Abstract
Endringer i tetraspanin CO-029 uttrykk er knyttet til progresjon og metastasering av kreft i Fordøyelsessystemet. Men hvordan CO-029 fremmer kreft metastasering er fortsatt dårlig forstått. For å bestemme mekanisme, forstummet vi CO-029 uttrykk i HT29 tykktarm kreft celler og fant at CO-029 knockdown betydelig redusert celle vandrende evne. Den reduserte cellemigrering ble ledsaget av oppregulering av både integrin-avhengig celle-matrise-adhesjon på laminin og kalsium-avhengig celle-celle adhesjon. Celleoverflaten nivåene av laminin-bindende integrin α3β1 og fibronektin-integrin α5β1 ble øket mens nivået av CD44 ble redusert ved CO-029 demping. Disse endringene bidrar til den forandrede celle-matrise-adhesjon. De deregulerte celle-celle adhesjon resultater, i det minste delvis, fra økt aktivitet av cadherins og redusert nivå av MelCAM. I konklusjonen, CO-029 fungerer som en regulator av både celle-matrise og celle-celle adhesjon. Under tykktarmskreft progresjon, fremmer CO-029 kreft celle bevegelse av dereguleringen cellevoksn
Citation. Guo Q, Xia B, Zhang F, Richardson MM, Li M, Zhang JS, et al. (2012) Tetraspanin CO-029 Hemmer Colorectal Cancer Cell bevegelse av dereguleringen Cell-Matrix og celle-celle adhesjon. PLoS ONE 7 (6): e38464. doi: 10,1371 /journal.pone.0038464
Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan
mottatt: 8 juli 2011; Godkjent: 6 mai 2012; Publisert: 05.06.2012
Copyright: © 2012 Guo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health CA096991. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste kreftformene, har høy dødelighet [1]. Pasienter med metastasering til fjerne organer som lever og lunger lide ekstremt dårlig prognose. Derfor forstå de cellulære og molekylære mekanismer for kolorektal kreft progresjon er avgjørende for å utvikle nye strategier for å bedre prognosen og overlevelse for pasienter med kolorektal kreft.
Tetraspanins regulere en rekke fysiologiske og patologiske prosesser, og noen tetraspanins er forbundet med progresjon av kreft og metastase [2] – [11]. Human tetraspanin CO-029 og dets rotte homolog, D6.1A, ble først rapportert som et tumor-assosiert antigen uttrykt i mage, kolorektal, og kreft i bukspyttkjertelen celler og utøve tumorprogresjon-fremmende aktivitet [12]. CO-029 uttrykk er ofte oppregulert i leverkreft [13]. Ekspresjonsnivået av D6.1A økes markert i forhold til en i en differensiert foreldrelinje, i en dedifferensieres rotte hepatomcellelinje [14]. Den samtidige uttrykk for inte α6β4 og D6.1A i nonmetastasizing rotte bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinje BSp73AS letter levermetastaser av denne linjen [15]. CO-029 viser også et høyere uttrykk nivå med metastatisk tykktarmskreft celler, sammenlignet med nivået i grunnskolen tykktarmskreftceller [16]. En mulig mekanisme for prometastatic aktiviteten av CO-029 er dens assosiasjon med integriner eller tetraspanins, som begge innvirker på celle motilitet. D6.1A er assosiert med integriner α3β1, α6β1, og α6β4 etter protein kinase C (PKC) aktivering [15], [17]. I metastatiske bukspyttkjertelen og tykktarmskreft cellelinjer, aktivering av PKC forbedrer colocalization av CO-029 og tetraspanin CD151 med inte α6β4 i tumorceller, fremmer internalisering av denne integrin-tetraspanin kompleks, reduserer celle-matrix adhesjon på laminin 332, og øker cellevandring [18]. Videre D6.1A-overekspresjon tumorceller slipper exosomes som inneholder D6.1A, og disse exosomes indusere angiogenese å lette tumor spredning [19]. En fersk studie viste at E-cadherin og P120-catenin motvirke CO-029 forfremmet migrasjon av Isreco tykktarmskreftceller [20]. Disse studiene sterkt at en viktig rolle for CO-029 i progresjon og metastasering av svulster i fordøyelsessystemet. For å bestemme den mekanismen som CO-029 fremmer tumorprogresjon og metastase, forstummet vi uttrykk for CO-029 i HT29 menneskelige kolon adenokarcinomceller. Ved å kombinere in vitro og in vivo forsøk, har vi funnet at tapet av CO-029 signifikant svekket celle motilitet og endres balansen av celle-celle og celle-matriks-sammenvoksninger, som fører til redusert metastatisk potensial av tumorceller.
