henholdsvis). Til sammenligning var ingen signifikante forskjeller i genuttrykk funnet mellom plateepitelkreft og adenokarsinom, selv om det var en trend for BRCA1, CDKN1B og ERCC1. Den høyeste Cohens κ koeffisient for diskriminering mellom liten celle, plateepitelkarsinom og adenokarsinom ble funnet for CDKN1B, CSF og EGFR1 (κ = 0,177, p = 0,0041). Et slikt anslag indikerer en relativt liten, men signifikant sammenheng mellom uttrykket av disse genene og patologisk type svulst.
kliniske faktorer vs Survival i målgruppen
Tabell 2 viser kliniske kjennetegn ved 60 pasienter med NSCLC som hadde kjent genuttrykk status. Gruppen var heterogen med hensyn til klinisk stadium, ytelse av pasientene og behandling. Som forventet, de fleste av pasientene var i avanserte kliniske stadier, inkludert 48% med stadium IV sykdom. Bare to individer (3%) var i stadium I-II sykdom (begge ble ansett ubrukelige på grunn av komorbiditet). Seksti prosent av pasientene hadde kjemoterapi (cisplatin basert dubletter), 57% hadde strålebehandling med totale doser 20-70 Gy (median på 30 Gy). Median oppfølging er 3,6 år).
Stage, funksjonsnivå og kjønn betydelig påvirket overlevelse i en univariat modell, men i en multivariat analyse kun klinisk stadium syntes å ha og uavhengig prognostisk betydning (RR = 3,56, 95% CI = 1,95 til 6,45, p = 0,00003). Derfor klinisk stadium ble videre ansett som den viktigste faktor som kan forvirre mulig prognostisk betydning av genuttrykk.
Univariat Influence of Gene Expression på Survival
Tabell 3 viser innflytelsen av 11 utvalgte gener på total overlevelse i en gruppe på 60 pasienter med NSCLC. Ut av 11 gener bare uttrykk for ERCC1 hatt en betydelig innflytelse på overlevelse, mens uttrykk for fire andre gener (CA9, ErbB3, fn1 og STAT1) viste en trend (RR 0,7 eller RR 1,3 og p 0,015). Høy uttrykk for tre av disse genene (CA9, fn1 og STAT1) var relatert til økt fare for død, mens over-uttrykk for ERCC1 og ErbB3 hadde en beskyttende effekt. Viktigst (som vil bli diskutert videre) slik resultatet har en rasjonell forklaring på biologiske funksjonen til disse genene, og i utfallet av de publiserte studiene. Svakhet av betydningen av individuell genuttrykk for overlevelse er ikke overraskende, med tanke på klinisk heterogenitet og lite utvalg av gruppen.
For de utforskende formål vi konstruert en prognostisk poengsum som overekspresjon av hver risikogener (CA9 , FN1 eller STAT1) ble kodet som en, mens overekspresjon av hver av de beskyttende genet (ERCC1 eller ErbB3) ble kodet som -1. Poengene ble lagt til. Summen under null betegnet lav risiko, mens summen av null eller flere betegnet høy risiko. Figur 1a viser total overlevelse i henhold til slike fem-genet signatur. Forskjellen i overlevelse mellom høy og lav risikogruppene var signifikant (RR = 1,89, p = 0,02). Når analysen ble begrenset til 31 pasienter med lokalisert sykdom forskjellen mellom høy og lav risikogrupper forble signifikant (RR = 2,3, p = 0,03, Figur 1b). Det har også vært viktig i 29 pasienter med metastatisk sykdom (RR = 2,3, p = 0,03, Figur 1c).
