Abstract
Kliniske observasjoner og musemodeller har antydet at betennelse kan være pro-tumorigen. Siden kjemokiner er kritiske i leukocytter menneskehandel, hypotese vi at kjemokiner spille viktige roller i betennelse-assosiert kreft. Screening for 37 kjemokiner i prostatakreftcellelinjer og xenotransplantater avdekket CXCL16, liganden for reseptoren CXCR6, som den mest gjennomgående uttrykt kjemokin. Immunhistokjemi og /eller immunfluorescens og confocal avbildning av 121 menneskelige prostata prøvene viste at CXCL16 og CXCR6 ble samtidig uttrykt, både på prostatakreftceller og tilstøtende T-celler. Expression nivåer av CXCL16 og CXCR6 på kreftceller korrelert med dårlige prognostiske funksjoner, inkludert høy-scenen og høy klasse, og uttrykket også korrelert med post-betennelsesforandringer i kreft stroma som avslørt av tap av alfa-glatt muskulatur aktin. Dessuten, CXCL16 forbedret vekst av CXCR6-uttrykkende kreft og primære CD4 T-celler. Vi studerte ekspresjon av CXCL16 i ytterligere 461 prøvestykker som dekker 12 tumortyper, og fant at CXCL16 ble uttrykt i flere humane kreftformer forbundet med betennelse. Vår studie er den første til å beskrive uttrykket av CXCL16 /CXCR6 på både kreftceller og tilstøtende T-celler hos mennesker, og for å demonstrere sammenhenger mellom CXCL16 og CXCR6 vs. fattige både prognostiske funksjoner og reaktive forandringer i kreft stomi. Tatt sammen, våre data at CXCL16 og CXCR6 kan markere kreft som oppstår i et inflammatorisk miljø og medierer pro-tumorigene virkningene av inflammasjon gjennom direkte effekter på kreftcellevekst og ved å indusere migrering og proliferasjon av tumorassosiert leukocytter.
Citation: Darash-Yahana M, Gillespie JW, Hewitt SM, Chen Y-YK, Maeda S, Stein jeg, et al. (2009) chemokin CXCL16 og dens reseptor, CXCR6, som Markører og Arrangører av betennelse-assosiert kreft. PLoS ONE 4 (8): e6695. doi: 10,1371 /journal.pone.0006695
Redaktør: Derya Unutmaz, New York University School of Medicine, USA
mottatt: 6 april 2009; Godkjent: 21 juli 2009; Publisert: 19 august 2009
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet delvis av egenutført Research Program av National Institute of Health, National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer og National Cancer Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nylige musemodeller har laget en funksjonell sammenheng mellom kreft og inflammasjon [1] – [3], noe som gir bevis for en tumor-fremmende aktivitet for leukocytter som opprinnelig ble foreslått av Rudolf Virchow [4], [5]. Human prostatacancer har blitt postulert til å oppstå fra forstadier prosesser assosiert med inflammasjon, så som proliferative inflammatorisk atrofi (PIA) [6], som er lesjoner funnet i tilknytning til prostatakreft som er foreslått for å lede til prostata- intraepitelial neoplasi (PIN), eller kreft [ ,,,0],7]
Blant de faktorer som er viktige for betennelse er chemokiner -. kjemotaktiske cytokiner som medierer leukocytt rekruttering [8]. Ulike roller har blitt rapportert for chemokiner i tumorbiologi, inkludert direkte effekter på kreftceller, for eksempel på transformasjon, overlevelse og spredning, og indirekte effekter, for eksempel i angiogenese og rekruttere leukocytter til kreft nettsider [9] – [11] . I lys av den siste bevis for mulige pro-tumorigen aktivitet av leukocytter, vi antatt at inflammatoriske kjemokiner, enten produsert av tumorcellene, eller ved tumor-assosiert leukocytter, kan, i motsetning til standard synspunkt, bidrar til ondartet progresjon ved å øke leukocytt-rekruttering .
i de beskrevet nedenfor studiene, en skjerm for ekspresjon av 37 kjemokiner i prostatakreftcellelinjer og xenotransplantater viste ekspresjon på høyt nivå av CXCL16, en uvanlig chemokine som eksisterer i både transmembrane og løselige former [12], [13], og som også kan fungere som en scavenger reseptor for oksyderte lipoprotein og bakterier [14]. CXCL16 uttrykk har vært forbundet med en rekke humane inflammatoriske sykdommer, innbefattet reumatoid artritt [15], [16], interstitielle lungesykdommer [17], [18], aterosklerose [19] – [23], koronarsykdom [24], [25] og leverskade [26] – [30]. Den CXCL16 reseptor, CXCR6, har blitt rapportert å bli uttrykt på Th1-celler [31], på tumor infiltrerende lymfocytter [32], og på en rekke av leukocytter i betent vev sider [33], [34], og kan tjene som en co-reseptor for HIV-1 [32], [35].
