Abstract
Målet med denne studien var å finne ut om MUC1 antistoff konjugert med en fluorophore kunne brukes til å visualisere kreft i bukspyttkjertelen. Anti-MUC1 (CT2) antistoff ble konjugert med 550 nm eller 650 nm fluoroforer. Nude mus ble brukt til å lage subkutane og ortotopiske modeller av kreft i bukspyttkjertelen. Western blot og flowcytometrisk analyse bekreftet uttrykk for MUC1 i menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer inkludert BxPC-3 og Panc-1. Immunocytokjemi med fluoroforen konjugert anti-MUC1-antistoff viste fluorescente områder på membranen av Panc-1 cancerceller. Etter å injisere de konjugerte anti-MUC1 antistoffer via halevenen, subkutant transplantert Panc-1 og BxPC-3 svulster slippes sterke fluorescerende signaler. I de subkutane tumormodeller ble det fluorescente signalet fra det konjugerte anti-MUC1-antistoff bemerket rundt margen av svulsten og rommet mellom cellene. Det konjugerte anti-MUC1 antistoff bundet tumoren i orthotopically-transplanterte Panc-1 og BxPC-3 modeller som gjør det mulig at tumorene som skal avbildes. Denne studien viste at fluoroforen konjugert anti-MUC1 antistoffer kunne visual pankreastumorer in vitro og in vivo, og kan bidra til å forbedre diagnostikk og behandling av kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Park JY, Hiroshima Y, Lee JY, Maawy AA, Hoffman RM, Bouvet M (2015) MUC1 selektivt Targets Menneskelig kreft i bukspyttkjertelen i ortotopiske Nude musemodeller. PLoS ONE 10 (3): e0122100. doi: 10,1371 /journal.pone.0122100
Academic Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA
mottatt: 14 januar 2015; Godkjent: 18 februar 2015; Publisert: 27 mars 2015
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering: Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Cancer Institute CA142669 og CA132971 (til MB og Anticancer cancer~~POS=HEADCOMP, Inc.), og et stipend fra Korea Research Foundation under grunnforskning promotering fond av Kunnskapsdepartementet og Helse- Resources Development of Korea 2010-0022990 (til JYP). Den Funder gitt støtte i form av lønn for forfattere [MB], men hadde ikke noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. JYP, YH og RMH er ikke-lønnede filialer av kreftbekjempende Inc. anticancer Inc. markedsfører dyremodeller av kreft. Det er ingen andre konkurrerende interesser. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
svulst markør CA19-9 kan være påvises i serum hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Imidlertid er nytten av CA19-9 som en diagnostisk eller prognostisk kreft markøren er tvilsom. Sensitiviteten av serum CA19-9 i området 41-86% med en spesifisitet på 33 til 100%, som ikke er egnet for screening eller diagnose [1]. CA19-9 ofte forhøyet i andre inflammatoriske sykdommer og galleobstruksjon betingelser slik at dens nytte som en biomarkør er enda mer tvilsom. Bedre biomarkører for kreft i bukspyttkjertelen er nødvendige [2].
MUC1 er et membranbundet glykoprotein som består av et stort ekstracellulært subenhet av en 20 aminosyre tandem gjentagelse domene, en liten ekstracellulært domene subenhet, en transmembran domene og en cytoplasma tail [3]. MUC1 ofte overuttrykt i en rekke kreftformer, inkludert bryst, ovarie, lunge, og tykktarmskreft [3,4]. Det er også ansett som en potensiell diagnostisk, prognostisk og terapeutisk biomarkør for kreft i bukspyttkjertelen. MUC1 er overuttrykt i over 90% av bukspyttkjertelkreft pasientsvulster [5]. Sterk ekspresjon av MUC1 er knyttet til redusert overlevelse [6]. MUC1 målrettet terapi har blitt testet i prekliniske og kliniske studier [7-9]. Forsøk er blitt gjort for å detektere MUC1 i serum hos pasienter og kreft i bukspyttkjertelen vev med forskjellige metoder [10,11].
