Abstract
CPV1 (også kalt COPV) er en papillomavirus ansvarlig for oral papillomatosis hos unge hunder. Involvering av denne virustypen i muntlig onkogenese har vært en teori i muntlig plateepitelkarsinom (SCCS), men har aldri blitt undersøkt i andre neoplastiske og hyperplastic munnsår av hunder. Hensikten med denne studien var å undersøke tilstedeværelsen av CPV1 i forskjellige neoplastiske og hyperplastic lesjoner for å vurdere sin rolle i canine oral onkogenese; i henhold til de resultater som er oppnådd, en andre Hensikten med studien var å definere om hunden kan anses som en gyldig dyremodell for muntlige høyrisiko HPV-indusert svulster. Åtti-åtte formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) canine munnsår inkludert 78 orale svulster (papillomer, SCCS, melanomer, ameloblastomas, oral adenokarsinomer) og 10 hyperplastic lesjoner (gingival hyperplasi) ble undersøkt med immunhistokjemi for tilstedeværelse av papillomavirus L1 protein og med real-Time PCR for CPV1 DNA. RT-PCR for RNA ble utført på utvalgte prøver. Alle virus papillomer testet var positive for immunhistokjemi og Real-time PCR. I 3/33 (10%) SCCS, ble viral DNA påvist, men ingen virus-RNA ble funnet. Ingen positivitet ble observert både med immunhistokjemi og Real-Time PCR i de andre hyperplastiske og neoplastiske lesjoner i munnhulen av hunder. Selv om funn av CPV1 DNA i noen SCCS i ansiktet av en negativ immunhistokjemi kan støtte hypotesen om en mislykket infeksjon i utviklingen av disse lesjonene, fravær av viral RNA påpeker at CPV1 representerer mer sannsynlig en uskyldig tilskuer i SCC onkogenese. Studien viser en sterk sammenheng mellom CPV1 og muntlig virus papillomer mens viral bidrag til patogenesen av andre orale lesjoner virker usannsynlig. Videre tyder det på at en hundemodell av CPV1 infeksjon for HPV-indusert onkogenese kan være upassende
Citation. Porcellato jeg, Brachelente C, Guelfi G, Nato A, Sforna M, Bongiovanni L, et al. (2014) En retrospektiv undersøkelse på Canine papillomavirus 1 (CPV1) i Oral Oncogenesis avslører Hunder er ikke en egnet dyremodell for høyrisiko HPV-indusert Oral Cancer. PLoS ONE 9 (11): e112833. doi: 10,1371 /journal.pone.0112833
Redaktør: Xuefeng Liu, Georgetown University, USA
mottatt: 9 juni 2014; Godkjent: 16 oktober 2014; Publisert: 17.11.2014
Copyright: © 2014 Porcellato et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Papillomavirus (PV) er en gruppe virus som tilhører
Papillomaviridae
familie som er svært artsspesifikke som kan påvirke pattedyr, fugler og krypdyr [1] . PV har en sirkulær dobbeltkjedet DNA-genom omtrent 8 kb i størrelse som typisk inneholder åtte ORF (åpne leserammer), koding tidlig (E1, E2, E4, E5, E6 og E7) og sen (L1 og L2) virusproteiner [ ,,,0],2], [3]. E1 er en DNA-helikase essensielt for replikasjonen og forsterkningen av det virale episom i kjernen av infiserte celler [4]. E2-proteiner delta i initiering av viral DNA replikasjon, men er dreibare i transkripsjonsregulering, og oppdeling av virusgenomet, så vel [5]. E6 og E7 teinene er ansvarlig for mobilnettet spredning og transformasjonsprosesser, med E7 blir anerkjent som en av de mest effektive cellesyklusen deregulator [6]. E4, E5 sammen med, er involvert i reguleringen av virusgenomet forsterkning, og representerer den mest rikelig transkriptet i produktiv lesjoner [7], [8]. Sene-proteiner (L1, L2) koder for de strukturelle proteiner av virus kapsid, som er grunnleggende for gjennomføring av PV livssyklus [8]. HPV (humant papillomavirus) er klassifisert i hud- og slimhinnetyper basert på deres tropisme for hud eller slimhinne epitel, henholdsvis, og kan enten vedvarer