Vår studie antyder direkte roller for CXCL16-CXCR6 på prostatakreft ved å demonstrere samlokalisering av CXCL16 og CXCR6 på kreftceller, finne signifikante positive korrelasjoner mellom uttrykk for CXCL16 og CXCR6 vs. scenen og karakteren av prostatakreft, og viser at CXCL16 kan stimulere veksten av prostata kreft cellelinjer transfektert til å uttrykke CXCR6.
Våre studier på sammenhengen mellom CXCL16 /CXCR6, betennelse og kreft viser at CXCL16 er oppregulert på pre-neoplastiske lesjoner assosiert med betennelse, at ekspresjon av CXCL16 og CXCR6 kan induseres i prostata epitel av inflammatoriske cytokiner, og at CXCL16 /CXCR6 er størst i de prostatakreftceller omgitt ved reaktive, dvs. post-inflammatorisk stroma. Vi viste også at T-cellene i tilknytning til kreftceller uttrykke CXCL16 /CXCR6, som CXCL16 produseres fortrinnsvis av CD4
+ CXCR6
+ T-celler, og at CXCL16 kan forbedre spredning av T-celler. Til slutt viser vi CXCL16 i flere humane kreftformer assosiert med betennelse. Sammen våre data tyder på at CXCL16 og CXCR6 kan bidra til tumorprogresjon direkte gjennom effekter på kreftcellevekst, og indirekte ved å styrke leukocytt rekruttering og spredning og samspillet mellom leukocytter og premaligne /maligne celler.
Resultater
Ondartede prostata celler uttrykker CXCL16 og CXCR6
for å undersøke rollene til kjemokiner i prostatakreft, vi skjermet prostatakreftcellelinjer og transplantater for uttrykk av mRNA for 37 chemokiner, og fant at mRNA for CXCL16 var den mest gjennomgående uttrykte (figur 1 A, B). Celleoverflaten uttrykk for CXCL16 ble funnet på PC3, DU145 og 22Rv1 prostata cellelinjer (figur 1C). Immunhistokjemisk analyse av prostatavevet viste liten eller ingen farging for CXCL16 og lav farging for sin reseptor, CXCR6 i normal human prostata epitel, men fremstående uttrykk i kreft (figur 1D). I tillegg ble en korrelasjon mellom uttrykket nivåer av CXCL16 og CXCR6 funnet ved å analysere en oppstilling av førti tilfeller av prostatakreft, og kan vises CXCL16 og CXCR6 å være co-uttrykt på enkelte kreftceller ved immunfluorescens-konfokal mikroskopi (figur 1E) .
