Abstract
Bakgrunn
rammeskifte mutasjoner i mikro ustabilitet høy (MSI-High ) kolorektal kreft er en potensiell kilde til målrettbare neo-antigener. Mange tull transkripsjoner er gjenstand for rask nedbrytning på grunn av tull-mediert forfall (NMD), men tull utskrifter med et CMS i den siste ekson eller i nærheten av den siste ekson-exon krysset har iboende motstand mot tull-mediert forfall (NMD). NMD-resistente transkripsjoner er derfor en sannsynlig kilde uttrykte mutante proteiner i MSI-Høye svulster.
Metoder
Ved hjelp av antistoffer mot konservert N-termini av predikerte mutante proteiner, analyserte vi MSI-High kolorektal kreft cellelinjer for eksempler på naturlig uttrykte mutante proteiner som følge av rammeskifte mutasjoner i kodende mikro (CMS) ved immunpresipitering og Western Blot eksperimenter. Oppdages mutantprotein band fra NMD-resistente transkripsjoner ble ytterligere validert av gen-spesifikke kortinterfering RNA (siRNA) knockdown. Et genom-wide søk ble utført for å identifisere CMS-inneholder gener sannsynlig å generere NMD-resistente utskrifter som kan kode for antigen uttrykt mutante proteiner i MSI-Høye tykktarm kreft. Disse genene ble screenet for CMS mutasjoner i MSI-High tykktarm kreft cellelinjer.
Resultater
Mutant proteinbånd av forventet molekylvekt ble påvist i muterte MSI-Høye cellelinjer for NMD-resistente transkripsjoner (CREBBP, EP300, TTK), men ikke NMD-sensitive transkripsjoner (BAX, CASP5, MSH3). Uttrykk for mutant CREBBP og EP300 proteiner ble bekreftet av siRNA knockdown. Fem CMS bærende gener identifisert fra genom-wide søk og uten eksisterende mutasjon data (SFRS12IP1, MED8, ASXL1, FBXL3 og RGS12) ble funnet å være mutert i minst 5 av 11 (45%) av MSI-Høye cellelinjer testet.
Konklusjon
NMD-resistente transkripsjoner kan gi opphav til uttrykt mutante proteiner i MSI-High kolon kreftceller. Hvis ofte uttrykt i grunnskolen MSI-Høye tykktarm kreft, MSI-avledet mutante proteiner kan være nyttig som kreftspesifikke immunologiske mål i en vaksine rettet mot MSI-Høye colonic svulster
Citation. Williams DS, Bird MJ, Jorissen RN Yu YL, Walker F, Zhang HH, et al. (2010) Nonsense mediert motstandsdyktighet mot råte Mutasjoner er en kilde til Uttrykt Mutant Proteiner i tykktarmskreft cellelinjer med mikro Ustabilitet. PLoS ONE 5 (12): e16012. doi: 10,1371 /journal.pone.0016012
Redaktør: Ben C. B. Ko, Chinese University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 24 august 2010; Godkjent: 03.12.2010; Publisert: 31.12.2010
Copyright: © 2010 Williams et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble delvis finansiert av NHMRC Program Grant nummer 487922. Finansiering støtte for dette arbeidet ble også levert av en CASS (Bidra til Australian stipend Science) Foundation Science and Medicine Grant (DSW, AWB, ECN), Kreft Council Victoria (eN) og en Royal College of Patologer av Australasia Kitamura /Kanematsu Memorial Award og teknisk assistanse Grant (DSW). Dette arbeidet ble også støttet av midler fra operasjonelle infrastruktur Support Program levert av den viktorianske regjeringen, Australia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Om lag 15% av kolorektal, mage og livmorkreft har defekt DNA mismatch reparasjon og mikro ustabilitet høyt nivå (MSI-High) [1], [2]. Mest MSI-Høye svulster oppstå sporadisk hypermethylation av MLH1 genet promoter [3], men mutasjon av en DNA mismatch reparasjon enzymet er den underliggende feil i tilfeller av arvelig non-polypose tykktarmskreft (HNPCC) [4]. Svulster med MSI har en form for genetisk ustabilitet som manifesterer seg som rammeskifte mutasjoner i repetitive mikro sekvenser av DNA [1]. Rammeskifte mutasjoner i koding mikro (CMS) å endre den genetiske leserammen og i de fleste tilfeller koder for avkortede proteiner med unike C-terminal proteinsekvenser.