Materialer og metoder
Cell Culture, antistoffer, ekstracellulære matriksproteiner og andre reagenser
HT29 human kolorektal adenokarsinom-cellelinje ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA) og dyrket i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.
antistoffene anvendt i denne studien ble intergrin α1 mAb TS2 /7, intergrin α2 mAb IIE10, intergrin α3 mAb A3X8, intergrin α5 mAb BIIG2, intergin α6 mAb A6BB, intergrin β1 mAb TS2 /16, intergrin β4 mAb 439-9B (BD Pharmingen, San Diego, CA), CD9 mAbs C9BB [21] og Mab7, CD63 mAb 6H1 [22], CD81 mAb M38, CD82 mAb M104, CD151 mAbs 5C11 og TS151r [23], CO29 mAb NS1116 (vennlig levert av Dr. Dorothee Herlyn av Wistar Institute), E-cadherin mAb (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), EpCAM mAb VU1D9 (Cell Signaling, Danvers, MA), EWI2 mAb 5E8 (vennlig levert av Dr. T. Schweighoffer av Novartis Institute for Biomedical Research), og MelCam mAb P1H12 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). En mus IgG2b ble anvendt som en negativ kontroll-antistoff (Sigma, St. Louis, MO). Det andre antistoff brukt i denne studien ble pepperrot-peroksidase-konjugert geite-anti-muse-IgG-antistoff (Sigma, St. Louis, MO) og fluorescein isotiocyanat-konjugert geit-anti-mus-IgG-antistoff eller -rat (Biosource International, Camarillo, CA) .
De ekstracellulære matrix proteiner ble rekonstruert mus basalmembran Matrigel (BD Biosciences, Mountain View, CA), mus laminin 111 (Invitrogen, San Diego, CA), og human plasma fibronektin (Invitrogen, San Diego, CA ). Andre reagenser var fra Sigma om kilden ikke er spesifisert.
RNA interferens og Retrovirus Forberedelse og Transduksjon
CO-029 små hårnål RNA (shRNA) (TGCTGTTGACAGTGAGCGATGAATGAAACTCTCTATGAAATAGTGAAGCCACAGATGTATTTCATAGAGAGTTTCATTCACTGCCTACTGCCTCGGA), som retter seg mot den TGAATGAAACTCTCTATGAA sekvens av humant CO-029 mRNA, og kontroll shRNA (RHS1703) ble oppnådd fra OpenBiosystems (Huntsville, AL). Et annet CO-029 shRNA som er rettet mot en annen del av CO-029 mRNA-sekvensen ble hentet fra OpenBiosystems (Materialer og amp; Metoder S1). Den vesikulær stomatitt virus (VSV) -G protein uttrykk vektor pVSV-G (vennligst gi av Dr. C. Stipp, University of Iowa) og shRNA ble omformet til de GP293 emballasje cellene ved Lipofectamine 2000 (Invitrogen, San Diego, California). Etter 48 timer ble den viruspartikkel-inneholdende kultursupernatant høstet, og celleavfall ble fjernet ved føring av supernatanten gjennom et 0,45-umol /l sprøytefilter. Den rensede virus lager ble inkubert med HT29 celler for transduksjon, og HT29 celler transduced med kontroll eller CO-029 shRNA ble valgt med puromycin. Puromycinet-resistente celler i CO-029 shRNA transductant ble sortert ved flowcytometri for å berike CO-029-forstummet cellepopulasjon.
flowcytometri
Celler ble frittliggende med 0,5% trypsin-EDTA , vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) to ganger, blokkert med 5% geiteserum i DMEM ved 4 ° C i 1 time, inkubert med primært mAb, og så farget med FITC-konjugert geit-anti-mus IgG ved 4 ° C i 1 time. Fargede celler ble analysert på et FACScan strømningscytometer (BD Biosciences).