(A) uttrykket av mRNA for 37 kjemokiner ble studert ved RT-PCR i xenografter (CWR22, WISH PC14) og prostata tumorcellelinjer (PC3, DU145, LNCaP). Systematisk og ikke-systematiske navn for chemokiner vises. Amplikonene ble analysert ved agarosegel-elektroforese og visuell inspeksjon etter farging med etidiumbromid. Sekvenser av primere er tilgjengelig på forespørsel. Nivåene for ekspresjon ble evaluert som følger: ingen uttrykk (-), lav uttrykket (- +), moderat ekspresjon (+), og høy ekspresjon (++). Avhengig av kjemokinet, ble analysen utført fra en til fire ganger. (B) mRNA uttrykk av kjemokiner i prostata kreft cellelinjer. Uttrykket av mRNA for 14 kjemokiner ble studert ved real-time RT-PCR på fire prostata tumorcellelinjer (PC3, DU145, LNCaP, 22Rv1). Verdien av to
-ΔCT ble beregnet, og deretter normalisert til det høyeste tall for en gitt cellelinje, som ble gitt verdien 100, hvor ΔCT = CT (kjemokin) -CT (GAPDH). Tallene er gjennomsnitt av to bestemmelser fra en representant eksperiment av to utført. (C) Strømningscytometrisk analyse av overflateekspresjon av CXCL16 på prostata kreftcellelinjer. PC3, 22Rv1 og DU145 cellene ble inkubert uten primært antistoff (sort skyggelegging), med geite anti-human CCI4 som en ytterligere kontroll (lys grå linje), eller med geite-anti-humant CXCL16 (mørk grå linje) og deretter farget med kanin anti -goat IgG-FITC. Dataene er hentet fra en representant eksperiment av tre utført. (D) farging for CXCL16 og CXCR6 i prostatektomi prøver ved hjelp av DAB (brun) for påvisning er vist for: normal prostata og prostatakreft. Paneler er representative for over 80 prostatakreft sakene. Hvert panel har en H E flekk på venstre side. (E) Arrays inneholder prostatakreft vev fra 40 pasienter ble farget for CXCL16 og CXCR6. (I) Prøvene ble analysert som beskrevet i materialer og metoder, gruppert etter skår for CXCL16 på X-aksen (n = prøver i hvert CXCL16 gruppe), og gjennomsnittsverdier for CXCR6 uttrykk ble beregnet. Feilsøylene viser SEM. Sprosser indikerer sammenligninger som er viktige. *, P 0,05 og **, p 0,01. (II) immunfluorescens og confocal avbildning av en seksjon som viser prostatakreftceller viser anti-CXCL16 (488 tyramide) som grønn, anti-CXCR6 (594 tyramide) som rødt, og kjernefysiske farging med Hoechst 33258 som blå. Dobbel flekker i gule viser samlokalisering. Paneler er representative for mer enn 15 tilfeller av prostatakreft. Originale forstørrelser er kjent om disse og alle påfølgende photomicrographs.
Uttrykk for CXCL16 og CXCR6 korrelerer med kreft stadium og grad
Scenen (I-IV) og klasse (Gleason score) av prostatakreft bestemmes ved diagnose, og ble rapportert av leverandøren for de sakene som brukes i arrays. Høyere scenen tilsvarer større anatomiske forlengelse av kreft, og Gleason score beskriver histologiske karakteristika som korrelerer med klinisk utfall. Gleason score til 2-4 er lavgradig, score 5-7 er moderat grad, og scorer 8-10 er høyverdig prostatakreft. Analyse av 40-case array for nivåer av farging for CXCL16 og CXCR6 avslørte at deres uttrykk ved kreftcellene korrelerte med både høy-scenen og høyverdig prostatakreft (figur 2A).
(A) Arrays inneholder prostatakreft vev fra 40 pasienter ble farget for CXCL16 og CXCR6. Prøvene ble scoret for CXCL16 og CXCR6 uttrykk som beskrevet i materialer og metoder. Prøvene ble gruppert etter scene eller Gleason score (X-aksen) som bestemmes av leverandøren, og mener score for CXCL16 og CXCR6 uttrykk ble beregnet. Antall prøver (n) i hver fase eller Gleason score gruppen vises. Feilsøylene viser SEM. Sprosser indikerer sammenligninger som er viktige. *, P 0,05 og ***, p 0,001. (B) PC3 celler ble transfektert med CXCR6-YFP plasmid, dyrket i 48 timer uten chemokine (kontroll, ctrl) eller med 0,05-5 mg /ml CXCL16 og antall CXCR6-YFP
+ (R6YFP
+ ) vs. CXCR6YFP
– (R6YFP
-) celler ble regnet som beskrevet i materialer og metoder. Verdiene ble normalisert til kontroll, ubehandlet prøve, hvilket ga ganger forskjell i celleantall. Søylene viser gjennomsnitt ± SEM kombinert fra tre eksperimenter. **, P 0,01 og ***, p 0,001 vs. kontrollverdier. (C) Etter transfeksjon med den CXCR6-YFP plasmid, PC3-celler ble dyrket som i (B), uten eller med 5 ug /ml CXCL16. Venstre panel, er gating vist for å skille ubehandlede og CXCL16 behandlede celler til «lav» (L) eller «høy» (H) for CXCR6-YFP. Prosenter av cellene i de høye porter er vist. En representant eksperiment er vist ut av tre utført. Høyre panel, CXCR6-YFP
+ lav (CXCR6 + lav) og CXCR6-YFP
+ høy (CXCR6 + høy) celler fra CXCL16-behandlede og kontrollkulturer ble talt etter 48 timer som i (B). Data ble samlet fra tre eksperimenter. *, P 0,05 og ***, p 0,001 vs. ubehandlede celler. (D) Confocal avbildning viser anti-CXCL16 eller anti-CXCR6 (488 tyramide) som grønn, anti-Ki67 (594 tyramide) som rødt, og kjernefysiske farging med Hoechst 33258 som blå. Panel representerer mer enn 15 tilfeller.
