Abstract
kreft stamceller (cscs) er definert som en liten bestand av kreft celler med egenskapene til høy selvfornyelse, differensiering, og tumor-initiering funksjoner. Nyere studier har vist at aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1) er en markør for cscs hos voksne kreftformer. Selv cscs har blitt identifisert i noen forskjellige typer pediatriske solide tumorer, har det ikke vært noen studier om effekten av ALDH1 som en markør for cscs. Derfor, for å klargjøre hvorvidt ALDH1 kan brukes som en markør for cscs av pediatriske sarkom, undersøkte vi som kjennetegner en populasjon av celler med en høy ALDH1 aktivitet (ALDH1
høy-celler) i rhabdomyosarkom (RMS), den mest felles bløtvevssarkom hos barn. Vi brukte de humane embryonale RMS (erms) cellelinjer RD og kym-1, og sorterte celler i to subpopulasjoner av ALDH1
høy-celler og celler med en lav ALDH1 aktivitet (ALDH1
lave celler). Derfor fant vi at ALDH1
høye celler omfattet 3,9% og 8,2% av den totale cellepopulasjon, henholdsvis, og viste en høyere kapasitet for selvfornyelse og tumordannelse enn ALDH1
lave celler. Med hensyn til chemoresistance, ble overlevelsesraten til de ALDH1
høy-celler funnet å være høyere enn den for ALDH1
lave celler etter behandling med kjemoterapeutiske midler for RMS. Videre ALDH1
høy-celler utviste en større grad av pluripotency og genekspresjon av Sox2, som er en av de stamcelle markører. Tatt sammen, ALDH1
høye celler besatt kjennetegn cscs, inkludert koloni formasjon, chemoresistance, differensiering og startfasen evner. Disse resultatene tyder på at ALDH1 er et potensielt nyttig markør for cscs i erms
Citation. Nakahata K, Uehara S, Nishikawa S, Kawatsu M, Zenitani M, Oue T, et al. (2015) aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1) er en potensiell markør for kreftstamceller i Embryonalt rabdomyosakrom. PLoS ONE 10 (4): e0125454. doi: 10,1371 /journal.pone.0125454
Academic Editor: David M. Loeb, Johns Hopkins University, USA
mottatt: 26 september 2014; Godkjent: 21 mars 2015; Publisert: 27 april 2015
Copyright: © 2015 Nakahata et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansielt støttet av JSP KAKENHI Grant Number 23592630 (SU) og 25861668 (KN). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft stilk-lignende celler (cscs) er definert som en liten bestand av kreft celler med egenskapene til høy tumor-initiering, selvfornyelse og differensiering funksjoner [1]. I tillegg cscs er resistente til standardbehandling, slik som kjemoterapi og radioterapi, og således er ansvarlig for tumor tilbakefall etter behandling samt invasjon og metastase [2, 3].
rhabdomyosarkom (RMS) er den mest vanlige bløtvevssarkom hos barn. Til tross for betydelige forbedringer i overlevelse i løpet av de siste tiårene, mer enn en tredjedel av RMS pasientene fortsetter å dø av sykdommen [4]. Pasienter med metastatisk eller ildfaste svulster viser en spesielt alvorlig prognose [5]. Forsterke tradisjonelle regimer har ikke vesentlig forbedret overlevelse, og forskning for cscs av RMS er svært viktig for å bedre prognosen, som disse cellene er ment å fremkalle tilbakefall og metastasering. Selv om CD133 (prominin-1) er rapportert å være en markør for cscs [6], er det også finnes på normale stamceller, og det er nødvendig å identifisere andre markører for RMS.
Nylige studier har vist at aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1) er en markør for cscs hos voksne kreft [7, 8, 9]. Selv cscs har blitt identifisert i mange forskjellige typer pediatriske solide tumorer [10, 11], er det i dag ingen studier om effekten av ALDH1 som en markør for cscs innen pediatrisk onkologi.