Vi har vist at anti-CEA-antistoff konjugert med fluoroforer bidratt til å forbedre diagnose av kreft og aktivert fluorescens -Guidede kirurgi (FGS) i bukspyttkjertelen og tykktarmskreft musemodeller som vesentlig forbedret resultat sammenlignet med standard lyse lys kirurgi [12-14]. Det har blitt rapportert at cathepsin og claduin-fire målrettet optisk avbildning bidratt til å oppdage kreft i bukspyttkjertelen og dens forløper i musemodeller [15,16].
I denne studien har vi bestemt om anti-MUC1 antistoff konjugert med en fluoroforen kunne målrette og visualisere kreft i bukspyttkjertelen in vitro og in vivo-modeller.
Materialer og metoder
bukspyttkjertelkreft cellelinjer
Den menneskelige bukspyttkjertelkreft cellelinjer BxPC-3 [ ,,,0],17] og Panc-1 [18] ble opprettholdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT), penicillin /streptomycin (Gibco-BRL, Carlsbad, CA), natriumpyruvat (Gibco-BRL) , natriumbikarbonat (Cellgro, Manassas, VA), L-glutamin (Gibco-BRL), og minimale essensielle medium ikke-essensielle aminosyrer (Gibco-BRL). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator.
Bygging av GFP-uttrykke bukspyttkjertelkreft cellelinje
Byggingen av grønt fluorescerende protein (GFP) som uttrykker Panc-1-cellelinjen ble utført som tidligere beskrevet [19]. For GFP-genet transduksjon, 20% konfluente Panc1 celler [18] ble inkubert med en 1: 1-utfelt blanding av retrovirale supernatantene til de PT67 emballasje celler og RPMI 1640 (Gibco-BRL, Life Technologies, Inc.) i 72 timer. Cellene ble høstet ved trypsin /EDTA 72 timer etter inkubering med GFP-retrovirale supernatanter og subdyrket i et forhold på 01:15 i selektivt medium som inneholdt 200 ug /ml G418. Nivået av G418 ble øket til 800 ug /ml trinnvis. Kloner som uttrykker GFP ble isolert med kloning sylindere (Bel-Art produkter, Pequannock, NJ) ved trypsin /EDTA og ble forsterket og overført ved konvensjonelle dyrkingsmetoder. Høy GFP-ekspresjon kloner ble deretter isolert i fravær av G418 for 10 passasjer å velge for stabilt uttrykk av GFP [20-22].
Mus
atymiske
nu /nu
hårløse mus (Anticancer Inc., San Diego, CA) , 4-6 uker gamle, ble anvendt i denne studien. Mus ble oppbevart i en barriere anlegg under HEPA filtrering. Mus ble matet med en Autoclaved laboratorium gnagerdiett. Alle mus kirurgiske prosedyrer og avbildning ble utført med dyrene bedøvet ved intramuskulær injeksjon av ketamin 50%, 38% xylazin, og 12% acepromazin maleat (0,02 ml). Dyr mottok buprenorfin (0,10 mg /kg ip) umiddelbart før operasjonen og en gang om dagen i løpet av de neste 3 dager for å lindre smerte. Den maksimale tumorstørrelse var mindre enn 2 cm. Tilstanden av dyrene ble overvåket hver dag. Dyrene ble alle avlivet 2-3 uker etter operasjonen. CO2 innånding ble brukt til aktiv dødshjelp. For å sikre død etter CO2 kvelning, ble halshugging utført. Alle dyrestudier ble godkjent av Anticancer, Institutional Animal Care Inc. og bruk Committee (IACUC) i henhold til de prinsipper og prosedyrer som er skissert i National Institute of Health Guide for omsorg og bruk av dyr i henhold Assurance Antall A3873-1.
antistoff-dye konjugering
Hamster monoklonale antistoffer mot MUC1 (CT2, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) ble konjugert med DyLight 650 eller 550 fargestoffer (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA ) i henhold til produsentens spesifikasjoner, noe som sikrer et minimum av minst 4: 1 fargestoff: protein-forhold. Protein: dye konsentrasjoner ble bekreftet ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) [23]
Western blotting
Cellelysater ble hentet i lysis buffer som inneholder 70 mM β-glycerophosphate. , 0,6 mM natriumortovanadat, 2 mM MgCl
2, 1 mM etylenglykol-tetraeddiksyre, 1 mM DTT (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), 0,5% Triton-X100, 0,2 mM fenylmetylsulfonylfluorid, og 1% protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Lysater ble separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) og overført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Membranene ble blokkert i 5% (vekt /volum) fettfri tørrmelk og probet med antistoffer. Anti-MUC1 (CT2) ble anvendt. De immunreaktive proteiner ble visualisert ved hjelp av SuperSignal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).