En spennende patologisk trekk ved MSI-Høye kolorektal kreft er en tendens til å ha økt antall tumor infiltrere lymfocytter (Tīlss) i forhold til MSI-Low og mikro stabil (MSS) svulster [5]. Den Tīlss i MSI-Høye svulster er aktivert CD8 + cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) [6], er egnet til å gjenkjenne intracellulære peptider som MSI-avledet neo-antigener, presentert av HLA klasse I molekyler. En MSI-High fenotype og økt Tīlss i en kolorektal kreft konnoterer en bedre scene-matchet prognose i forhold til MSI-Low eller MSS svulster [7], [8]. Dette overlevelse fordel kan gjenspeile en beskyttende fordel av immun infiltrat [9].
Syntetiske peptider tilsvarende mutante proteiner som forutsies å oppstå fra MSI-tilknyttede rammeskifte mutasjoner er blitt vist å være immunogene. I løpet av det siste tiåret, cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) responser har blitt beskrevet mot HLA-A2 peptider som følge av rammeskifte mutasjoner i A10 CMS av TGFBR2 [10], [11], A10 CMS av CASP5 [12], T10 CMS av OGT [13] og nylig T15 CMS av U79260 (FTO) [14]. CTL svar på mutante proteiner har blitt påvist hos pasienter med MSI forbundet tykktarm kreft og hos friske HNPCC-mutasjonsbærere, øke muligheten for beskyttende immunosurveillance i sistnevnte befolkningen [15].
Det er publisert mutasjon data tilgjengelig for minst 1522 mononukleotid koding mikro fra 460 gener i MSI-Høye kolorektal kreft [16]. En korrelasjon mellom CMS lengde og mutasjonsraten. Gener med CMS mutasjoner er potensielle kilder til målrettbare proteiner for immunterapi strategier. Siden rammeskifte mutasjoner påvirker CMS repetisjoner på en forutsigbar måte, de mutante proteiner som genereres vil trolig bli bevart i en populasjon av pasienter med MSI-Høye tykktarm kreft [17], [18]. Selv om ingen mutant transkripsjon er felles for alle MSI-Høye svulster, kan en vaksine som er rettet mot et sett med vanlige muterte proteiner være en effektiv behandling for MSI-Høye tykktarm kreft. Det er et behov for nye terapier mot MSI-Høye coloncancere, siden flere studier har vist at disse tumorene å være motstandsdyktig mot standard kjemoterapeutiske midler så som 5-fluoruracil [19], [20], [21].
eksistensen av MSI-avledede mutante proteiner som er blitt utledet ved immunologiske undersøkelser, men det er en mangel på publiserte data angående den direkte påvisning av de forutsagte MSI-avledede mutante proteiner. Western blot analyser har blitt publisert der potensielle mutante proteinbånd ble påvist for CREBBP, EP300 [22] og MBD4 gener [23], men det var ingen godkjenning av disse bandene. Bekrefte uttrykk for mutante proteiner i MSI-Høye svulster er viktig for at de skal være vellykket terapeutiske mål for en vaksine. Stabil ekspresjon av mutante proteiner som letter kryss presentasjon av tumorantigener av profesjonelle antigenpresenterende celler og stimulerer en T-hjelper reaksjon er sannsynlig å gi overlegen antitumorimmunitet [18]. Imidlertid er de fleste mutant transkripter som genereres av MSI målrettet for rask nedbrytning av nonsens-mediert nedbrytning (SD) [24], [25] og i fravær av inngrep, liten eller ingen målrettes mutante proteinet vil bli generert fra disse avvikende transkripter [24 ].
i denne studien har vi oppdaget tre MSI-avledet mutante proteiner, som alle oppstår fra NMD-resistente transkripsjoner. Etter et genom-wide søk etter flere NMD-resistente transkripsjoner, ble CMS-inneholder gener screenet for mutasjoner i et panel av 11 MSI-High tykktarm kreft cellelinjer. Gener ble utvalgt for mutasjon analyse på grunnlag av sannsynlige høy mutasjonsfrekvens (basert på cm lengde), sannsynligvis immunogenisitet (basert på mutant C-terminale aminosyre lengde) og sannsynlig ekspresjon i tykktarmskreft (basert på gen- og protein ekspresjonsdata hvor dette er tilgjengelig ). Vanligvis muterte NMD-resistente transkripsjoner ble vurdert for sannsynlig HLA-A * 0201 CTL-epitoper ved hjelp av
i silico
prediktiv programvare, SYFPEITHI [26], for sammenligning med MSI-avledet epitoper allerede vist seg å være immunogen
i vitro
.