I denne studien , hypotese vi at en undergruppe av celler med høy ALDH1 aktivitet (ALDH1
høye celler) vil vise egenskapene til cscs i RMS og deretter undersøkt hva som kjennetegner ALDH1
høye celler i embryonale RMS (Erms). Vi analyserte embryonale RMS cellelinjer ved hjelp av en ALDEFLUOR analyse og fant at ALDH1
høye celler hadde kjennetegn cscs, inkludert koloni formasjon, chemoresistance og startfasen evner, og vurderes mRNA uttrykk for ALDH1 isoformer, onkogen og stemness genet.
Materialer og metoder
Cell linje og cellekultur
Den menneskelige embryo rhabdomyosarkom cellelinje, RD og KYM-en ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA, USA) og JCRB (Ibaraki, Japan), henholdsvis. Cellene ble holdt i RPMI-1640-medium (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) supplementert med 1% penicillin /streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS) og dyrket i en fuktet 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C.
ALDEFLUOR analysen
aldehyd dehydrogenase (ALDH) aktivitet ble oppdaget ved hjelp av en ALDEFLUOR analysesett (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada) i henhold til produsentens protokoll. I korthet ble cellene farget med BODIPY-aminoacetaldehyd (BAAA) og inkubert i 40 minutter ved 37 ° C. En spesifikk inhibitor av ALDH1, diemethylamino-benzaldehyd (DEAB), ble brukt til å kontrollere for bakgrunnsfluorescens. De fargede celler ble analysert ved hjelp av FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og sortert i den ALDH1
høye celler, som ble oppdaget på den grønne fluorescens kanal (515-545 nm), og en undergruppe av celler med en lav ALDH1 aktivitet (ALDH1
lave celler). Dataene ble analysert ved hjelp av FACS DIVA program (BD Biosciences). For å utelukke ikke-levedyktige celler, ble 7-AAD (BD Biosciences) tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,25 ug /ml.
kolonidannelse assay
De sorterte celler ble suspendert i 10 mL RPMI-1640 og 10% FBS, og 1 x 10
4 celler ble sådd ut i kulturskåler med 3 ml av metylcellulose-inneholdende RPMI-1640 supplert med 10% FBS, i henhold til protokollen til Rahadiani et al. [8]. Cellene ble farget med krystallfiolett (0,05% vekt /volum), for å visualisere koloniene, og antallet kolonier ble tellet etter to måneder.
Celleviabilitet assay
For å vurdere cellelevedyktighet de sorterte cellene ble sådd ut i 5 x 10
3 celler per 96-brønners plater (Corning, Corning, NY, USA) i en dag og deretter inkubert med forskjellige konsentrasjoner av vinkristin, cyklofosfamid og etoposid (Wako, Osaka, Japan ) i tre dager. Deretter ble graden av cellen levedyktighet undersøkt ved hjelp av Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens protokoll.
adipocyttdifferensiering analysen
For adipocyttdifferensiering analysen, de sorterte celler ble sådd ut i en tetthet på 1 x 10
4 celler pr 6-brønners plate (Corning, Corning, NY, USA) med 0,1% DMSO i tre dager. Etter åtte dager i RPMI inneholdende 1 pg /ml insulin, 0,5 mM 3-isobutyl-1-metylxantin, 10 mM deksametason, 1% penicillin /streptomycin og 10% FCS, ble nøytral lipidakkumulering påvist i cellene fiksert i 10% formaldehyd fikserte celler ved hjelp Oil Red O (Wako, Osaka, Japan) i henhold til protokollen av Hwang et al. [12].
Neurogenesis assay og immunfluorescens
I nevrogenesen analysen, de sorterte cellene ble sådd ut i en tetthet på 1 x 10
4 celler pr 6-brønners plate og behandlet med 100 nM ATRA (all-trans retinsyre, Wako, Osaka, Japan). Etter tre uker ble cellene farget med NCAM (1/200) (123C3, monoklonalt, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) via immunfluorescens ifølge protokollen til Walter et al. [6], og kjernene ble motfarget med DAPI (Dojindo).
For immunfluorescens farging ble de sorterte cellene fiksert i 4% PFA og blokkert i medium inneholdende 3% BSA og 0,1% TritonX-100 (Nacalai tesque, Kyoto, Japan). De sorterte cellene ble farget natten ved 4 ° C, og Alexa Fluor 488 geit anti-mus IgG (1/1000) (A11001, Life Technologies) antistoffer ble brukt som sekundære antistoffer. Alle flekker Resultatene ble analysert med den BZ-9000 enhet (KEYENCE, Osaka, Japan).