flowcytometrisk analyse
Celler ble dyrket til 80% samløpet, behandlet med accutase løsning (Sigma) i 5 minutter, vasket to ganger med fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) buffer (2% FBS, 0,1% natriumazid i PBS). -Celler (1 x 10
6) ble resuspendert i FACS-buffer. Celler ble fiksert med 2% paraformaldehyd og deretter blokkert med 2% BSA-PBS-oppløsning i 30 minutter ved romtemperatur. Celler ble inkubert med anti-MUC1 (CT2, 2 ug /prøve) i 40 minutter ved romtemperatur, og deretter med geite-anti-armensk hamster-IgG-FITC (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) i 40 minutter ved romtemperatur . Etter vasking med FACS-buffer, ble cellene resuspendert i FACS-buffer og underkastet flowcytometri ved anvendelse av en FACS Aria (BD Immunocytometry Systems, Franklin Lakes, NJ). Side scatter og termin scatter profiler ble brukt til å fjerne celle dubletter.
Immunocytochemistry av levende celler
Panc-1 celler (2 x 10
5) ble dyrket over natten. Anti-MUC1 (CT2) antistoff konjugert med DyLight 550 fargestoffer ble fortynnet til 4 ug /ml i PBS (Corning Cellgro, Manassas, VA). Kulturmediet fra cellene ble aspirert, og den fortynnede antistoff ble tilsatt til de levende celler. Celler ble inkubert med antistoff i 1 time ved romtemperatur. Cellene ble vasket forsiktig 2 ganger med fosfat-bufret saltløsning etter at antistoffet ble aspirert. Cellene ble observert under en FV1000 confocal mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) med hvitt lys og 559 nm laser [24].
Immunohistochemistry
For fluorescens farging på lysbilder laget av frossen svulstvev , anti-MUC1 (CT2) konjugert med DyLight 650 ble anvendt. Glassene ble inkubert med 10% normalt esel serum i en time ved romtemperatur, og inkuberes med det konjugerte antistoffet ved romtemperatur i en time ved en fortynning på 1: 100. Vev ble tørket og observert med en IV-100 scanning laser mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) med 633 nm laser [25]. Alternative lysbilder fra samme frossen svulstvev ble farget med hematoksylin og eosin og observert under lett mikroskop.
Skin klaff modell
Nude mus ble bedøvet med ketamin blanding via subkutan injeksjon. En bue-formet snitt ble gjort i magehuden. Den subkutane bindevev ble skilt for å frigjøre huden klaff uten å skade arterien og venen. Huden klaff ble spredt og fast på flat stand. Panc-1-GFP (1 X 10
6-celler) i 30 pl av matrigel ble drysset på den indre overflate av huden klaff, og huden ble lukket [26].
Subkutan og ortotopisk tumor musemodell
for å gjøre subkutant transplantert bukspyttkjertelen tumormodeller, Panc-1 og BxPC-3 menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler (2 × 10
6) ble injisert subkutant i flankene av nakne mus. Når de subkutane svulstene ble mellom 10 og 20 mm i diameter, ble de høstet og fragmentert i små fragmenter. De tumorfragmenter ble implantert orthotopically i nakne mus, som beskrevet tidligere [19,27-29].
Hele kroppen avbildning
I begge subkutan og ortotopiske tumormodeller, ble musene injisert med antistoff konjugert med fluorofor, i halevenen, og deretter hele kroppen avbildning ble utført ved anvendelse av OV100 Small Animal Imaging System (Olympus, Tokyo, Japan) etter anestesi med ketamin blanding som er beskrevet ovenfor [30]. Den optimale dosen for dyrestudier ble avgjort av dosen av konjugert antistoff som produseres bilder med den beste svulsten til bakgrunnsforhold i subkutan tumormodell.
Bildeanalyse
Alle bildene ble analysert ved hjelp av bilde- J (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) før prosessen med bilder og sammenlignet. Bilde prosessen ble gjort med Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc., San Jose, California).