Våre resultater bekrefter at NMD-resistente transkripsjoner gi opphav til uttrykte mutante proteiner og viser også at vanlig forekommende rammeskifte mutasjoner som skaper NMD-resistente transkripsjoner er en lovende kilde til målrettbare tumorantigener i MSI- høy tykktarm kreft. Et sett med ofte uttrykt mutante proteiner har potensial til å danne grunnlag for en flerverdig vaksine eller Immun målretting MSI-Høye svulster.
Resultater
MSI-High tykktarm kreft cellelinjer havnen rammeskifte mutasjoner i multippel CMS
Screening av tykktarmskreftcellelinjer for avvikende ekspresjon DNA mismatch repair proteiner viste en unormal fenotype i samsvar med MSI i 11 av 17 cellelinjer (tabell 1). Cellelinjene ble vurdert for rammeskifte mutasjoner i et utvalg av gener med CMS tidligere rapportert å utvikle mutasjoner i MSI-Høye tykktarm kreft. Mange mutasjoner i samsvar med en MSI-High fenotype ble påvist i hver cellelinje med avvikende DNA mismatch reparasjon uttrykk ved immunhistokjemi, men noen få mutasjoner hvis noen ble oppdaget i de resterende cellelinjer (tabell 2, Tabell S1). Sletting av en DNA-basepar var den vanligste mutasjonen, står for 82% (214/262) av mutasjonene observert i denne studien (synlige biallelic mutasjoner talt som 2 mutasjoner). De fleste rammeskifte mutasjoner koder for avkortede proteiner av lavere molekylvekt med en mutert C-terminal (tabell 3).
gjenkjennelige MSI-avledet mutante proteiner uttrykkes ved NMD-resistente transkripsjoner
for å oppdage uttrykte mutante proteiner, vi kjøpte antistoffer mot konservert N-terminale delen av utvalgte proteiner. Vi først studert et utvalg av vanlige muterte gener som er rapportert å være potensielle «målgener» [1]. Western blot eksperimenter på helcellelysater og immunopresipitatene av genotypede cellelinjene identifiserte proteinbånd svarende til den forventede molekylvekt for normal BAX (figur 1), MSH3 og CASP5 proteiner (upubliserte data) i cellelinjer med ikke-muterte alleler av disse genene . Imidlertid finnes det ikke noen mutante proteinbånd ble påvist for noen av disse gener. I tilfelle av BAX genererte vi polyklonale kanin-antistoffer mot et syntetisk peptid svarende til det muterte C-terminus. Disse antistoffene viste spesifikk binding til syntetisk mutant peptid i Biacore, ELISA og Western blot analyser, men oppdaget ikke en mutant BAX proteinbånd i helcellelysater eller immunpresipitatene av BAX muterte cellelinjer (upubliserte data). Mutasjoner i BAX, MSH3 og CASP5 all kode for NMD-sensitive (NMD-S) mutante transkripsjoner; mutant BAX og MSH3 er kjent for å være utsatt for nedbrytning [27]. NMD-følsomhet kan redegjøre for vår manglende evne til å oppdage eventuelle mutante proteiner som kommer fra disse tre genene, men unormalt protein folding med tap av antistoff epitoper kan også være en faktor.
(A) Normal BAX protein (21 kDa , pil), men ingen mutant BAX protein (spådd 6,4 kDa) ble påvist i Western blot analyser på helcellelysater av tykktarmskreft cellelinjer. Cellelinjer med BAX G8 CMS mutasjonsstatus: 1. LoVo (-1, +1), 2. SW480 (vekt), 3. HCA7 (-1, vekt), 4. LS174T (-1), 5. HCT116 (- 1, wt), 6. HeLa (wt), 7. LIM1215 (-1). (B) Homozygot -1 basemutasjon i G8 CMS LS174T cellelinje (øverst) sammenlignet med ikke-muterte cellelinje, SW1222 (nederst) (omvendt DNA-sekvensering). (C) Normal BAX protein (pil), men ingen mutant BAX-proteinet påvist ved immunoutfelling: 1. HeLa (wt), 2. LS174T (-1). IgG lett kjede på 25 kDa.