En rolle for CXCL16 /CXCR6 i spredning av prostata kreft celler
Samtidig uttrykk for CXCL16 og CXCR6 på prostatakreftceller, og deres korrelasjon med kreft stadium og grad, antydet at liganden og reseptoren kan forbedre spredning gjennom en autokrin pathway. For å undersøke denne muligheten, transfektert vi PC3 celler med en CXCR6-YFP plasmid som koder for et CXCR6 C-terminal fusjonsprotein med en forbedret gul-grønn fluoriserende protein (YFP) og inkuberes cellene med CXCL16. Som vist i figur 2B, antallet CXCR6-YFP
+ -celler økes, sammenlignet med kontroll CXCR6-YFP
– celler, som en funksjon av konsentrasjonen av CXCL16. Vi har også analysert forholdet mellom ekspresjonsnivået av CXCR6-YFP og responsen på CXCL16. Vi fant at mens celler som uttrykker de høyeste nivåene av CXCR6-YFP var de mest lydhøre for CXCL16, økt CXCL16 spredning selv av de cellene som var CXCR6-YFP
lav (Figur 2C). I samsvar med disse in vitro data, kreftceller som uttrykker Ki67, en cellulær markør for spredning, også uttrykt både CXCL16 og CXCR6 (figur 2D).
Uttrykk for CXCL16 /CXCR6 er assosiert med betennelse
immunhistokjemisk analyse av flere prøver fra radikale prostatectomies viste fremstående uttrykk for CXCL16 og CXCR6 i kronisk prostatitt og i atrofi med tilhørende kronisk prostatitt (PIA), så vel som i prostata intraepitelial neoplasi (PIN) og kreft, noe som tyder på at ekspresjon av CXCL16 og CXCR6 videre prostata epitelceller er relatert til betennelse, i tillegg til en hvilken som helst forbindelse med malignitet og for seg (figur 3A). Vi har undersøkt dette forholdet in vitro ved å behandle kulturer av epitel (PREC) og stromale celler (PRSC) fra normal prostata med inflammatoriske cytokiner. TNF-α og IFN-γ, særlig i kombinasjon, indusert CXCL16 mRNA og CXCL16 sekresjon av Prec (men ikke stromale celler) (figur 3B, C) – og førte til dramatisk opp-regulering i Prec av mRNA for CXCR6 (figur 3D .)
(A) farging for CXCL16 og CXCR6 i prostatektomi prøver å bruke DAB (brun) for påvisning er vist for: kronisk prostatitt, PIA og PIN-kode. Paneler er representative for over 80 prostatakreft sakene. Hvert panel har en H E flekk på venstre side. (B) CXCL16 utskilles av primære normale epitelceller (Prec) og stromale celler (PRSC) og DU145 og PC3 cellelinjer ble målt 48 timer etter at ingen behandling (kontroll), eller behandling med 5 ng /ml IFN-γ og 0.5 pg /ml TNF-α alene og i kombinasjon. Søylene viser gjennomsnitt ± SEM fra to brønner, av én representant eksperiment av tre utført for hver av tre givere (D1-D3). *, P 0,05 og **, p 0,01 vs. ubehandlede celler. (C) CXCL16 mRNA-ekspresjon i Prec fra tre givere og to prostata tumorcellelinjer (DU145 og PC3) behandlet med 5 ng /ml IFN-γ og 0,5 pg /ml TNF-α alene og i kombinasjon ble analysert ved anvendelse av sanntids-RT -PCR. Verdiene ble normalisert ved å sette kontrollprøven med lavest uttrykk lik 1. Hver søyle representerer middelverdi ± SEM oppnådd fra to brønner, fra et representativt eksperiment av tre utført. **, P 0,01 vs. ubehandlede celler. (D) CXCR6 mRNA-ekspresjon i Prec fra tre givere som ble behandlet med 5 ng /ml IFN-γ og 0,5 pg /ml TNF-α alene og i kombinasjon ble analysert ved hjelp av sanntids-RT-PCR. Verdier ble normalisert ved å sette prøven med lavest uttrykk lik 1. **, p 0,01 