Immunofluorescence
Celler ble fiksert med 3% paraformaldehyd ved romtemperatur (RT) i 15 minutter, permeabilisert med 0,1% Brij 98 ved RT i 2-5 min, blokkert med 20% geiteserum ved 4 ° C i 1 time, og inkubert med primære mAbs ved 4 ° C i 1 time, etterfulgt av farging med et sekundært antistoff ved 4 ° C i 1 time. Etter hvert antistoff inkubering ble cellene vasket tre ganger med PBS. For immunofluorescent analyse, ble cellene undersøkt med en Axiophot fluorescerende mikroskop (Carl Zeiss, Thornwood, NY), og bildene ble tatt med en Optronics digitalkamera.
Immunpresipitasjon og Western Blot
immunoutfellinger var utført som beskrevet tidligere [24]. Celler ble lysert med 1% Nonidet P-40 lyseringsbuffer ved 4 ° C i 1 time. I noen eksperimenter, ble celleoverflatemerket med 0,5 mg /ml EZlink sulfo-NHS-LC-biotin (Pierce) før cellelysering. Etter fjerning av uløselig materiale ved sentrifugering ved 14 000 x g og to kjøringer av pre-klaring, ble lysater inkubert med primært mAb-absorberte protein A- og G-Sepharose-kuler (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) fra 3 timer til over natten ved 4 ° C. Immunopresipitatene ble vasket med lyseringsbuffer tre ganger, oppløst i Laemmli prøvebuffer, oppvarmet ved 95 ° C i 5 minutter, separert ved SDS-PAGE, og deretter elektrisk overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, Hercules, CA). Membranene ble sekvensielt blottet med primær Ab og pepperrot peroksidase-konjugert andre Ab (Sigma) for Immunoblotanalyse eksperimenter eller pepperrot-peroksidase-konjugert extravidin (Sigma) for biotinylering eksperimenter, etterfulgt av kjemiluminescens (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA).
Cell Adhesion Assays
Cell-matrise-adhesjon assay ble utført som beskrevet i vårt tidligere studium [25]. I korthet ble 96-brønns mikrokulturplater (BD Bioscience) belagt med laminin mus 111 eller fibronectin ved 4 ° C over natten og deretter blokkert med 1% varme-inaktivert bovint serumalbumin (Sigma) ved 37 ° C i 1 time. Laminin 332 ble fremstilt ved dyrking av RAC-11p-celler ved konfluens i 96-brønners plater i 3 dager som beskrevet tidligere [26]. Cellene ble trypsinert og suspendert i serumfritt DMEM-medium ved en tetthet på 1 x 10
4 celler /ml, og 0,1 ml av cellesuspensjonen ble deretter tilsatt til hver brønn. Etter inkubasjon i 1 time ved 37 ° C, ble ufestede celler fjernet ved skylling fire ganger med PBS. De festede celler ble tellet visuelt.
celle-celle adhesjon ble undersøkt ved hjelp av den hengende dråpe aggregering assay som tidligere beskrevet [27]. Cellene ble løsnet med 0,5% tripsin-EDTA og vasket to ganger med PBS, deretter gjengitt i enkeltcellesuspensjon ved å tre milde passerer gjennom en 27-gauge nål. Den enkeltcellesuspensjon av 1 x 10
4-celler i 30 pl av oppløsningen ble suspendert som en hengende dråpe fra lokket på en 24-brønners dyrkningsskål og tillatt å aggregere over natten ved
oC 37 i 5% CO
2 med fuktighet. Fullstendig DMEM ble brukt for å måle den totale celle-celle-klebrighet, mens kalsiumfritt DMEM var for kalsium-uavhengig celle-celle klebrighet. For å bestemme motstanden av celle-celle adhesjon til mekaniske påkjenninger, ble cellene utsettes for skjærkraft ved å føre dem gjennom en 200-ul pipettespiss 10 ganger. Kalsium-uavhengig celle-celle adhesjon ble også målt under relativt milde mekaniske påkjenninger [28]. I korthet, etter vasking med Puck saltløsning (5 mM KCl, 140 mM NaCl, 8 mM NaHCO3, pH 7,4), enkelt-cellesuspensjon (1 x 10
5 celler /ml) ble inkubert i 5% CO
2 ved 37 ° C over natten under omrøring ved 80 opm, på en orbital-rystemaskin. Cellene ble fotografert enten før eller etter mekanisk påkjenning. Celle-celle klebrighet etter at skjærspenningen ble kvantifisert som i) prosentandelen av aggregerte celler og /eller ii) det område som dekkes av aggregater. Basert på telling av enkeltceller, ble andelen av aggregerte celler beregnet ved hjelp av formelen% aggregering = [1- (antall enkeltceller /totalt antall celler)] × 100. Arealet dekket av aggregatene ble målt ved hjelp ImageJ programvare for å skildre graden av celle aggregering. Cell tilslag er definert som en celle klump som inneholder fire eller flere celler.