asymptomatically eller forårsake godartede hyperproliferative sykdommer eller malignitet [2], [9]. Slimhinne HPV kan underklassifiseres i høy-risiko og lav risiko typer med hensyn til deres tilknytning til kreftutvikling [10]. Denne klassifiseringen ble først kun basert på epidemiologiske data og senere bekreftet med flere bevis fra in vitro [11]. Mer enn 170 typer av HPV er blitt identifisert hittil, mens det i hjørnetann medisin bare 14 typer CPVs (Canine Papillomavirus) er kjent på dette tidspunkt [12], [13]. Rollen til CPVs i patogenesen av kreft har ikke vært tydelig klarlagt, og ingen av canine virustypene har vært knyttet til et spesielt kreft enhet. Tvert imot, i human medisin det onkogene rollen høyrisiko HPV-typer så som HPV-16 og HPV-18 er velkjent og er ansett å bidra til over 70% av livmorhalskreft [14]. Mer nylig har HPV-infeksjon vært forbundet også med hode og nakke kreft, særlig med plateepitelkarsinom orofarynx [15], [16]. Hos hunder, den første PV typen dokumentert er agens for canine oral papillomatosis, opprinnelig kalt COPV (Canine Oral papillomavirus) og nylig omdøpt CPV1 [2], [17]. DNA fra dette virus er 8607 basepar i lengde, og derfor er den største PV sekvensert [18]. Selv om ordningen av CPV1 genomet er lik de andre PV, mangler det E5-regionen og det er karakterisert ved en lang andre ikke-kodende region [19]. Canine oral papillomatosis forårsaket av CPV1 er hyppigere hos hunder på ca ett års alder og vanligvis forårsaker blomkål-lignende exophytic vorter; til tider, kan svulster også kantet eller nodulær. Lesjoner er normalt lokalisert på munnslimhinnen, lepper og slimhinnene veikryss, men er ikke begrenset til disse nettstedene [17]. De vanligvis gjennomgå spontan regresjon som er forbundet med en overveiende infiltrering av CD4 + og CD8 + lymfocytter [20]. Selv CPV1 er vanligvis knyttet til godartede og spontant tilbakegang papillomer, har denne viral typen er tidvis rapportert i ikke-tilbakegang lesjoner, særlig i muntlig og perioral plateepitelkarsinom [21], [22]. I de senere år har tilstedeværelsen av HPV DNA blitt vidt undersøkt og påvist i forskjellige orale tumorer så som karsinomer [23], ameloblastoma [24], spyttkjertel karsinom [25], [26], så vel som i kutant melanom [27] og andre tumorer [28], [29], [30]. Målet med denne studien var å undersøke ulike canine muntlig svulster og hyperplastic lesjoner for tilstedeværelse av CPV1 DNA og RNA samt virusantigen lokalisering i lesjoner. Vurdere viral utbredelse i muntlig neoplastiske hendelser i hundene kunne gi viktig innsikt i hvilken rolle denne spesifikke virustype i canine oral onkogenese og på nytten av hundemodell for oral HPV-indusert onkogenese hos mennesker. Denne undersøkelsen ble utført på svulster i epitelial opprinnelse, for eksempel plateepitelkarsinom, ameloblastomas og muntlig adenokarsinomer. En gruppe av melanomer, som er de mest vanlige og invasive muntlig kreft hos hund, ble også vurdert i denne studien. Dessuten, siden det er generelt akseptert at PV avhenge av epitelial differensiering for gjennomføring av sin livssyklus [8], denne studien inkluderte også en gruppe av gingivale hyperplastiske forandringer. Rutinemessig histologi, immunhistokjemi og Real-Time PCR ble brukt i denne studien. Vår studie fokusert på rollen CPV1 i oral onkogenese gjennom retrospektive immunhistokjemisk og molekylær analyse av et bredt spekter av neoplastiske og ikke-neoplastiske munnsår.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne retrospektive studien ble utført på FFPE eksemplarer tidligere sendt til våre avdelinger for histopatologisk diagnose og derfor var nødvendig uten godkjenning fra etisk komité.