vs. ubehandlede celler. (E) Hver rad inneholder seriesnitt fra de samme regionene prostatektomi prøver farget benytter DAB (brun) for αSMA, CXCL16, og CXCR6 inkludert en H E flekk på venstre side. Paneler er representative for over 120 prostata prøver. (F) Separate lysbilder av arrays som inneholder prostata vev fra 40 pasienter ble farget for αSMA, CXCL16 og CXCR6 og scoret som beskrevet i Materiale og metode for αSMA i stroma og CXCL16 og CXCR6 i kreftceller. Prøvene ble gruppert etter skår for CXCL16 eller CXCR6 (n = prøvene i hver gruppe), og gjennomsnittsskår ble beregnet for αSMA i stroma. Data er vist og analysert som i fig. 1E.I. *, P. 0,05
I tillegg til foreningen av CXCL16 /CXCR6 med inflammatoriske infiltrater i prostata, vår første inntrykk fra å analysere mer enn 80 tilfeller av prostatakreft var at uttrykk for CXCL16 var høyest i kreftceller omgitt av reaktiv stroma. Stroma er beskrevet som «reaktiv» hvis det viser økninger i myofibroblasts, til fibroblast glatte muskel-forhold og lokal vaskulær tetthet [36]. Dette skjer følgende betennelse, og identifiserer kreft, nå relativt dårlig i inflammatoriske celler, som har oppstått i en inflammatorisk mikro-miljø. Vi bekreftet vår første inntrykk ved farging seriesnitt for CXCL16, CXCR6 og alpha glatt muskulatur aktin (α-SMA), en markør for glatte muskelceller, som er tapt fra reaktiv stroma. Vi fant en sammenheng mellom tap av glatte muskelceller og høy uttrykk for CXCL16 og CXCR6 (figur 3E), som ble bekreftet ved å score prøver i 40-case array for α-SMA, CXCL16, og CXCR6 (figur 3F). Disse dataene støtter sammenhengen mellom uttrykk for CXCL16 og CXCR6 og bevis for forhånds betennelse i svulsten mikromiljøet. Sammen dataene i figur 3 foreslå en sterk sammenheng mellom uttrykk for CXCL16 /CXCR6 og betennelser i alle ledd i utviklingen av prostatakreft.
En rolle for CXCL16 /CXCR6 i samspillet mellom kreftceller og T-celler
De mulige direkte effekter av CXCL16 /CXCR6 på prostatakreftceller tross, fordi CXCR6 er best beskrives som en T-celle kjemokinreseptor undersøkte vi aktiviteter for CXCL16 /CXCR6 på prostata-kreft assosiert T-celler som kan bidra indirekte til dannelse og vekst av kreft. Immunofluorescent flekker avslørte at både CXCL16 og CXCR6 er uttrykt på CD3
+ celler i tilknytning til kreftceller (Figur 4A). Av interesse, fant vi at noen CD3
+ celler også farget for Ki67 (figur 4B), viser T-celledeling på svulststedet. Videre har doble farging for CXCR6 og Ki67 viste inflammatoriske celler som var positive for begge (figur 4C).
(A, B) Confocal avbildning viser anti-CXCL16 (A, venstre panel) eller anti-CXCR6 (A , panel høyre) eller anti-Ki67 (B) som grønn (488 tyramide), anti-CD3 (594 tyramide) som rødt, og kjernefysiske farging med Hoechst 33258 som blå. Dobbel flekker i gule viser samlokalisering. I (A), pilene peker på kreftceller og T-celler. Paneler er representative for mer enn 15 tilfeller for hver dobbelt flekken. (C) Farging for Ki67 og CXCR6 i en region av prostatitt ved bruk av DAB (brun, to venstre panel) eller immunofluorescens (høyre panel) for deteksjon. Confocal avbildning viser anti-CXCR6 som grønn (488 tyramide) og anti-Ki67 som red (594 tyramide), og kjernefysisk farging med Hoechst 33258 som blå. Panel representerer mer enn 15 tilfeller.