celle migrasjon Analyser
sårtilheling analysen ble utført som beskrevet i vår tidligere studie [29]. I korthet ble cellene sådd ut i individuelle brønner i en 24-brønners kulturplate. Når cellene nådde konfluens, ble en celle monolag først behandlet med 10 ug /ml mitomycin C i 30 minutter for å blokkere mitose og dermed tillate analyse av cellemigrering i fravær av celleproliferasjon. Deretter cellemonolaget ble såret med en steril, 200- mL pipette tips. Mediet og celleavfall ble fjernet og påfylt med 2 ml friskt medium. Celler ble fotografert av fasekontrastmikroskopi hver 24. time etter såret. For å evaluere «sårlukking», ble fem områder langs såret tilfeldig valgt for beregning av gjennomsnittlig bredde for hver brønn. Bilder ble tatt på forskjellige tidspunkter av en Olympus omvendt-fase-kontrast mikroskop.
Transwell cellemigrering assay ble utført som beskrevet i vårt tidligere studium [30]. Kort sagt ble det 8-um porestørrelse, 24-brønners Transwell innsatser (BD Bioscience, Bedford, MA) forhåndsbelagt med 10 ug /ml laminin 111 eller fibronektin på undersiden av innsatsene ved 4 ° C over natten og blokkert med 0,1% varme-inaktivert bovint serumalbumin (BSA) ved 37 ° C i 1 time. Totalt 2 x 10
4-celler i serumfritt DMEM inneholdende 0,1% varme-inaktivert BSA i et volum på 300 ul ble tilsatt til det øvre kammer, og 500 ul DMEM inneholdende 1% FBS ble tilsatt til det nedre kammer . Cellene i transwells ble inkubert i 24 timer ved 37 ° C. Cellene igjen på den øvre overflaten av innleggene ble fjernet ved å tørke med en bomullspinne, og cellene som transmigrated gjennom porene ble fiksert og farget med Diff-Quik Stain Kit (Dade Behring, Inc., Newark, DE). Migrering ble kvantifisert ved telling av celler på den nedre overflate av innsatsen.
Statistiske analyser
Alle forsøk ble utført minst fire ganger. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse ble utført av Student
t
-test, og
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
The Silence of CO. -029 Expression i HT29 tykktarmskreft Cells
for å bestemme mekanistiske roller tetraspanin CO-029 i tumorprogresjon, etablerte vi et stabilt transductant i HT29 menneskelige kolon adenokarcinomceller [31], hvor CO-029 uttrykk var slått ned av shRNA. Ved å stanse virkninger på det totale cellulære og celleoverflate CO-029 proteinekspresjon ble bestemt ved hjelp av Western blot og flowcytometri, henholdsvis (figur 1). Sammenlignet med den transductant uttrykker kontroll eller nonsilencing (NS) shRNA, den transductant uttrykker CO-029 shRNA (KD) oppviste en vesentlig reduksjon av CO-029 uttrykk på celleoverflaten (figur 1A), som strekker seg fra ca 60% til 90%, avhengig av cellesammenløpet status i hvert enkelt eksperiment, og et stort tap av totale cellulære CO-029-proteiner (figur 1B), typisk ca. 90%. Stillheten som følge av CO-029 shRNA var bestemt til CO-029 fordi uttrykket av mange andre overflateproteiner, spesielt andre medlemmer av tetraspanin super, ikke ble redusert (se nedenfor).