Xenotransplantat transplantasjon
De sorterte celler ble oppsamlet og resuspendert i en konsentrasjon på 10
2- 10
4 celler per 100 mL av RPMI-1640 og deretter blandet med 100 ul Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Celle-Matrigel Blandingen ble deretter injisert subkutant plass i 4 uker gamle non-obese diabetic /alvorlig kombinert immun-mangel (NOD /SCID) mus (NOD. CB17-Prdkc
SCID /J, Charles River Laboratory , Yokohama, Japan) under narkose. Tumorvekst ble overvåket annenhver dag og sjekket om svulstene ble dannet for to måneder
Forsøkene ble gjennomgått og godkjent av forsøk med dyr komité Osaka University. (Tillatelse Nummer: 23-080-004), og gjennomført i samsvar med institusjonelle retningslinjer. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse.
Immunohistochemistry
xenografttumorer av mus og de kliniske prøver ble dyppet i parafin, fast og analysert for hematoxylin, Myogenin (1/200) (5FD , polyklonale, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), desmin (1/200) (H-76, polyklonale, Santa Cruz Biotechnology) og ALDH1 (1/200) (44 /ALDH, monoklonalt, BD Biosciences) farging hjelp immunhistokjemi (IHC). Som et sekundært antistoff, ble pepperrot-peroksydase (HRP) -merket kanin-anti-muse-antistoffer (Dako, Glostrup, Danmark) anvendt. Resultatene av flekker ble visualisert med Envision + enkelt Reagens-Kit (Dako).
kvantitativ real-time PCR-analyse
kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av AB7900HT enhet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) for å bestemme den relative uttrykk for ALDH1 gener (ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L1 og ALDH1L2), ABC transporter gener (ABCG2 /BCRP, ABCB1 /MDR1 og ABCA2), onkogen (c-myc ) og stemness markør (Sox2).
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp NucleoSpin RNA (MACHEREY-NAGEL, Düren, Tyskland). Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av PrimeScript RT Master Mix (Takara, Shiga, Japan) i henhold til produsentens protokoll.
Real-Time PCR reaksjoner ble utført i tre paralleller ved hjelp av Platinum SYBR Grønn Super Mix med ROX (Livet Technologies) på AB7900HT. Husholdningsgenet, glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), tjente som en intern kontroll, slik det er uttrykt stabilt i forskjellige vev. Tabell 1 viser primere som brukes for real-time PCR. Uttrykket nivåer ble beregnet basert på 2
-ΔΔCT metode.
Statistical Analysis
De statistiske analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism6 programvarepakken (GraphPad Software, La Jolla , CA, USA).
P
verdier av 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant i henhold til Fishers eksakte test for xenograft transplantasjon og studentens
t
-test for de andre eksperimentene
Resultater.
Deteksjon og kjennetegn ALDH1
høye celler som cscs i RD og Kym-1 celler
Vi først forsøkt å identifisere ALDH
høye celler i RD og Kym-1 celler ved hjelp av en ALDEFLUOR analyse. I RD celler, forholdet mellom ALDH1
høy-celler farget med BAAA var 4,1%, mens den for de som er farget med BAAA og DEAB som en negativ kontroll ble 0,2%. Derfor er ekte forholdet mellom ALDH1
høye celler var 3,9% av alle dyrkede RD celler (fig 1A). Tilsvarende er forholdet mellom ALDH1
høy-celler var 8,2% i KYM-1-celler (figur 1B)
RD (A) og KYM-1 (B) celler ble farget med DEAB (kontroll.: venstre panel) eller uten DEAB (høyre panel) etter å ha blitt farget med BAAA og deretter analysert ved hjelp av FACS Aria II med ALUDEFLUOR analysen kit. Andelen ALDH1
høye celler var 3,9 ± 0,26% i RD celler og 8,2 ± 0,14% i KYM-1 celler. Gjennomsnitt ± SD ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. All ALDH1
høye celler og en undergruppe av ALDH1
lave celler ble sortert som vist på høyre panel av figur 1A og 1B.