Vi vurderte om CXCL16 og CXCR6 kan fungere i en autokrin måte å forbedre T-celledeling analog til effekter på kreftceller. For å avgjøre hvorvidt CXCL16 kunne produseres ved CXCR6
+ celler, som finnes bare i effektor /minne undergruppe, vi sortert bestander av perifert blod CD4
+ T-celler basert på uttrykk for minne og naive markører og CXCR6. Etter aktivering
ex vivo
, fant vi at mRNA for CXCL16 ble indusert fortrinnsvis innenfor effektor /minne undergruppe, og innenfor denne undergruppe, i cellene uttrykker CXCR6 (figur 5A). Vi neste testet potensielle aktiviteter av CXCR6 på T-celler ved transfeksjon Jurkat E6.1 T-cellelinje med DNA som koder for CXCR6-YFP eller GFP. CXCR6-YFP
+, men ikke CXCR6-YFP
– celler, migrerte til CXCL16 i en G
i /o-protein avhengig måte (figur 5B), og viste en progressiv økning i antall celler med økende doser av CXCL16, men ikke til en styre kjemokin (figur 5C). CXCL16 hadde ingen effekt på celler transfektert for å uttrykke GFP som en ytterligere kontroll (data ikke vist). CXCL16 /CXCR6 forbedret spredning per se, siden vi så ingen effekt på celledød (figur 5D) og fant en økning spesielt i populasjon av celler som ble skillelinjene (figur 5E).
(A) CD4
+ T-celler ble sortert i naive (CD45RO-), total effektor /minne (CD45RO +), CD45RO
+ CXCR6
– (CXCR6-) og CD45RO
+ CXCR6
+ (CXCR6 +) undergrupper og stimulert med PMA og ionomycin i 4 timer før måling av nivåer av CXCL16 mRNA ved hjelp av sanntids-RT-PCR. Verdiene ble normalisert ved å sette prøven med lavest uttrykk lik 1. Dataene er gjennomsnitt fra duplikate prøver fra ett representativt eksperiment av tre utført. (B) Jurkat E6.1 T-celler transfektert med CXCR6-YFP plasmid ble analysert for migrering til CXCL16. Enkelte prøver ble pre-inkubert i to timer med 400 ng /ml pertussis toksin som angitt. Antall YFP + og YFP- trekkende celler ble analysert ved flowcytometri. Hver søyle representerer middelverdi ± SEM oppnådd fra triplikate brønner, fra et representativt eksperiment av tre utført. ***, P 0,001 vs. tilsvarende kontrollverdi. (C) Etter transfeksjon med den CXCR6-YFP plasmid, Jurkat E6.1 T-celler ble dyrket i 48 timer uten kjemokin (kontroll, ctrl) eller med 1 ug /ml CXCL8 som en ytterligere kontroll, eller med 0,05-5 ug /ml CXCL16 før telling antall CXCR6-YFP
+ vs. CXCR6-YFP
– celler. Søylene viser gjennomsnitt ± SEM kombinert fra tre forskjellige eksperimenter. *, P 0,05 og ***, p 0,001. (D) Transfekterte celler ble behandlet som i (C) og farget med Annexin V og propidiumjodid (PI) før telling av antall CXCR6-YFP
+ celler innenfor undergruppene som angitt. Søylene viser gjennomsnitt ± SEM kombinert fra tre eksperimenter. **, P 0,01 og ***, p 0,001 vs. kontroll ubehandlede celler. (E) Etter transfections med CXCR6-YFP plasmid, Jurkat E6.1 T-celler ble lastet med to mikrometer Far Red DDAO fargestoff og kultivert uten chemokine (kontroll, ctrl) eller med 0,05-5 mg /ml CXCL16 eller 1 mg /ml CXCL8 . Antall CXCR6YFP
+ vs. CXCR6YFP
+ DDAO
– (proliferated) og CXCR6YFP
+ DDAO
+ (non-proliferated) celler ble bestemt etter 48 timer ved hjelp av telle perler og flowcytometri . Søylene viser gjennomsnitt ± SEM fra tredoble brønner, fra en representant eksperiment av tre utført. ***, P 0,001 og *, p 0,05 vs. kontroll ubehandlede celler
Dessuten, når vi undersøkt effekten av plate-bundet CXCL16 på spredning av CD3-aktiverte primære CD4 T. celler, fant vi en betydelig stimulerende effekt på spredning som ble hemmet av behandling med pertussis toksin eller antistoffer mot CXCR6 eller CXCL16 (Figur 6A). Det er bemerkelsesverdig, gitt at CXCL16 blir syntetisert som et transmembran-kjemokin, at selv om platebundet CXCL16 var stimulatorisk, oppløselig CXCL16 hadde ingen effekt (data ikke vist).