CO-029 shRNA og nonsilencing shRNA ble stabilt uttrykt i HT29 celler. (A) Strømningscytometrisk analyse av CO-029 ekspresjon på overflaten av HT29-celler som ble transfektert med nonsilencing (NS) eller CO-029 shRNA (KD) konstruksjoner. Den negative kontrollen mAb var murine IgG, og CO-029 mAb var NS1116. Mean fluorescerende intensitet (MFI) av CO-029 på KD celler var 62% mindre enn det på NS celler. (B) Western blot-analyse av CO-029 proteiner i NS og KD HT29-celler. KD-celler viste en 90% reduksjon i CO-029-proteiner. β-aktin. lasting kontroll
The Silence of CO-029 Expression Nedsatt Migrering av HT29 celler
Vi først vurdert effekten av CO-029 stanse på kreft celle migrasjon. For å sammenligne cellen migrerende evne til NS og KD transduktanter, utførte vi en) sårheling analyse for å analysere kollektiv cellemigrasjon, dvs. celle-celle-adhesjon-avhengige cellemigrasjon, og 2) transwell migrering analyse for å analysere enslig cellemigrasjon, dvs. celle-celle-adhesjon-uavhengig cellemigrering. I de sårheling forsøk ble repopulation sats eller helbredende fremgangsmåten ifølge den sårede monolaget markert redusert i CO-029 KD transductant celler, og en slik reduksjon varte i flere dager (Figur 2A og figur S1A). Den reduserte sårheling var ikke et resultat av lavere celle proliferasjon av de cellene KD fordi forsøkene ble utført i nærvær av mitomycin. Den svekket evne til KD celler i cellemigrasjon kan også bli observert i transwellmigrasjonsanalysen. Celle migrasjon gjennom porer membranfilter på ekstracellulære matrix proteiner som laminin 111 og fibronektin ble betydelig redusert på stanse av CO-029 uttrykk (figur 2B og figur S1B). Disse resultater indikerer at tausheten av CO-029 demper den generelle evne til cellemigrering og at ekspresjon av CO-029 er nødvendig for sterk eller robust cellemigrering.
(A) sårheling assay. Sammenlignet med NS-celler, ble såret nedleggelse betydelig svekket i KD cellene i 72 timer etter opprettelsen av sår i konfluent cellemonolagene. (B) Transwell migrasjon assay. KD celler vises nedsatt bevegelighet i Transwell migrasjon eksperimenter. Data er vist som gjennomsnitt ± SD, n = 4. *
P
. 0,05
I tillegg til cellemigrasjon på to-dimensjonal matrise, er en viktig celle invasjon parameter for å måle cellemotilitet gjennom tre-dimensjonale (3D) mikromiljø for invasive og metastatiske kreftceller. Cellulær invasivitet ble målt ved evnen av HT29 transductant celler å invadere gjennom Matrigel, et 3D-matrise som ligner på basalmembran, eller type I kollagen-gel, et 3D-matrise som ligner på bindevev. Vi fant ingen signifikant invasjon av hver gruppe av HT29-KD-celler gjennom en av disse 3D matrise omgivelser (data ikke vist), noe som tyder på at HT29-celler er ikke invasiv, i det minste i dette invasjon analysen og under
in vitro
test tilstand.
CO-029 regulert Cell-matrix og Cell-celle adhesjon
Tumor celle-matrise og celle-celle adhesjon anses å være de viktigste hendelsene som regulerer metastatisk kaskade [ ,,,0],32] – [34]. For å evaluere effekten av CO-029 stanse på celle-matrise-adhesjon, vi analysert og sammenlignet med den celle-matriks klebrighet KD og NS transduktanter på laminin og fibronektin. Som vist i figur 3A, HT29-NS og -KD celler vises forskjellige klebe egenskaper. KD-celler oppviste økt klebrighet på ekstracellulære matriksproteiner laminin 111 og laminin 332, noe som tyder på at CO-029 hemmer celleadhesjon på basalmembran, som er matrisen miljø anriket på laminins. Den celle adhesjon på fibronektin, men oppviste ingen forskjeller mellom NS og KD-celler (Figur 3A). Vi undersøkte også celleadhesjon på hyaluronan, et større proteoglykan av ekstracellulært miljø og liganden av CD44, på grunn av redusert CD44 ekspresjon ved overflaten av HT29-KD-celler. Men HT29 celler syntes ikke å følge hyaluronan, selv om en etablert protokoll ble fulgt i denne analysen [35].