Prøve utvalg og histopatologi
Tjueto papillomer (Ps), 33 plateepitelkarsinom (SCCS), 11 melanomer (MS), 10 ameloblastomas (AMS), 2 muntlige adenokarsinomer (ACS) og 10 tilfeller av gingival hypertrofi /hyperplasi (GH), samlet 2005-2012, ble valgt fra arkivene til Department of Veterinary Medicine (Universitetet i Perugia, Italia), og ved fakultet for veterinærmedisin (Universitetet i Teramo, Italia). Diagnosen ble revidert av 2 patologer på hematoksylin-eosin lysbilder. Papillomer ble deretter klassifisert i viral papillomer (VPS) og plateepitel papillomer (SPS). VP ble diagnostisert basert på tilstedeværelsen av typiske histologiske trekk som tyder på virale cytopatiske effekter som epitelproliferasjon, koilocytosis, hypergranulosis, hyperkeratose og tilstedeværelsen av inklusjonslegemer.
Immunohistochemistry
Deler av 2 mikrometer ble kuttet fra 88 formalinfiksert og parafininnstøpte (FFPE) prøver og montert på positive ladede lysbilder. Immunhistokjemi ble utført ved hjelp av en kanin polyklonale antistoff mot høyt konservert L1 kapsid protein av BPV1 (1:200 fortynning, Anti-Bovine papillomavirus /BPV1, BO580 DakoCytomation, Glostrup, Danmark), som rapportert i andre studier [31]. Kort sagt ble FFPE vevssnitt deparaffinized, rehydrert og vasket i destillert vann. Ingen antigen gjenfinning ble utført. Endogen peroksidase ble blokkert med 3% H
2o
2 i 8 minutter ved romtemperatur. Objektglassene ble deretter vasket i TBS og inkubert med det primære antistoff i 1 time i et fuktet kammer ved romtemperatur. Glassene ble inkubert med sekundært biotinylert universell sekundært antistoff, etterfulgt av sekvensiell inkubering med peroksidase-merket streptavidin (LSAB + /System-HRP, Dako, Glostrup, Danmark). Tre-amino-ni-etylkarbazol ble brukt som kromogen (AEC + Substrat-kromogen klar til bruk, Dako, Glostrup, Danmark) og Carazzi er hematoxylin som counterstain. Dekk ble montert med vandig montering medium. Negative kontroller ble behandlet på samme måte, å utelate det primære antistoff og inkubering vevssnitt med TBS. Positive kontroller ble hentet fra storfe kutane papillomer
Grunning design
prober ble utformet på rapporterte sekvens av CPV1. [GenBank: L22695.1] spesielt på fire mål ORF: E4, E7, L1 og L2. Blant tidlig viral produkter, ble E4 valgt som et mål-gen på grunn av sin høye ekspresjon (så høy som 30% av det totale proteininnhold i noen produktive vorter) i produktive lesjoner og E7 på grunn av sin føres onkogen rolle [6], [7 ]. L1 og L2, på slutten av proteinene, ble tatt med på grunn av deres nøkkelrolle ved fullføringen av PV virale syklusen [8]. For påvisning av hver virale gen, forover og revers primere og prober ble utformet (tabell 1). Prober for E4, E7 og L1 var egnet også for viral RNA deteksjon. De designede primere ble verifisert ved NCBI blast analyse og ClustalW justering analyse for å sikre spesifisitet.
Nukleinsyre utvinning
DNA og RNA ekstraksjon ble gjennomført fra 5 pm parafinsnitt med en kommersiell kit følge produsentens instruksjoner (Wizard Genomisk DNA rensing kit, Promega, Milano, Italia og RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation kit, Ambion, Austin, Texas). Total DNA og RNA ble kvantifisert med en fluorometer (qubit 2,0, Invitrogen, Carlsbad, California) med en høy følsomhet kommersielt sett (qubit dsDNA HS eller RNA HS Assay Kit, Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner.
Reverse Transcription
Om 20 ng av total RNA ble revers transkribert i 20 mL av iSCRIPT cDNA (BioRad, Hercules, CA) ved hjelp av tilfeldige heksamer henhold til produsentens forslag. Ingen-RT kontroller ble inkludert for å sjekke for genomisk DNA-kontaminering.