Resultater
Uttrykk av MUC1 i bukspyttkjertelen kreftcellelinjer
Både kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer som ble testet (BxPC-3 og Panc-1) hadde MUC1 ekspresjon observert ved Western blotting (figur 1A). Andelen av MUC1-positive celler var 36,9% i BxPC3 og 24,4% i Panc1 bukspyttkjertelkreft cellelinjer, som observert med flowcytometri (figur 1B). Den samme testen ble gjentatt i hver cellelinje minst tre ganger. Resultatene fra alle forsøkene viste at anti-MUC1 (CT2) antistoff kunne oppdage MUC1 på cellemembranen av bukspyttkjertelcancerceller in vitro.
(A) Western blot-analyse viser MUC1 ekspresjon i bukspyttkjertelcancercellelinjer (BxPC -3 og Panc-1). (B) Strømningscytometrisk analyse viser ekspresjon av MUC1 på overflaten av BxPC-3 og Panc-1-cellelinjer. (C) Immunocytochemistry på levende celler viser flere fluoriserende punkter på overflaten av Panc-1 celler. Representative fluorescens bilder slått sammen med tilsvarende DIC (differensial interferens kontrast) bilder (x60 vann nedsenking objektiv på FV1000, med 559 nm laser).
Immunocytochemistry ble også utført med anti-MUC1 (CT2) antistoff konjugert med flourophores. Etter inkubasjon med det konjugerte antistoffet uten gjennomtrengning, ble flere fluorescerende punkter bemerkes på overflaten av Panc-1-celler under et fluorescens mikroskop (figur 1C). Sammenslåing med tilsvar differensial interferens kontrast mikroskopi bekreftet at fluophore antistoff reagerte med MUC1 på overflaten av kreft i bukspyttkjertelen celler og produsert fluorescens.
Målretting av subkutane pankreastumorer med fluorescerende MUC1
Når BxPC-3 eller Panc-1 subkutane svulstene hadde nådd ca. 10-20 mm i diameter, ble dyrene hver gitt en enkelt 30 mikrogram dose av DyLight 650-konjugert anti-MUC1 (CT2) via halevenen. Musene ble fotografert under både lysfelt og fluorescens belysning ved hjelp av Olympus OV100 Small Animal Imaging System. Både Panc-1 (figur 2A) og BxPC-3 (data ikke vist) tumor viste sterkere fluorescens. Fluorescens farging ble utført på frosne tumorprøver fremstilt fra BxPC-3 og viste fluorescens på cellemembraner som viser ekspresjonen av MUC1 (figur 2B).
(A) Musen er avbildet under både hvitt lys og fluorescens-belysning. Intensiteten av det røde fluorescens-signalet fra Panc1 subkutan tumor er sterkere enn bakgrunnen. (B) Hematoxylin og eosin farging (x200, venstre). Fluorescens farging for MUC1 (x20 vanlig objektiv, høyre) av frosne tumorprøver viser fluorescens signaler på membran av kreftceller.
Målretting av kreft i bukspyttkjertelen celler i huden klaffer med fluorescerende MUC1
Mus med kreft i bukspyttkjertelen celler som vokser i hudlapper ble injisert med anti-MUC1 (CT2) konjugert med DyLight 550 fargestoffer inn i halevenen. Førti-åtte timer etter antistoff-injeksjonen, ble huden klaff spre seg igjen. Imaging ble utført med OV100 og FV1000. Flere kolonier av kreftceller ble observert på overflaten av huden klaff med OV100. GFP fluorescens-signaler fra individuelle kreftceller ble observert med FV1000. På utsiden margin på kolonien og mellomrommet mellom kreftceller inne i kolonien, 550 nm fluorescens signaler, som stammer fra fluoroforen-konjugert antistoff, ble observert. (Fig 3) Resultatene viste at antistoff reagerte med MUC1 på membranen av kreftceller in vivo.