A) 60 pasienter med NSCLC. B) 31 pasienter med lokalisert sykdom (stadium I-III). C) 29 pasienter med metastaserende sykdom (stadium IV).
multivariat analyse
Fem gener som dukket opp betydelig eller demonstrert trend i en univariat modell ble inkludert i en multivariat analyse (ERCC1, ErbB3, CA9, FN1 og STAT1). Slik analyse viste at tre av fem gener (ErbB3, fn1 og STAT1) ikke kan anses som uavhengige prognostiske faktorer. Overekspresjon av ErbB3 var mer vanlig hos kvinner, og ble dermed knyttet til sykdomsstadium (avansert stadium var mer vanlig hos menn). Likeledes overekspresjon av FN1 var mer vanlig i de mest avanserte kliniske stadier. Overekspresjon av STAT1 var korrelert med overekspresjon av CA9. To gener forble betydelig i variant av en multivariat modell som ikke står for tumorstadium: ERCC1 (RR = 0,53, 95% KI 0,30 til 0,96, p = 0,03) og CA9 (RR = 1,79, 95% KI 1,00 til 3,21, p = 0,05).
Multivariate modell som utgjorde også for det stadiet av sykdommen bekreftet en betydelig og uavhengig prognostisk verdi av ERCC1 og CA9 ekspresjon (tabell 4). Den prognostiske poengsum konstruert basert på resultatene fra den multivariate analysen var som følger:
der klinisk stadium, samt CA9 og ECCC1 uttrykk ble dikotomisert og kodet som 0 eller 1. Verdier over medianen på 2,5 betegnet høy risiko . Figur 2 viser overlevelseskurver i henhold til risikogrupper. Forskjellen i overlevelse mellom gruppene var statistisk signifikant (RR = 4,40, 95% KI 2,35 til 8,17, p = 0,00003), og forskjellen gått univariate påvirkning av scenen (RR = 3,56).
småcellet lungekreft
av 22 pasienter med SCLC 7 hadde begrenset og 15 omfattende sykdom. Graden av sykdom som ikke synes å påvirke overlevelsen signifikant (RR-0,95, p = 0,93). I motsetning til overuttrykk av 2 gener syntes å betydelig redusere overlevelse (CA9: RR = 1,6, p = 0,04 og MMD, RR = 1,8, p = 0,03). Den kliniske implikasjonen av dette funnet er likevel tvilsom på grunn av svært liten størrelse og klinisk heterogenitet i gruppen.
Diskusjoner
Gene uttrykket har blitt brukt for klassifisering og prognose for ikke-liten celle lungekreft, selv om siste gjennomgang av de publiserte data tyder på at denne tilnærmingen er ennå ikke klar for klinisk anvendelse [6]. De fleste av de aktuelle undersøkelser omtalt kirurgisk serie [1] – [8], [12] – [17], med bare noen få som har forsøkt å analysere genekspresjonsprofiler basert på bronkoskopi erholdt prøver [9]. Derimot, ble evaluering av EGFR mutasjoner som prediktiv analyse for tyrosinkinasehemmere i avansert adenokarsinom i lungene anses som et stort gjennombrudd, og dukket opp som en ny diagnostisk verktøy [18]. Dette viser at, til tross for vanskeligheter og begrensninger, vil molekylære markører trolig spille en stadig større rolle i diagnostikk, prognose og prediksjon for avansert ikke-småcellet lungekreft.
Resultatene fra denne studien indikerer at analysen av genuttrykk profiler basert på bronkoskopi innhentet prøver er gjennomførbart, men metodene som ble brukt etterspørsel optimalisering. Den viktigste begrensende faktor var forholdsvis høy andel av prøver fra hvilken tilstrekkelig mengde av RNA ikke kunne isoleres. En annen faktor som bidro til uønsket frafall av tilfellene var patologisk diagnose som ikke hadde vært tilgjengelig før bronkoskopi. En andel av pasientene hadde, og dermed forskjellig diagnose fra det forventet å basert på symptomer, klinisk undersøkelse og bildebehandling.
Av elleve gener studert høyt uttrykk av 3 gener (CA9, fn1 og STAT1) var relatert til økt fare for å dø, mens over-uttrykk for ERCC1 og ErbB3 hadde en beskyttende effekt. Et slikt utfall har en rasjonell støtte i biologiske funksjonen til disse genene, og i utfallet av utvalgte publiserte studier.