Vi søkte derfor å påvise mutante proteiner som kommer fra NMD-resistente (NMD-R) transkripsjoner. Tidligere publiserte Western blot data viste potensielle mutant proteinbånd i CREBBP og EP300 gener, hver som følge av en heterozygot (-1, villtype) rammeskifte mutasjon av en fem mer CMS gjentar i det siste ekson, oppdaget i LoVo (CREBBP) og HCT116 (EP300) cellelinjer henholdsvis [22]. Vi bekreftet tilstedeværelsen av disse mutasjoner i LoVo og HCT116-cellelinjer ved PCR og DNA-sekvensering. Disse CMS ble ikke mutert i noen av de andre MSI-Høye eller MSS cellelinjer. Bånd tilsvarende de forventede molekylvekter av den normale CREBBP og EP300-protein ble påvist i gjennomgående Western blot analyser av ikke-muterte cellelinjer. Vi oppdaget unormale proteinbånd svarende til de forventede molekylvekter på mutant CREBBP og mutant EP300 i LoVo og HCT116-cellelinjer henholdsvis i Western avsetninger på helcellelysater (figur 2) og på immunpresipitater (figur S1). Vår blot matchet tidligere publiserte data for EP300 [22]. De tidligere CREBBP data samsvarte med en region av ikke-spesifikke bånd i vår blot, men proteinbånd med passende molekylvekt var også tilstede i våre blot. De CREBBP band ble også påvist i eksperimenter hvor man antistoff ble brukt til en immunoprecipitation og et antistoff mot en annen CREBBP epitop ble brukt til gjenkjenning.
Normal proteiner (hvit pil) og mutante proteiner (svart pil) ble oppdaget i Western blot analyser på helcellelysater for (A) CREBBP og (B) EP300. (A) CREBBP C5 CMS: 1. SW480 (wt), 2. LoVo (-1, wt), 3. HCT116 (wt), 4. LIM1215 (wt), 5. LS174T (wt). MW (KDA): wt 265, mut 209. (B) EP300 A5 CMS: 1. LoVo (vekt), 2. HCT116 (-1, vekt), 3. HCA7 (vekt), 4. LIM1215 (vekt), 5 . LS174T (vekt). MW (KDA): wt 223, mut 187.
Validering av mutante proteiner
For å bekrefte identiteten til de unormale proteinbånd og bevise at disse representerer ekte eksempler på forventet mutante proteiner, vi først utført tandem massespektrometri på immunopresipitater av cellelinjene. Denne teknikken bekreftet identiteten av den normale CREBBP og EP300 proteinbånd (fig S1), således validere spesifisiteten av antistoffer som brukes. De mutante proteiner ble ikke oppdaget av denne metoden, muligens på grunn av co-immunoprecipitation av mer rikelig proteiner av lignende molekylvekt som MYH9 (upubliserte data). Spesifisiteten av de mutante proteinbånd ble i stedet bekreftet ved hjelp av små interfererende RNA (siRNA) for å utføre genspesifikke knock-out av mutanten CREBBP og EP300 proteiner. Redusert ekspresjon av det mutante CREBBP protein i forhold til ikke-transfekterte og ikke-målrettede kontroller korrelerte med en betydelig reduksjon i målrettet mRNA, bekreftet ved QRT-PCR (figur 3). Knockdown av mutanten EP300 protein ble på lignende måte demonstrert i immunopresipitatene (figur 4). Disse resultatene bekrefter at unormale proteinbåndene som oppdages er muterte varianter av CREBBP og EP300 proteiner. Dette funnet indikerer at visse MSI-avledet mutante proteiner er naturlig uttrykt ved detekterbare nivåer.
spesifisitet av det muterte proteinet bandet ble bekreftet av gen-spesifikke knockdown i transfektanter av siRNA målretting CREBBP. (A) Påvisning av mutante proteinbånd (sort pil) i helcellelysater av LoVo-cellelinje, men normalt kun protein (hvit pil) i ikke-muterte cellelinje SW480. (B) Western Blot av LoVo hele cellelysater fra siRNA SMARTpool transfektanter viser redusert uttrykk for normal (hvit pil) og mutant (svart pil) CREBBP proteinbånd i CREBBP målrettede lysatene (spor 1). Beta-catenin lasting kontroll (grå pil) 92 kDa. (C) Relativ intensitet av normal (blå) og mutant (rød) CREBBP proteinbånd i forhold til ikke-transfekterte celler (PBS). (D) Redusert CREBBP mRNA uttrykk i CREBBP siRNA transfektanter (venstre kjørefelt) i forhold til ikke-transfekterte celler (høyre felt).