Deretter utførte vi en koloni formasjon analyse for å dokumentere selvfornyelse kapasitet ALDH1
høye celler og ALDH1
lave celler. Følgelig er antallet kolonier av ALDH1
høy-celler var høyere enn for ALDH1
lave celler (30,3 vs. 14,5 kolonier /brønn, henholdsvis, s 0,05) (Fig 2A og 2B). De ALDH1
høye celler, derfor hadde en større koloni formasjon evne enn ALDH1
lave celler.
A, Colony formasjon analysen. Antallet kolonier som var makroskopisk synlige, avledet fra ALDH1
høy og ALDH1
lave celler av RD celler ble talt opp og scoret på to måneder etter planting. Gjennomsnittlig ± SD ble beregnet ut fra tre uavhengige forsøk (ni brønner for ALDH1
høye eller ALDH1
lave celler i totalt). De ALDH1
høye celler dannet betydelig flere kolonier enn ALDH1
lave celler. B, er Representative bilder av kolonier som vises i det venstre panelet (ALDH1
høy) og panel høyre (ALDH1
lav).
Med hensyn til chemoresistance, vi undersøkte overlevelse på de ALDH1
høye celler i RD celler og KYM-1 celler dyrket med vinkristin, cyklofosfamid og etoposid bruker Cell Counting Kit-8 (WST-åtte assay). Den levedyktighet av ALDH1
høye celler etter dyrkning med vinkristin, cyklofosfamid og etoposid var betydelig høyere enn for ALDH1
lave celler behandlet med disse kjemoterapeutika, noe som tyder på at ALDH1
høye celler besatt høyere kapasitet for chemoresistance enn ALDH1
lave celler (figur 3).
ALDH1
høye og ALDH1
lave celler av RD (A) og KYM-1 celler (B) ble behandlet med 100 nM-10 uM vinkristin, 5 mM-15 mM cyklofosfamid og 10 uM 100 uM-etoposid og cellelevedyktigheten ble målt etter 72 timer ved bruk av en WST-8-analyse. Levedyktigheten av «ingen behandling»-celler ble også målt som en kontroll. Gjennomsnitt ± SD ble beregnet fra triplikatbrønner av et representativt eksperiment, og dataene for tre uavhengige eksperimenter er vist i figuren. Den levedyktighet av ALDH1
høye cellene var betydelig høyere enn for de ALDH1
lave celler.
Som cscs er dokumentert å stille pluripotency, vi analyserte differensiering evne ALDH1
høye celler til adipocytter og nerveceller i RD cellene. De ALDH1
høye celler ble funnet å være rikere med lipid dråper farget med Oil Red O enn ALDH1
lave celler (figur 4A), og positive stainings ble observert for NCAM i ALDH1
høye celler, en indikasjon av neuronal differensiering (figur 4B). Disse resultatene indikerer at de ALDH1
høye celler av RD-celler har evnen til å differensiere til adipocytter og nevronale celler, noe som indikerer potensiell pluripotency.
A, adipocyttdifferensiering analysen. De ALDH1
høye og ALDH1
lave celler av RD-celler ble dyrket i en adipocyte differensiering medium. Analysen ble gjentatt tre ganger, og representative bilder av Oil Red O flekker vises i det venstre panelet (ALDH1
høy) og i panelet til høyre (ALDH1
lav) (× 40). Lipid dråper av adipocytter farget rød med Oil Red O. B, neuronal celledifferensiering analysen. De ALDH1
høye og ALDH1
lave celler av RD celler ble behandlet med 100 nM retinsyre og farget for NCAM (grønn). Kjernene ble kontra med DAPI (blå). Analysen ble gjentatt tre ganger, og representative bilder av immunfluorescens farging vises i det venstre panelet (ALDH1
høy) og i panelet til høyre (ALDH1
lav).