ERCC1 syntes å være sterkest knyttet til prognosen i denne studien. Det er ansvarlig for nucleotide excision reparasjon av skadet DNA. Over-ekspresjon av dette genet kan forsterke skade av tumorceller fra stråling eller narkotika og bidra til en bedre prognose [16]. Slik slutning ble støttet av de foreliggende data.
CA9 er ansett for å være en surrogatmarkør for tumor hypoksi. Strålebehandling eller cytotoksiske legemidler er mindre effektive i hypoksisk miljø, og dermed et økt uttrykk av CA9 kan bidra til dårligere prognose. En slik slutning er støttet av den foreliggende undersøkelsen. I motsetning til dette, en økt ekspresjon av CA9 hadde en beskyttende effekt for betjenbar squamous celle lungekreft [2] som kan illustrere mulige forskjeller i prognostisk betydning av et gitt gen i kirurgiske og ikke-kirurgiske serie.
ErbB3 koder for et medlem av den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) familie av reseptor-tyrosin-kinaser. Høy uttrykk for dette genet dukket korrelert med spesifikke klinikk-patologiske trekk ved japansk lungekreft [15]. Viktigst ErbB3 var over-uttrykt i røykfrie kvinner med mutert EGFR, dvs. i en gruppe med gunstige prognostiske funksjoner. Selv om ingen data om EGFR mutasjoner var tilgjengelig i den nåværende serien, over-uttrykk for ErbB3 var mer vanlig hos kvinner med adenokarsinom, støtte, og dermed resultatene av den japanske studien. Fordi prognosen hos kvinner var bedre, over-ekspresjon av ErbB3 hadde en beskyttende (men ikke uavhengige) virkning på overlevelsen i de foreliggende serier. Interessant nok en motsatt effekt av ErbB3 over-ekspresjon (økt fare for å dø) ble åpenbart i det kirurgiske studien [1]. Dette kan igjen illustrere eventuelle forskjeller i prognostisk betydning av et gitt gen i kirurgisk og ikke-kirurgisk serien.
STAT1 er involvert i opp regulerende gener, noe som fører til økt uttrykk av Interferon stimulert gener. Over-ekspresjon av STAT1 var relatert til bedre prognose i kirurgisk serie [1], men ikke i den foreliggende undersøkelse. Den foreliggende analyse bekrefter faktisk at STAT1 over-ekspresjon ble relatert til over-ekspresjon av andre gener (inkludert alle 6 referanse gener), men nettoeffekten av et slikt forhold var en trend for en beskyttende virkning av STAT1. Et slikt resultat kan forklares ved sterk korrelasjon av STAT1 og CA9 tydelig i de foreliggende data.
Endelig er FN1 kjent for sin rolle i celle-adhesjon, vekst, migrering og differensiering. Sin over-ekspresjon ble relatert til stimulering av ikke-liten celle lunge cancer vekst gjennom aktivering av Akt /mTOR /S6-kinase og inaktivering av LKB1 /AMP-aktivert protein kinase signalvei [17]. Over-uttrykk for FN1 var relatert til dårligere prognose i den nåværende serien, men det så ikke ut som en nyttig markør i denne analysen på grunn av korrelasjon med klinisk stadium.
Den prognostiske poengsum foreslåtte krever godkjenning ved en uavhengig datasett. Vi merker oss imidlertid at i motsetning til studier som søker etter de nye markører, vi bare utforsket markørene kjent for å ha en mulig prognostisk verdi i postoperativ setting. Man kan vurdere, og dermed at det var denne studien at validert markørene som tilbys av de andre forfatterne i et datasett som inkluderte pasientene i avansert stadium av sykdommen. Testing av prognostisk poengsum prospektivt i mer homogene pasientgrupper er vår fremtid mål. Også teste de andre gener vil trolig bidra til forbedring av den foreslåtte forenklede poengsum.
I sammendraget, konkluderer vi at analyse av genuttrykk profiler basert på bronkoskopi innhentet prøver dukket gjennomførbart, men metodikken som var brukte kravene ytterligere optimalisering. To-genet signatur foreslått for avansert inoperable NSCLC kan vises nyttige, spesielt i klinisk homogene grupper.