spesifisitet av det muterte proteinet bandet bekreftet av gen-spesifikke knockdown i transfektanter av siRNA målretting EP300. (A) QRT-PCR data for å vurdere sirnas målretting EP300 (beste knockdown hjelp P300-1 og P300-3). (B-C) Redusert mutant EP300 protein påvist i Western blot analyser på immunpresipitatene av EP300 siRNA transfektanter forhold til utransfekterte kontroller (PBS).
Påvisning av flere mulige mutante proteinbåndene
i ytterligere Western Blot eksperimenter (figur 5), mutante TTK proteinbånd ble påvist i flere muterte cellelinjer ved svakt høyere molekylvekt (101 kDa) enn ikke-mutert TTK protein (97 kDa), i samsvar med den forutsagte størrelse (tabell 3) . Forsøk på siRNA knockdown av mutant TTK ble hindret av vanskeligheter med å løse de muterte og normale proteinbånd. En AIM2 bånd ble påvist på omtrent 46 kDa i vestlige blotter på immunpresipitatene fra helcellelysater, konsekvent størrelsen påvist i tidligere studier som bruker denne antistoff [28]. AIM2 protein ble påvist i flere ikke-muterte cellelinjer og også i homozygot AIM2 mutante LoVo-celler. De muterte og villtype AIM2 proteiner som er av tilsvarende forutsagte molekylvekter (39 kDa og 40 kDa henholdsvis). Fordi NMD-resistente transkripter har ofte en CMS i den siste exon nær den C-terminale enden, blir mutante proteiner ofte være av tilsvarende størrelse til normale proteiner. Dette gjør validering av disse mutantproteinbånd ved teknikker som brukes for å bekrefte den CREBBP og EP300 båndene vanskeligere.
(A) Western blot analyser av helcellelysater, identifiserte en potensiell mutant TTK proteinbånd (sort pil) i multiple muterte cellelinjer og normal TTK protein (hvit pil) bare i ikke-muterte linjer: 1. LIM1863 (wT), 2. HCA7 (vekt), 3. LIM1899 (-1, vekt), 4. HCT116 (-1, vekt ), 5. LoVo (-1, vekt), 6. LIM2537 (-1, vekt), 7. LIM2551 (-1, vekt). TTK MW (KDA): vekt 97, mut 101. (B) Western blot analyser på immunpresipitatene av helcellelysater identifisert en AIM2 protein band (svart pil) i alle cellelinjer, inkludert homozygot mutant LoVo cellelinje: 1. SW480 ( wt), 2. LoVo (-1), 3. HCT116 (-1, wt). 4, LS174T (vekt). AIM2 MW (kDa). Vekt 39,0, mut 40,4
Mutant proteinbånd ble ikke oppdaget for alle NMD-resistente transkripsjoner vurdert. I tilfelle av ACVR2A, ble proteinbånd påvises ved de forventede molekylvekter for både normale og mutante proteinet, men i en ikke-spesifikk måte at ikke korrelerer med mutasjon data. Flere proteinbånd ble påvist i blotter for TCF7L2, et gen med mange alternativt skjøtes transkripsjoner [29], men ingen mutante proteiner ble identifisert som korrelert med mutasjon data.
Genome-wide søk for NMD-resistente transkripsjoner som en kilde til målrettbare proteiner
Etter å ha fastslått at NMD-resistente transkripsjoner kan gi opphav til uttrykt MSI-avledet mutante proteiner, forsøkte vi å identifisere ytterligere CMS-inneholder gener sannsynlig å generere uttrykt mutante proteiner i MSI-Høye tykktarm kreft som kan tjene som terapeutiske mål. Ved hjelp av en bioinformatiske strategi, vi utførte et genom-wide søk etter CMS inneholder gener basert på kriterier spådd å kode for NMD-irrelevante mutante transkripsjoner [24], som er egentlig NMD-resistente (tabell S2). Vi identifiserte 1511 ikke-redundante mononukleotid CMS gjentar ≥7 mer i lengde (inkludert hypotetiske gener) spådd å generere NMD-resistente mutante transkripsjoner. Dette kan sammenlignes med 17 654 mononukleotid CMS (≥6 mer) identifisert (uavhengig av NMD status) i en tidligere studie [17].