(A) Cell-matrix adhesjon. Adhesjon på laminin 111, laminin 332, og fibronektin av HT29-NS og -KD-celler ble undersøkt etter inkubasjon ved
oC 37 i 5% CO
2 i 1 time. Vedheft av KD cellene på laminin 111 og laminin 332 ble betydelig økt sammenlignet med NS celler (
P
= .042 på laminin 111 og = .048 på laminin 332). (B) Total celle-celle adhesjon. Celle aggregering ble målt i Ca
++ – inneholdende medium etter en forholdsvis sterk mekanisk kraft ble påført. (C) Ca
++ – uavhengig celle-celle adhesjon. Cell aggregering ble målt i Ca
++ – frie medier etter relativt sterke eller svake mekaniske krefter ble brukt, henholdsvis. Aggregering av NS og KD-celler etter skjærspenningen ble kvantifisert som beskrevet i Materialer og Metoder.
P
verdier er 0,03 for de aggregerte celler i nærvær av Ca
++, 0,001 for området av aggregater, i nærvær av Ca
++, og 0,0004 for mild spenning i fravær Ca
++. Bilder av celleaggregater etter skjær-stress behandling ble oppnådd under fasekontrastmikroskopi. Alle data som er projisert som gjennomsnitt ± SEM (n = 4). *
P
0,05, **
P
. 0,01
For å evaluere effekten av CO-029 stanse på celle-celle adhesjon utførte vi celle aggregering analysen. Først undersøkte vi celle aggregering i nærvær av Ca
++ [28], noe som gjenspeiler den totale celle-celle-klebrighet inkludert både cadherin-avhengige og-uavhengig celle-celle klebrighet. Dempe CO-029 resulterte i økt evne til å danne celleaggregater som er resistente overfor forholdsvis sterk mekanisk belastning, sammenlignet med NS-celler (Figur 3B). Deretter undersøkte vi celle-celle-aggregering i fravær av Ca
++, noe som gjenspeiler cadherin-uavhengig celle-celle-klebrighet, for eksempel den ene mediert av IGSF proteiner. Ca
++ – uavhengig celle-celle adhesjon viste ingen forskjell etter forholdsvis sterk mekanisk belastning ble benyttet, men ble nedregulert i KD-celler etter forholdsvis mild mekanisk kraft ble påført (figur 3B). I HT29 celler, Ca
++ – avhengig celle-celle adhesjon gjør et stort bidrag til total celle-celle adhesjon, basert på sammenligningen mellom størrelsen på Ca
++ – avhengige og-Uavhengig tilslag etter sterk mekanisk spenning behandling (figur 3B). Sammen CO-029 rammen totalt og Ca
++ -. Avhengig celle-celle adhesjon
CO-029 Dempe Altered Cell Surface Expression Profil adhesjonsmolekyler
Endringene i overflaten ekspresjon av tetraspanins, integriner og adhesjonsproteiner celle er involvert i tumorprogresjon og metastase [17], [36] – [42]. For å bestemme den mekanismen som CO-029 regulerer celle-celle og -matrix adhesjoner, vi målt og sammenlignet uttrykket nivåer av celle adhesjonsproteiner på overflaten av HT29-NS og -KD celler. For celle-matrix adhesjonsproteiner, laminin reseptoren inte α3 og fibronectin reseptor inte α5 ble oppregulert etter stanse CO-029. Integriner β1, β4, α1, α2, og α6 forble uendret, mens hyaluronan receptor CD44 ble markert nedregulert på celleoverflaten (figur 4A). For å avgjøre om CO-029 stanse påvirker inte aktivering, vi målte og sammenlignet på steady state nivåer av aktive ß1 inte i HT29-NS og -KD celler med flowcytometri ved hjelp β1 inte mAb AG89. Den β1 inte mAb AG89 anerkjenner kun de ß1 inte i aktiv tilstand [43]. Selv om nivået av aktive ß1 integriner ble betydelig økt på celleoverflaten av HT29-KD-celler (figur 4B venstre histogram), forble den uforandret etter å ha blitt kalibrert med nivået av de samlede ß1 integriner på celleoverflaten (figur 4B høyre histogram). For celle-celle-adhesjons-molekyler, ble nivået av E-cadherin proteiner ikke endres på celleoverflaten (figur 4C). Vi har også undersøkt andre celle-celle adhesjon molekyler knyttet til CO-029 og /eller tetraspanins som EpCAM, MelCAM, og EWI2, som tar del i Ca
++ – uavhengig celle-celle adhesjon og noen som hører til IGSF . Bare MelCAM ble markert nedregulert på celleoverflaten (figur 4C). Tetraspanins CD9, CD63, CD81, CD82, og CD151 viste ingen signifikant endring på celleoverflaten på CO-029 stanse (figur 4D).