Svulsten -initiating evne ALDH1
høye celler i RD-celler ble undersøkt ved å injisere 1 x 10
2, 1 x 10
3 og 1 × 10
4 ALDH1
høye celler i NOD /SCID-mus; ALDH1
lave celler ble også injisert på samme måte. Følgelig ble tumordannelse observert i to av de syv mus injisert med 1 x 10
3 ALDH1
høye celler og fem av de seks mus injisert med 1 × 10
4 ALDH1
høye celler, mens det er ingen tumorer ble funnet i mus injisert med ALDH1
lave celler i hver celletetthet (p 0,05, tabell 2 og figur 5A). Disse resultatene viser at de ALDH1
høye celler har en betydelig høyere tumor-initiering evne enn de ALDH1
høye celler.
A, representant bilde av en svulst bærende NOD-SCID mus. (Høyre: ALDH1
høye celler, venstre: ALDH1
lave celler). B-D, Immunhistokjemisk (IHC) farging av de xenograft tumorsnitt. Seksjonene ble farget for hematoksylin, myogeniske markører (desmin (B), Myogenin (C)) og ALDH1 (D). Tumorceller var positive for desmin og Myogenin mens bare noen få celler var positive for ALDH1, noe som tyder på at ALDH1
høye celler fremmet rabdomyosakrom og ble rekonstituert å innlemme hele spekteret av heterogenitet.
ALDH1
høye celler viste en høyere tumor-initiering evne enn de ALDH1
høye celler. Dataene fra to uavhengige forsøk er oppsummert.
Neste, vi utført immunhistokjemisk (IHC) farging av xenograft tumor delene av ALDH1
høye celler. Disse cellene ble farget positivt for myogeniske markører (desmin, Myogenin) og ALDH1 (figur 5B-5D). Tumorcellene var positive for desmin og Myogenin, mens bare noen få celler som var positive for ALDH1, noe som tyder på at den ALDH1
høye celler fremmes rhabdomyosarkom og ble rekonstituert for å innlemme den fulle heterogenitet.
Tatt sammen, vi konkluderte med at ALDH1
høy celler er beriket med cscs av RD og KYM-1 celler.
de mRNA nivåer av ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L2, ABCB1, ABCG2 og Sox2 ble oppregulert i ALDH1
høy celler av RD celler
Videre har vi undersøkt uttrykket nivåer av flere medlemmer av ALDH1 familien (ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L1 og ALDH1L2) i RD celler. Som et resultat ble uttrykket nivåer av ALDH1A3, ALDH1B1 og ALDH1L2, men ikke ALDH1A1, i ALDH1
høye celler økt i forhold til det som ble observert i ALDH1
lave celler (figur 6a).
En kvantitativ real-time PCR-analyse ble utført for å evaluere uttrykket nivåer av ALDH1 (A), stemness markører (B) og ABC transportører (C). Gjennomsnitt ± SE ble beregnet fra triplikatbrønner av et representativt eksperiment, og dataene for ett av tre uavhengige eksperimenter er vist i figuren. Uttrykket av ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH1L2, Sox2 og ABC-tilhengere var betydelig høyere i de ALDH1
høye celler enn i de ALDH1
lave celler (p 0,01).
Neste, vi undersøkt om ALDH1
høye cellene er beriket for uttrykket av gener tenkt å spille viktige roller i stemness, for eksempel c-myc og Sox2. Kvantitativ real-time PCR viste en økt uttrykk for Sox2 i ALDH1
høye celler i forhold til ALDH1
lave celler, mens ingen signifikant økning ble observert i uttrykket av c-myc (fig 6B).
De relative uttrykk nivåer av tre store legemiddeltransportører ABCG2 /BCRP, ABCB1 /MDR1 og ABCA2 ble også undersøkt. Interessant, ALDH1
høye celler viste en økt uttrykk for alle transportører, noe som tyder på at ALDH1
høye celler har en høyere capaciity for chemoresistance enn ALDH1
lave celler (figur 6C).
Diskusjoner
begrepet cscs har vært lenge foreslått [13]. Cscs er definert av to viktige egenskaper, forbedret tumordannelse og evnen til selvfornyelse /differensiering [14]. Derfor er den isolerte CSC populasjonen ikke bare gir opphav til de novo tumorer med høy effektivitet, men også sammenfatter svulsten med både CSC og ikke-CSC populasjoner. I tillegg har de fleste cscs vise motstand mot vanlige anti-kreft terapi ved hjelp av kjemoterapeutika og ioniserende stråling [2]. Hittil har cscs blitt identifisert i forskjellige maligniteter, inkludert akutt myeloid leukemi [15], hjernetumor [16], hepatocellulært karsinom [17], brystkreft [7], lungecancer [18], bukspyttkjertelkreft [19] og ovarie kreft [8].