DNA og cDNA Real-Time PCR
Ifølge produsentens forslag, 4 mL av DNA (30-50 ng) eller 4 ul cDNA (1-10 ng) ble forsterket ved hjelp av 12,5 mL av Hot-Rescue real-Time mester mix (Diatheva, Fano, Italia), 0,125 mL av Hot-Rescue DNA Polymerase (Diatheva Fano, Italia), 5 pmol av sonde , 10 pmol primere (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA), og DNAse /RNase-fritt vann til 25 mL. Alle PCR-reaksjoner ble utført på en Bio-Rad iCycler Real-Time PCR med en første inkubasjon ved 95 ° C i 15 min, etterfulgt av 45 sykluser ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt, under hvilken fluorescens data ble oppsamlet. Hver prøve ble kjørt i triplikat, og resultatene ble beregnet. Den Ct ble automatisk beregnet ved hver kurve. Eksempel amplifisering fidelity ble bekreftet ved agarosegelelektroforese. PCR-produktene ble renset og sekvensert ved QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen, Valencia, CA). De 18S ble anvendt som endogene kontroll for å normalisere prøve variasjoner i mengden av utgangs RNA prøver som tidligere rapportert [32]. For hver PCR-kjøring, ble templat-kontroller og Nort kontroller inkludert for å fastslå fravær av forurensende gDNA.
Resultater
Histologi og immunhistokjemi
Med histologisk undersøkelse på rutinemessig fargete snitt, papillomer ble klassifisert i VPs (15/22) og SPs (7/22) vurdere tilstedeværelsen av karakteristiske cytopatiske trekk ved PV infeksjon (epidermal spredning, koilocytosis, hypergranulosis, hyperkeratose og inklusjonslegemer) (figur 1). Et tilfelle med mild hypergranulosis og fokal hyperkeratose var vanskelig å klassifisere som følge av mangel på inklusjonslegemer og av koilocytes. Men etter serie seksjonering, ble sporadiske koilocytes observert og saken ble klassifisert som en VP. Histologiske kjennetegn SPs og VPS er vist i tabell S1. Positiv intranuclear farging bekreftet alle VPs tidligere diagnostiserte på HE farget seksjoner (figur 2). Positive celler ble lokalisert spesielt i de sprikende epidermis og ofte i områder der det epitel ble karakterisert ved alvorlig hypergranulosis. Kun i ett tilfelle ble immunomerking hovedsakelig sett i overfladiske desquamating celler. Alle de andre svulster og hyperplastic lesjoner var negative for PV farging. Likevel ble en fint kornet cytoplasma farging påvist i fem tilfeller av SCCS
H . E; 40x
AEC og Carazzi er hematoxylin.; 40x.
Real-Time PCR oppformering av DNA og RNA
DNA-ekstraksjon utbytte varierte 50-90 ng /mL og RNA konsentrasjonen var 20 ng /mL. Bekrefte immunhistokjemiske resultatene, Real-Time PCR oppdaget virus-DNA i alle 15 VPS. Vps var positive for alle de fire probene er spesielt utviklet for påvisning av CPV1. Tre av SCCS 33 førte positive for tilstedeværelse av DNA CPV1 med alle de fire sonder som ble testet. Ingen overlappende med de fem SCCS med fint cytoplasma farging ble dokumentert. Sekvensering av alle amplikonene vist en fullstendig identitet (100%) til sekvensen i GenBank database (tilgangsnummer L22695.1). Ingen virus-DNA ble forsterket i alle AMer, Ms, ACs og GH testet. Real-Time PCR for cDNA ble utført på et utvalg av 5 VPs, 5 SPs, 8 SCCS, hvorav 3 var de positive til CPV1 viral DNA. Kriteriene for valg av prøvene som skal testes var basert på tilgjengeligheten av materiale for RNA-ekstraksjon, etter tidligere tester var utført. For de 3 tilfeller av SCCS positive for viral DNA, ble mengden av vev begrenset ( 1 mm
2 seksjoner). I disse tilfellene total mRNA mengden var meget lav (ca. 1 ng /mL) på grunn av knappe gjenværende vev etter tidligere tester. Virale papillomer ble anvendt som en positiv kontroll og viralt mRNA ble hentet i dem alle. De tre SCCS positive for viral DNA var i stedet negativ. Utvinning av RNA og analyse eksperimenter ble gjentatt to ganger for å vurdere resultatet og utelukke miljøforurensning. Resultater av Real-Time PCR er vist i tabell 2.
Histologiske kjennetegn CPV1-forbundet SCCS
Undersøkelsen av CPV1 positiv SCCS ikke viser særegne histologiske kjennetegn som kan være mistenkelig av papillomavirus infeksjon, sammenlignet med gruppen av CPV1 negative SCCS (tabell S2).