uttrykk nivåer av celle-matrise adhesjonsproteiner (A), aktiv β1 integriner (B), celle-celle-adhesjonsproteiner (C), og tetraspanins (D) på overflaten av HT29-NS og -KD transfektant-cellene ble målt ved flow-cytometri. De relative nivåer av disse proteiner på KD-celler NS-celler er presentert som histogrammer (gjennomsnitt ± SD, n = 4~8). *
P
0,05, **
P
0,01. I (B), etter normalisert ved tilsvarende relative nivåer av total integrin β1, er nivåene av aktive inte β1 i forhold til NS celler presentert i histogrammet til høyre.
CO-029 og dannelse av Focal heft, Stress Fiber, og Adherens Junction
for ytterligere å evaluere effekten av CO-029 stanse på celle adhesjon, vi undersøkte brennvidde heft og adherens krysset av HT29 transfektant cellene ved farging i) vinculin, en markør for fokale heft, og ii) E-cadherin og β-catenin, markører for adherens veikryss, henholdsvis. Vi har funnet at CO-029 stanse resulterte i redusert dannelse av fokal adhesjon, som vist i figur 5A. I mellomtiden, stress fiberdannelse nær den basale overflaten av HT29-KD-celler ble også mindre robust sammenlignet med den i HT29-NS-celler (figur 5A). I motsetning til dette synes CO-029 lyddemping for å ha noen forstyrrende virkning på dannelsen av adherens knutepunkt, basert på E-cadherin og β-catenin farging (figur 5B). Kortikale nettvaren av aktin langs sideflate eller adherens knutepunkt oppviste ingen markert forskjell mellom NS og KD-transfektant-celler (data ikke vist).
HT29 transfektanter ble sådd ut på dekkglass og dyrket i komplett medium i 2 dager (for vinculin og F-aktin-farging, A) eller inntil konfluens (for E-cadherin og β-catenin flekker, B). Cellene ble fiksert, permeabilisert, og inkubert med primære mAbs ved 4 ° C over natten, etterfulgt av Alex Fluor 594-konjugert sekundært Ab farging. F-aktin var farget av Alex Fluor 594-konjugert phalloidin. Bildene ble tatt med konfokalmikroskopi. Bar = 20 mikrometer.
Effekten av CO-029 Dempe på dannelsen av Tetraspanin-beriket Microdomain (TEM)
Siden CO-029 medarbeidere med tetraspanins som CD9 og CD151 og laminin-bindende inte [11] undersøkte vi effekten av CO-029 stanse på stabiliteten av TEM. De sammenslutninger av CD151 med laminin-bindende inte α3β1, α6β1, og α6β4 forble stabilt under en strengere lyse tilstand, dvs. 1% Triton X100-mediert cellelyse, mens sammenslutninger av CD151 med andre tetraspanins holdt seg stabilt under bare en relativt mild lyse tilstand, dvs. 1% Brij 97-mediert cellelyse [3]. CO-029 stanse påvirket ikke immunoutfellingsstudier profiler av CD151 under enten lyse tilstand (Figur 6A). Flere laminin-bindende inte ble co-utfelt med CD151 under 1% NP40 lyse stand ved CO-029 stanse. Både CD151 og CD9 forbundet med CO-029 under 1% Brij 97 lyse tilstand, som avslørt av CD151 og CD9 immunoutfellingsstudier profiler, mens slike foreninger ble avbrutt på under 1% Triton X100 lyse tilstand, som forventet. Under 1% Brij 97 lyse tilstand, CO-029 immunpresipitatene også avdekket CD9-CO-029 foreningen men ingen CD151-CO-029 foreningen på grunn av mindre biotinylering av CD151 og co-migrering av CD151 med CO-029 (figur 6A).