(A) CD4
+ T-celler renset fra slemmes lymfocytter fra friske donorer ble stimulert i 3 dager med plate-bundet anti-CD3 (OKT3, 10 ug /ml) med eller uten 5 pg /ml plate bundet CXCL16 (bL16). Behandlinger av anti-CD3-aktiverte celler med PTX, anti-CXCR6 (AR6) og anti-CXCL16 (aL16) uten bL16 ble gjort som kontroller. Mus IgG (mIgG) og rotte-IgG (Rigg) ble anvendt som kontroller for anti-CXCR6-antistoff og anti-CXCL16 antistoff, respektivt. Søylene viser gjennomsnitt ± SEM fra en representant eksperiment av fem, ved hjelp av fem givere. Anti-CXCL16 ble anvendt i en total av fire, og anti-CXCR6 i to eksperimenter. ns, ikke signifikant og ***, p 0,001. (B) CXCR6 og CXCL16 mRNA ble målt ved real-time RT-PCR i CD3-aktiverte og ikke-aktiverte CD4
+ T-celler etter 3 dager. Verdiene ble normalisert ved å sette den ikke-aktiverte prøve med lavest uttrykk lik 1. linjer viser gjennomsnitt ± SEM kombin fra duplikate brønner fra syv forskjellige givere. **, P 0,01 og ***, p 0,001 vs ikke-aktiverte cellene. (C) Anti-CD3-aktiverte eller ikke-aktiverte CD4
+ T-celler ble analysert for migrering til CXCL16, uttrykt i prosent av inngangs celler migrerer. Hver søyle representerer middelverdi ± SEM oppnådd fra triplikate brønner fra et totalt tre eksperimenter utført. ***, P 0,001 på kryss barer er indikert for sammenligninger mellom aktiverte cellene – 0 vs 50 ng /ml CXCL16 og 50 ng /ml vs. 500 ng /ml CXCL16
Til tross for den. data for effekter av CXCL16 på aktiverte CD4
+ T-celler, kunne vi ikke påvise farging for CXCR6 ved hjelp av flowcytometri på en stor eller økt andel av disse cellene etter aktivering. Imidlertid, til støtte for funksjonell CXCR6 på disse cellene, har vi funnet en signifikant økning i mRNA-ekspresjon av CXCR6 og (i mindre grad) av CXCL16 i CD3-aktiverte celler (figur 6B), og en økning i migreringen av CD3-aktiverte celler å CXCL16 (figur 6C). Den doserespons i figur 6C har klokkeformede mønster typisk for chemotaxis.
CXCL16 og /eller CXCR6 er grovt uttrykt i betennelse-assosiert kreft
For å undersøke muligheten for en mer generell sammenheng mellom CXCL16 og betennelse-assosiert kreft, studerte vi ekspresjonen av CXCL16 i 582 tilfeller av kreft som omfatter 12 tumortyper (figur 7). Vi har funnet en forspenning for høy CXCL16 ekspresjon i kreftformer forbundet med betennelse.: Eggstokk, bryst, prostata, tykktarm og leverkreft
(A) * Intensiteten av fargingen ble bedømt CXCL16 som beskrevet i Materialer og Metoder. Den% av tilfellene flekker høy er vist for hver krefttype. ** RCC, nyrecellekarsinom; GBM, glioblastoma multiforme. (B) CXCL16 uttrykk i matriser av flere kreft hos mennesker ved immunhistokjemi bruker AEC (rød) eller DAB (brun) for deteksjon. Paneler er representative for antall eksemplarer av de ulike kreftformer som er oppført i (A).
Diskusjoner
Kreft oppstår genetiske mutasjoner og epigenetiske hendelser i prolifererende celler og endringer i svulsten mikromiljøet som inneholder kapillærer, glatte muskelceller, fibroblaster og inflammatoriske celler [4]. I 1863, den tyske legen Rudolf Virchow bemerket leukocytter i neoplastiske vev og en hypotese om at kreft begynner på områder av kronisk betennelse [37]. Likevel har kreft immunologer generelt sett på leukocytter som agenter med potensial til å begrense eller eliminere kreft [38]. Tilsvarende, i deres rolle som formidlere av leukocytt-rekruttering, kjemokiner har blitt studert som stimulatorer for anti-kreft-immunitet og inflammasjon [11], [39], [40].