Representative bildene ble tatt under hvitt lys, og 473 nm og 559 nm lasere på OV100, og fusjonert . ble observert GFP signal fra de enkelte kreftceller og røde fluorescerende signal fra DyLight 550 fluoroforen-konjugert anti-MUC1 antistoff på utsiden margin på kolonien og mellomrommet mellom kreftceller.
målretting av bukspyttkjertel svulster i ortotopiske modeller med fluorescerende MUC1
Mus med svulster implantert orthotopically inn muse bukspyttkjertelen ble injisert med DyLight 650-konjugert anti-MUC1 (CT2) antistoff med en enkelt 30 mikrogram dose via nålevenen 7-10 dager etter svulst implantasjon. Imaging ble utført etter åpning magen av mus. Intra avbildning med OV100 detektert fluorescens signalet som kommer fra Panc1 og BxPC3 tumorer (fig 4). Svulster mindre enn 5 mm kan påvises med fluorescensavbildning (figur 4). De gjennomsnittlige prosenter av fluorescens intensitet mellom svulsten og bakgrunn i Panc-1 og BxPC-3 ortotopiske svulster var 6,70 og 2,39 kroner. Disse resultatene bekreftet at i ortotopiske tumormodeller, MUC1 målrettet kreft i bukspyttkjertelen og aktivert svulst deteksjon. Annet enn svulsten, ble fluorescens-signaler detektert fra huden og, blære og tarminnhold, men med lavere intensitet.
Fluorescens signaler fra pankreastumorer orthotopically transplantert på halen i bukspyttkjertelen ble detektert. Annet enn tumoren, ble fluorescens signal som detekteres fra huden og, blære og tarminnhold, men med lavere intensitet enn tumoren. Hvite piler indikerer bukspyttkjertel svulst.
Diskusjoner
MUC1 er en svært attraktiv bildebehandling biomarkør for kreft i bukspyttkjertelen siden det er overuttrykt i ca 90% av kreft i bukspyttkjertelen pasienter [5,6]. De foreliggende resultatene fra subkutane og ortotopiske tumormodeller viser at MUC1 kan målrette og visualbukspyttkjertelkreft ved å gjøre det fluorescerende. Resultatene av denne studien viser at MUC1 er et ytterligere mål for kreft i bukspyttkjertelen merking og terapeutika levering. MUC1 kan være et nyttig mål å identifisere og behandle fjernmetastaser av alle krefttyper som uttrykker antigen ved hjelp av merket eller terapeutiske førende antistoffer.
BxPC-3 og Panc-1 ble valgt basert på tidligere studier med disse cellelinjer for fluorescens styrt kirurgi (FGS) [13,14]. Det er mulig at den fraksjon av positive celler i tumoren er mindre enn det som sees ved flowcytometri på grunn av sterisk hindring til antistoff inntreden i tumoren. Det er også mulig at tilstedeværelsen av stromale celler i tumoren kan redusere prosentandelen av positive celler.
CT2 antistoff som gjenkjenner både levende cancerceller, så vel som celler i tumoren i mus som er lett visualisert ved konjugering av antistoffet til en fluorofor. Det er mulig at i den levende celle, tilstrekkelige deler av den cytoplasmiske hale bli tilgjengelig til antistoffet. Som nylig vist av Kumar et al, er mer forskning er nødvendig for å forstå strukturen og subcellulære lokalisering av MUC1 protein [31].
Det har vært forsøk på å bruke MUC1 som behandling mål. MUC1 målrettet bildebehandling kan veilede therapeutics til svulsten [11,32,33]. Imaging for MUC1 kan vise om terapeutiske mål er til stede i kreftceller og forutsi behandlingsrespons av MUC1-rettet behandling [5]. I tillegg kan fluorescens bildebehandling rettet mot MUC1 i bukspyttkjertelkreft forbedre svulst visualisering for å oppnå fullstendig reseksjon under operasjonen. Fluorescent styrt kirurgi (FGS) har vist seg å bedre overlevelse i musemodeller med kreft i bukspyttkjertelen [13,14].
I denne studien ønsket vi å studere MUC1 målretting av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen med neste mål om studere MUC1 målretting i vår bukspyttkjertelkreft orthotopic xenograft (PDOX) modeller [12]. Påfølgende fremtidige studier vil være på MUC1 målretting i spontane PDAC musemodeller. Formell bio-distribusjons studier vil bli gjort i fremtidige eksperimenter. Den foreliggende undersøkelse viser MUC1 kan anvendes for selektiv tumor targeting in vivo. Basert på evnen av fluorescerende MUC1 antistoff rettet mot å belyse disse svulstene, kan vi nå sammenligne FGS i fremtidige studier med merket anti-CEA og anti-MUC1.