(A) overflaten biotinylert HT29-NS og -KD transfektant cellene ble lysert med angitte vaskemiddel buffere. Tetraspanins CD9, CD151, og CO-029 ble immunopresipitert fra lysatene, separert ved SDS-PAGE og detektert ved forsterket kjemiluminescens. Nivåene av p-aktin proteiner i lysatene ble undersøkt med Western blot og fungerte som lysat inngangskontroll. (B) Et uttrykk nivåer av integrin α3β1-ubundet CD151, CD151 total, homoclustered CD9, og total CD9 på overflaten av HT29-NS og -KD transfektant-celler ble målt ved hjelp av mAb TS151r, 5C11, C9BB, og Mab7, henholdsvis, ved hjelp flowcytometri. De relative nivåer av CD151 og CD9 på KD-celler NS-celler er presentert som histogrammer (gjennomsnitt ± SD, n = 3~5).
Noen av CD151 proteiner på celleoverflaten binder inte α3β1 i en direkte protein-protein interaksjon måte [3]. Vi analyserte nivået av inte α3β1-ubundet eller «gratis» CD151 proteiner, som er anerkjent av CD151 mAb TS151r [23]. På celleoverflaten, ble hverken nivået av fritt CD151 eller CD151 den totale normaliserte nivå av fri CD151 skiftes på CO-029 stanse (figur 6B). Tilsvarende er CD9 proteiner på celleoverflaten enten homoclustered eller assosiert med tems [21]. Vi fant at verken nivået av homoclustered CD9 heller ikke den totale CD9-normalisert nivå av homoclustered CD9 ble endret på CO-029 stanse (figur 6B). Sammen utgjør disse observasjonene tyder på at CO-029 er ikke nødvendig for samspillet av CD151 og CD9 med TEMS.
Diskusjoner
Tetraspanins regulere tumorprogresjon og metastasering. Men mekanismene er fortsatt i stor grad ukjent. På cellenivå, tetraspanins modulere celle adhesjon, migrasjon, spredning, og fusion. Klebrighet og motilitet av tumorceller delvis bestemme tumor metastatisk potensial. Derfor, på cellenivå, tetraspanins sannsynligvis regulere tumormetastase ved å modulere evnene til tumorceller for å overholde og bevege seg. På molekylært nivå, for å tetraspanins assosiere med integriner, IGSF-proteiner, vekstfaktorer og deres reseptorer, proteaser og intracellulære signaliseringsproteiner danner TEM [44] – [47]. Derfor, på molekylært nivå, tetraspanins regulere tumorprogresjon og metastase sannsynligvis ved å endre funksjonene til de assosierte proteiner [48] -. [51]
Ekspresjon av tetraspanin CO-029 er typisk knyttet til dårlig prognose av fordøyelsessystem-kreft [12], [16], [18], [46], [52], [53], er CO-029 oppregulert ved progresjon av colorektal, lever, bukspyttkjertel, og esophageal-kreft [11], [ ,,,0],46], [54], og den økte ekspresjon av CO-029 fremmer lever eller lunge metastaser av disse kreftformene [17], [52], [53], [55]. Tumor celle migrasjon og invasjon er uunnværlig for metastasering. Bevegelsen av tumorceller er involvert i minst to faser i den metastase kaskade [52]. Den første fase er at tumorceller vandrer bort fra den primære tumor og invadere sirkulasjonssystemet; den andre fasen er at tumorceller migrerer ut av blodkarene og inn i målvevet. Den reduserte cellebevegelse på CO-029 stanse indikerer at CO-029 er nødvendig for effektiv migrering og invasjon av kolorektal kreft celler og antyder at CO-029 sannsynligvis fremmer begge stadier av tumormetastase.
CO-029 vises å fremme celle bevegelse ved å endre celle-matrise og-celle adhesjon. Det er godt etablert at celle-celle-adhesjon og -matrix bestemmer direkte celle motilitet. For eksempel, tap eller reduksjon av E-cadherin ekspresjon og /eller aktivitet i tumorceller fører til utsendelse av tumorceller fra primære tumormasse [56]. Metoder S1.