ALDH enzymer utgjør en familie av enzymer som består av 19 isoformer lokalisert i cytoplasma, mitokondrier og kjerne. ALDHs er ansvarlig for å oksydere aldehyder til karboksylsyrer. Mens mange aldehyder spille en avgjørende rolle i fysiologiske prosesser, slik som syn, neurotransmission og embryoutvikling, de fleste aldehyder er cytotoksiske og må detoxified, som vurderes av Marchitti et al [20].
En allment akseptert metode for identifisering cscs er basert på å detektere den enzymatiske aktiviteten til ALDH1, en avgiftende enzym ansvarlig for oksidasjon av intracellulære aldehyder. Den høye aktivitet av ALDH1 i cscs har blitt brukt for å isolere cscs i forskjellige maligniteter [6, 7, 8, 16, 18, 21, 22]. Derfor ALDH1
høye cellene vise funksjoner som vanligvis finnes i cscs, inkludert selvfornyelse, differensiering og høye tumor-initiering evner.
Vi har bekreftet at ALDH1
høye cellene i RD og KYM- 1 celler har egenskaper av cscs, og i et annet eksperiment ved hjelp av RMS-YM celler, en Erms cellelinje, vi undersøkte ALDH aktivitet. I motsetning til det som er observert i RD og Kym-1 celler ble ingen ALDH1
høye celler oppdaget. Deretter som cscs har blitt dokumentert å ha evnen til å danne kuler, undersøkte vi sfæren dannende evne av disse cellene. Følgelig, RD og KYM-1-celler som dannes store kuler, mens RMS-YM-celler ikke dannet kuler i serumfritt medium (data ikke vist). Disse resultatene styrker vår hypotese om at ALDH1
høye celler har egenskaper av cscs.
Ifølge Lohberger et al. [23] og Awad et al. [24], ALDH1
høye celler er vanligvis isolert fra humane sarkom cellelinjer (fibrosarkom, liposarkom, synovial sarkom, chondrosarcoma, og Ewings sarkom). Deres studie viste at ALDH1
høye cellene er preget av en høy grad av spredning, kolonidannelse og uttrykk av ABC transporter gener og stemness markører (β-catenin, Sox2 og Nanog). I denne studien, ALDH1
høye celler utstilt koloni formasjon, samt en økt genekspresjon av ABC transportører (ABCB1, ABCG2 og ABCA2) og stemness markører (Sox2). Derfor våre data at ALDH1 er også en mulig markør for cscs i erms.
ALDEFLUOR assay ble utviklet for å påvise aktiviteten av ALDH1 isoformen ved vellykket isolering av levedyktige hematopoetiske stamceller fra humant navlestrengsblod [25 ] og har blitt rapportert å være spesifikk for ALDH1 isoform finnes i høy overflod i disse cellene, ALDH1A1 [26]. Imidlertid, mens andre individuelle ALDH isoformer ikke vise noen foretrukne substrat spesifisitet, er de også oppviser kryssreaktivitet, slik at det er sannsynlig at den ALDEFLUOR analysen skal detektere ALDH1 aktiviteten av flere ALDH isoformer uttrykt i celler [27]. I denne studien, uttrykk for ALDH1A3, ALDH1B1 og ALDH1L2 i ALDH1
høye celler ble økt, mens det av ALDH1A1, som er tenkt å spille en viktig funksjonell rolle i stamceller, ikke ble økt i ALDH1
høye celler. Marcato et al. [28] rapporterte at en øket ALDH-aktivitet i brystkreft stamceller er på grunn av virkningene av isoformen ALDH1A3, mens Chen et al. [29] rapporterte at ALDH1B1 er mer dypt uttrykt i adenokarsinomer enn ALDH1A1, selv om funksjonen og cellulær lokalisering av ALDH1L2 forbli ukjent. Siden våre data er i samsvar med disse funn kan cscs av RD-celler også ha lignende egenskaper som de i epiteliale kreftceller.