Gener ble valgt for CMS mutasjonsanalyse basert på utvalgskriteriene sannsynlig å være viktig for verktøyet som en målrettbar protein. Vi begrenset undersøkelsen til 316 mononukleotid CMS gjentar ≥8 mer i lengden, siden det er en sammenheng mellom mikro lengde og sannsynlig mutasjonsfrekvens. Vesentlige mutasjon priser ( 40%) er rapportert for noen 8 Mer gjentar [16]. Gener med korte forutsagte neo-C-terminale proteinsekvenser ( 10 aminosyrer) ble utelatt, da disse er lite sannsynlig å generere nyttige T-celle-epitoper for en rekke vanlige HLA-typer, som er nødvendig for å overvinne MHC-begrensning. Eksklusive hypotetiske gener (prefiks LOC eller KIAA), 179 CMS-inneholder gener fornøyd våre utvelgelseskriterier (tabell S3). Bevis for protein uttrykk i tykktarm kreft nominert genene ble også søkt som en ekstra valgkriterium for å indikere sannsynlig uttrykk for de mutante proteiner. The Human Protein Atlas [30] inneholder data som viser proteinuttrykk i kolorektal kreft ved immunhistokjemi. Imidlertid er utilgjengelig for mange gener slike data, på grunn av avhengighet av IHC av tilgjengeligheten av egnede antistoffer. Derfor genekspresjon profilering data ble også brukt for å identifisere gener med de høyeste mRNA-ekspresjonsnivåene basert på data fra to undersøkelser [31], [32] til MSI og MSS coloncancere (figur S2).
utvalgte gener (tabell 4) ble screenet for CMS mutasjoner i et panel av 5 MSI og 1 MSS cellelinjer og et påfølgende panel på 6 MSI cellelinjer ble testet om den første skjermen vist noen cm mutasjoner. Tre gener (SFRS12IP1, MED8 og ASXL1) ble mutert i 6/11 (55%) av MSI-høy cellelinjer og to gener (FBXL3 og RGS12) ble mutert i 5/11 (45%). Flere gener med mindre mutasjon priser ble også identifisert (tabell S4).
I silico
epitop analyse for NMD-resistente transkripsjon avledet mutante proteiner
For å være nyttig som terapeutisk vaksine /immunterapi mål, mutante proteiner identifisert behov for å generere CTL-epitoper for vanlige HLA typer.
I silico
analyse ved bruk av offentlig tilgjengelig programvare som SYFPEITHI har tidligere blitt identifisert nye CTL-epitoper som senere ble validert i funksjonelle analyser [26]. For å identifisere hvilke MSI-avledet mutante proteiner er sannsynlig å være immunogen, vurdert vi mutante proteiner som kommer fra NMD-resistente transkripsjoner for potensielle HLA-A * 0201 epitoper. HLA-A * 0201 er den vanligste HLA-typen, er tilstede i omtrent 50% av befolkningen [33]. SYFPEITHI score er basert på bindende motiver felles kjente naturlig forekommende epitoper. Ifølge SYFPEITHI scorings retningslinjene, bør en selvsagt uttrykt epitop være blant de øverste 2% av alle peptid score vurdert i 80% av tilfellene [26]. Vi vurderte mutant C-termini som oppstår ved vanlige NMD-R-mutasjoner (tabell S5) og toppen 2% av HLA-A * 0201 SYFPEITHI binding poengsummer som genereres fra de mutante proteinene ble bestemt (tabell 5). Den øverste rangerte peptider hadde SYFPEITHI bindende score varierer 23-31. Disse poengsummene er sammenlignbare med de bindende score til 135 kjente HLA-A * 0201-CTL-kreft-epitoper [26], inkludert de 4 publiserte MSI-avledede epitoper, som har en midlere poengsum på 24 og et gjennomsnitt på 23,4 (tabell S6).
Basert på tilgjengelig rapporterte CMS mutasjon priser for EPHB2, TTK og RGS12 (C8), vil en vaksine som omfatter disse tre mutante proteiner inneholde minst én sannsynlig HLA-A * 0201 epitop for 69% av pasientene ( 1- (1-41%) x (1-27%) x (1-28%)). Videre HLA-A * 0201 epitoper ble identifisert flere gener (TMEM97, ASXL1, SFRS12IP1, RGS12 (A9), RTKN2) med vanlige mutasjoner i denne studien indikerer at også rettet mot disse genene kan utvide HLA-A * 0201-dekning. Noen sjeldne mutasjoner (f.eks NTAN1, RAPH1) også produsere immunogene epitoper som ikke ville gi bred befolkningsdekning, men kan også være verdt å målrette i utvalgte pasienter.