Kroniske inflammatoriske tilstander har imidlertid vært vist seg å predisponere for flere krefttyper og tilbakevendende eller kronisk inflammasjon har vært implisert i en rekke humane cancere [5]. Nyere musemodeller har laget en funksjonell sammenheng mellom kreft og inflammasjon, som viser at delesjon av immunceller eller immunoregulatoriske gener redusere kreft progresjon [1] – [3]. Sammen utgjør disse dataene øke muligheten for en ytterligere rolle for pro-inflammatorisk chemokiner i kreft, nemlig som tumorpromotorer.
Vi undersøkte prostatakreft, som er beskrevet som oppstår i sammenheng med betennelse. Den foreløpige skjerm for chemokine ekspresjon foreslått en rolle for CXCL16, og vi har funnet at både CXCL16 og CXCR6 ble ko-uttrykt på kreftceller, at deres nivå av ekspresjon korrelerte med hverandre, og at disse nivåene også korrelert med høy-trinns og høy -grade prostatakreft. I tillegg CXCL16 økt spredning av prostatakreft cellelinjer som uttrykker CXCR6. Våre data tyder på mulige direkte effekter av CXCL16 /CXCR6 på kreftcellevekst og dermed på tumorutvikling.
I et annet aspekt av vår studie undersøkte vi potensielle roller for CXCL16 /CXCR6 innenfor rammen av den postulerte bidrag betennelse i premaligne og maligne sykdommer i prostata. Vi fant høy uttrykk for CXCL16 i kronisk prostatitt, pre-neoplastiske lesjoner, og primær prostatakreft omgitt av reaktive, dvs. post-inflammatorisk stroma. Videre TNF-α og IFN-γ indusert ekspresjon av CXCL16 og CXCR6 på primær prostata epitelceller. I tillegg har vi funnet signifikante sammenhenger mellom tilstedeværelsen av reaktive stroma og høyt nivå uttrykk for CXCL16 og CXCR6 i kreftceller. Disse resultatene antydet at oppregulering av CXCL16 /CXCR6 i prostata epitel er sterkt assosiert med både nåværende og tidligere betennelse i prostata stroma.
I en tredje del av vår studie undersøkte vi potensielle roller for CXCL16 og CXCR6 på tumorassosierte lymfocytter. Vi fant ut at CXCL16 og CXCR6 er uttrykt på T-celler ved siden av prostata kreft celler. Vi har vist at CXCL16 kan induseres fortrinnsvis i CXCR6
+ CD4
+ primære T-celler, og at Jurkat T-celler transfektert for å uttrykke CXCR6 samt aktivert, primær CD4
+ T-celler proliferert i nærvær av CXCL16. Disse dataene antyder mulighet for både autokrine og parakrine effekter av CXCL16 på infiltrerende T-celler så vel som på pre-maligne og /eller maligne prostataceller.
Til slutt, for å undersøke en mer generell sammenheng mellom CXCL16 og inflammation- tilknyttede kreft, studerte vi uttrykk for dette chemokin i prøver fra flere typer kreft hos mennesker. Vi har funnet høye ekspresjonsnivåer av CXCL16 i kreft i eggstokk, bryst, prostata, tykktarm og lever -. Alle krefttyper som er beskrevet som oppstår i sammenheng med betennelse
CXCL16 tidligere er blitt beskrevet på humane hjernesvulst, tykktarm og bryst kreft, og CXCR6 ble rapportert i nasofaryngeale kreft og melanom [41] – [46]. Flere andre aviser har nylig dukket opp undersøke CXCL16 og /eller CXCR6 i kreft [45] – [50]. Flere av disse rapportene fokusert på CXCR6 i prostata kreft, og som vår viste høy uttrykk for CXCR6 i prostatakreftceller [47] – [49]. En papir, også som vårt, viste en positiv sammenheng mellom CXCR6 nivåer og Gleason score, rapporterte CXCL16 uttrykk i prostatakreft, og viste økt utskillelse av CXCL16 fra prostata cellelinjer etter behandling med TNF-α [47]. En annen papir viste effekter på invasjonen av prostata linjer til løselig CXCL16 [48]. En tredje papir viste effektene av CXCR6 på veksten av prostatacancercellelinjer hos mus [49]. Samlet sett våre funn tyder på pro-tumorigene roller for CXCL16 og CXCR6 i prostata kreft er i samsvar med disse publiserte rapporter.