En foreslått mekanisme for den chemoresistance av cscs er basert på den forbedrede ekspresjon av ATP-bindende kassett (ABC) transportproteiner, som er ansvarlig for legemiddelutstrømningen [30]. En høy ekspresjon av ABC-transportører i stamceller sammenlignet med ikke-stamceller fører til relativ motstand av stamceller til de toksiske effektene av kjemoterapi narkotika. I denne studien analyserte vi uttrykket av tre legemiddeltransportører (ABCG2 /BCRP, ABCB1 /MDR1 og ABCA2) av ABC transportør familien og funnet at alle ABC transportører ble oppregulert i ALDH1
høye celler fra RD. I tillegg ALDH1
høy-celler viste økt motstand mot vinkristin, cyklofosfamid og etoposid, som vanligvis brukes som de kjemoterapeutiske legemidler av rhabdomyosarkom. Faktisk utførte vi den immunhistokjemi hjelp av eksemplarer av erms, resected før og etter kjemoterapi, og fant at prøvene resected etter kjemoterapi viste en større cytoplasma ALDH1 uttrykk enn de primære prøven (Fig 7A og 7B).
de biopsiprøve av erms innhentet før kjemoterapi (A) og resected prøver innhentet etter kjemoterapi (B) farget positivt for ALDH1 på immunhistokjemi. Disse prøvene ble tatt fra skjeden-stammer erms vev av en 1-år gammel jente. Prøvene resected etter kjemoterapi viste en større cytoplasma ALDH1 uttrykk enn de primære biopsiprøve.
Disse dataene tyder på at jo høyere uttrykk for ABC transportør observert i ALDH1
høye celler fører til chemoresistance. I tillegg er disse resultatene er lik side befolknings celler (SP celler), som uttrykker ulike ABC-tilhengere er ansvarlig for legemiddelresistens, inkludert ABCG2 (BRCP) [31]. Komuro et al. [32] rapporterte SP celler ble påvist i RD hjelp FACS med Hoechst fargestoff. Faktisk, ifølge Yasuda et al. [33], SP celler og ALDH1
høye celler lapper i eggstokkreft stamceller. Derfor kan bestander av SP celler og ALDH1
høye celler lapper i rabdomyosakrom også.
Dette er den første studien som dokumenterer at ALDH1 kan brukes som en markør for RMS. Vi har også brukt en alveolære RMS (armene) cellelinje (RH30) og undersøkte ALDH aktivitet. Selv ALDH1
høye cellene RH30 celler ble oppdaget, uventet de ALDH1
høye celler skjold ikke danner kolonier eller kuler (data ikke vist). En sannsynlig forklaring på dette fenomen er at de to store RMS undertyper oppstår fra forskjellige celler av opprinnelse, gitt de betydelige kliniske og biologiske forskjeller mellom dem, som tidligere rapportert av Pressey et al. [34]. Vi planlegger nå å undersøke om ALDH1 kan brukes som en markør i andre armene cellelinjer.
I de siste årene forsket på induserte pluripotente stamceller (iPSCs) har gjort rask fremgang og har blitt brukt til feltet av onkologi. Oshima et al. [35] rapporterte generasjon av indusert cscs (iCSCs) ved å innføre definerte faktorer (Oct3 /4, Sox2 og Klf4) inn menneskelige kolorektal kreft cellelinjer. Som et resultat ble uttrykket nivåer av ALDH1 økt de iCSCs. Derfor kan ALDH1 være relatert til CSC egenskaper og funksjon som et nyttig verktøy for forskning på cscs. Selv om teorien om kreftstamceller fortsatt kontroversielt [36], våre resultater støtter eksistensen av cscs i Erms, og vi tror at ALDH1 kan være nyttig for å oppdage cscs som et terapeutisk mål.
I konklusjonen, vi bekreftet at ALDH1
høye cellene erms har egenskaper av cscs, inkludert koloni formasjon, chemoresistance og startfasen evner. Disse resultatene tyder på at ALDH1 er et potensielt nyttig markør for cscs i Erms.