Diskusjoner
mikro ustabilitet gir opphav til forutsigbare rammeskifte mutasjoner som involverer CMS av mange gener. Mutante proteiner som stammer fra disse mutasjonene er en logisk kilde av tumorspesifikke antigener som kunne står for både tilstedeværelsen av økt Tīls og bedre prognose forbundet med en MSI-High fenotype. Dette konseptet er støttet av en nylig oppdagelse av en korrelasjon mellom immun infiltrat tetthet og antall CMS rammeskiftmutasjoner detekteres i et sett av MSI-Høye coloncancere [34]. Vi har validert minst to eksempler (CREBBP og EP300) av naturlig uttrykt mutante proteiner i MSI-High tykktarm kreft cellelinjer, både som følge av NMD-resistente transkripsjoner. Disse funnene bekrefter at NMD-resistente transkripsjoner kan generere naturlig uttrykt MSI-avledet mutante proteiner [34], [35]. CMS gjentar i CREBBP og EP300 er korte og lite sannsynlig å bli mutert i en høy andel av MSI-Høye svulster. Det er imidlertid sannsynlig at noen vanlige NMD-resistente mutasjoner som TTK vil også generere målrettbare mutante proteiner i MSI-Høye kreft. Vår genom-wide strategi for å identifisere immunogene NMD-resistente transkripsjoner har identifisert fem roman CMS mutasjoner (SFRS12IP1, MED8, ASXL1, FBXL3, RGS12) i minst 45% av elleve MSI-High tykktarm kreft cellelinjer som ble testet. Mutasjon analyse i en større serie med primær MSI-High tykktarm kreft vil gjøre det mulig mutasjon frekvenser av disse potensielle terapeutiske mål å være mer nøyaktig.
In vitro
studier har identifisert CTL svar på syntetisk muterte peptider som stammer fra vanlige cms mutasjoner, ved hjelp av perifere mononukleære blodceller fra pasienter med MSI coloncancere [10], [11], [12], [13], [14], [36] og intriguingly, også hos friske personer med HNPCC [15]. Disse studier har vist at tumorspesifikt muterte proteiner kan stimulere
in vitro
T-celle-immunitet og støtter konseptet med en vaksinasjonsstrategi. Den publiserte HLA-A * 0201 CTL-epitoper for TGFBR2 [10], [11], CASP5 [12], OGT [13] og U79260 (FTO) [14] alt oppstår fra NMD-sensitive mutante transkripsjoner. NMD-hemming forsøk har vist at mutant TGFBR2 er en av de mest oppregulert transkriptene, med 10 ganger øket mRNA-ekspresjon i en studie [27], [37]. Den T-celle responser konflikt med den forventede effekten av NMD på mutant protein uttrykk. En transfeksjon studie viste at mutant TGFBR2 protein kan påvises i transfektanter av mutant cDNA (NMD-resistent), men ikke mutant gDNA (NMD-sensitive) [35]. Vi oppdaget ikke mutante proteiner fra NMD-sensitive transkripsjoner (BAX, CASP5 og MSH3). Imidlertid er NMD en oversettelsesavhengig prosess [24] og lavt-nivå-mutant protein ekspresjon fra den første runden av translasjon kan være tilstrekkelig til å stimulere immunresponser. CTL kan vise utsøkt følsomhet for et spesifikt peptid /HLA-ligand, med så få som tre mål-peptid /MHC-komplekser er tilstrekkelig for CTL-spesifikk cellelysis
in vitro product: [38]. Humorale responser til mutant TGFBR2 protein har blitt identifisert av ELISA, men bare i et mindretall (10%) av MSI-Høye tykktarmskreftpasienter [39].
En fordel med NMD-resistente transkripsjoner som en kilde til målrettbar mutante proteiner er som stabilt uttrykte tumorantigener kan tverrpresentert for immunsystemet av dendrittiske celler for å stimulere CTL og T-hjelpercelle responser [40]. Cross-presentasjon er sannsynligvis føre til overlegen anti-tumor immunitet og NMD-resistente transkripsjoner som en kilde til målrettbare mutante proteiner. En fusjon-genet analysen rapporterte en signifikant sammenheng mellom uttrykket av transfekterte MSI-avledet mutante proteiner og cross-presentasjon av co-uttrykt ovalbumin antigen [18]. For gener med neglisjerbar påvisbart protein, ble noen moderate til sterke CTL-responser detektert, men uten kryss presentasjon [18]. En begrensning av den transfeksjon analysen er at mutante cDNA-konstruksjoner ble brukt og derfor forsøkene ikke evaluere virkningen av Sjøfartsdirektoratet på mutant protein ekspresjon. Vår fremgangsmåte overvinner dette ved direkte påvisning av mutant protein ekspresjon. En modifisert transfeksjon assay krever naturlig skjøting av den C-terminale ende kan også identifisere biologisk relevante vaksine mål.
NMD-hemning eksperimenter har identifisert noen «NMD-escape» transkripter som delvis motstå nedbrytning på grunn av NMD [27], . MBD4 er spådd generere en NMD-sensitive avskrift, men en svak unormalt protein Bandet har blitt rapportert i Western blot analyser av MBD4 muterte cellelinjer. Dette kan representere mutant MBD4 protein uttrykk på grunn av NMD-flukt [23]. NMD-rømnings transkripsjoner kan være en nyttig kilde til protein mål, men disse er ikke i stand forutsies og ytterligere arbeid er nødvendig for å avgjøre hvilke NMD-escape transkripsjoner produsere målrettbare mutante proteiner. Strategier som forstyrrer NMD uten å hemme protein oversettelse bør føre til en generalisert oppregulering i NMD-sensitive mutant transkripsjoner, avsløre en rekke tumorantigener. Denne tilnærmingen kan utfylle en vaksine rettet mot MSI-Høye svulster ved å utvide utvalget av tilgjengelige immun mål utover NMD-resistente transkripsjoner. NMD-inhibering av siRNA målretting av NMD regulatoriske gener SMG1 eller UPF2 er nylig blitt vist stand til å indusere beskyttende
in vivo
immunrespons på tumorceller transfektert med en NMD-sensitive målantigen [41].
Vår bekreftelse av mutant protein uttrykk av MSI-High svulster kan ha viktige kliniske applikasjoner. En vaksine rettet mot ofte uttrykt mutante proteiner som er blitt foreslått som en lovende strategi for behandling av MSI-Høye tumorer [15], [18], [34], [42]. Med tilstrekkelige mål, kan vaksinasjon være mulig, forutsatt at de mutante proteiner er uttrykt, er antigene epitoper generert og antigen presentasjon er funksjonell. Videre arbeid er nødvendig for å finne ut hvilken mutant protein immunresponser kan gi en overlevelse fordel for pasienter med MSI-Høye svulster. Mutante proteiner utskilt i serum kan tjene som nyttige biomarkører for tidlig deteksjon av MSI-Høye tumorer, spesielt i HNPCC påvirket befolkningen. Slike biomarkører ville være et nyttig supplement til colonoscopic screening, siden MSI-Høye kolorektal kreft har en tilbøyelighet til intervall adenomer og tumorer utvikler i perioden mellom screening colonoscopies [43], [44]. Den vanlige, forutsigbar og tumor-spesifikke natur MSI-avledet mutante proteiner gjør dem ideelle kandidater som terapeutiske mål eller diagnostiske markører.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur
LIM kolorektal kreft cellelinjer ble etablert fra tumor biopsier ved Ludwig Institute for Cancer Research (LICR) Melbourne Branch som beskrevet tidligere: LIM1215 [45], LIM1899 [46], LIM1863 [47], LIM2463 [48] og (LIM2099, LIM2405, LIM2408, LIM2537, LIM2550 og LIM2551) [49]. Lim cellelinjer ble etablert fra både sporadiske og familiære kolorektal kreft [49] og kan fås fra CellBank Australia (www.cellbankaustralia.com) eller fra LICR Melbourne Branch ved ferdigstillelse av en standard akademisk materiale overføringsavtalen. SW1222 kolorektal kreft celler ble gitt av Ludwig Institute for Cancer Research, New York Branch, (New York, New York) og HCA7 kolorektal kreft celler ble hentet fra den europeiske Innsamling av cellekulturer (Porton Down, UK). b. c. d.