Diskusjoner
Denne studien evaluerte tilstedeværelsen av CPV1 i ulike hyperplastiske /neoplastiske canine munnsår, for å undersøke hvilken rolle dette viruset i muntlig onkogenese. I humanmedisin har oncogenetic rollen som høyrisiko HPV er vist for livmorhalskreft [16], og mer bevissthet vokser for sin rolle i patogenesen av hode og nakke SCCS [15]. Den økende vederlaget til studiet av musikkvideoer i veterinærmedisin er begrunnet både av den økende oppmerksomhet for dyrehelse og med muligheten for å bruke hunden som en eksperimentell modell for å studere samspillet mellom PV infeksjon og kreftutvikling hos mennesker [33], [ ,,,0],34]. Til tross for dette, er lite informasjon tilgjengelig om utbredelsen av CPVs i hjørnetann svulster. Med denne studien vi påpekt at CPV1 er sterkt assosiert med vps i hunder i muntlige og perioral nettsteder. Videre har vi observert at tilstedeværelsen av virus-DNA bare i tre SCCS, mens ingen viralt mRNA ble funnet å demonstrere viral aktivitet. Dette resultatet bekrefter det som er beskrevet i veterinær litteraturen [22], [35] over den lave potensialet for malign transformasjon forbundet med CPV1 infeksjon. Basert på våre data, bør hunden ikke brukes som modell for studiet av maligne lesjoner forårsaket av høyrisiko genotyper av HPV.
Resultatene er hentet fra histologisk evaluering av alle de muntlige papillomer inkludert i den nåværende studien viste at koilocytosis og hypergranulosis var mer tydelig i VPs forhold til SPs. Men 2/7 SPs viste mild eller moderat hypergranulosis, så dette morfologiske aspektet alene ikke kan betraktes som en pålitelig indikator for viral infeksjon. I henhold til våre resultater, tilstedeværelse av koilocytes og inklusjonslegemer er den viktigste histopatologiske tegn av den virale tilstedeværelse. Immunhistokjemi var nyttig ikke bare for å bekrefte histologisk klassifisering og å vurdere den fasen av infeksjonen, men var spesielt nyttig i tilfeller av sen fase PV infeksjon der koilocytosis og inklusjonslegemer ikke var tydelig histologisk. I disse tilfellene ble immunolabeling begrenset til desquamating celler i overhuden. Den cytoplasmatiske positivitet påtruffet i fem SCCS, spesielt i områder med plateepitel differensiering, ble tolket som en gjenstand, på grunn av det faktum at disse svulstene var negative for DNA forsterkning.
Real-Time PCR bekreftet tilstedeværelsen av både CPV1 DNA i alle de 15 vps av studien og av viral mRNA i de fem utvalgte VPs testet. Dette bekrefter en sterk sammenheng mellom CPV1 og VPS. I vår studie, var de fleste VPs oppdaget på slimhinnene veikryss og bare ett tilfelle ble vevsprøve fra huden på haken, i samsvar med tidligere studier rapporterer om mulig CPV1 i kutane lesjoner [17], [22], [36]. Derfor CPV1 synes å vise en mindre markert tropisme for slimhinnene i forhold til alfa-HPV, som omfatter høyrisiko typer. Alfa-HPV-infeksjoner faktisk er generelt begrenset til munnslimhinnen, og kan sjelden finnes i kutane lesjoner [37], [38], [39].
Til tross for fraværet av PV-immunomerking, PCR avslørte tilstedeværelsen av viral DNA i 3/33 SCCS testet. Dette begrenset antall CPV1 DNA positive tilfeller ikke tillater oss å trekke statistisk signifikante konklusjoner om mulige histomorphologic kriterier som kan være forbundet med tilstedeværelse av viruset. Hver av de tre tilfellene viste forskjellige histologiske grad av differensiering, celle atypia og betennelse. Verdt å merke er at jakten på viral mRNA i disse tre SCCS positive for CPV1 DNA ikke gi positive resultater. Ulike hypoteser kan gjøres for å rettferdiggjøre dette resultatet. Først av alt, mengden av materiale fra FFPE- biopsi av SCCS var svært begrenset når kuttet for RNA-ekstraksjon og dette kan ha ført til en svært lav mengde viral mRNA på total mRNA pakket ut, ikke slik at forsterkning av Real-Time PCR. På den annen side, ettersom positivitet for viralt mRNA ble funnet i alle VPS anvendt som en positiv kontroll, kan vi anta at CPV1 kan tolkes som en uskyldig bystander i sammenheng med SCCS. Selv om frisk hud hos mennesker og hunder kan fungere som et potensielt reservoar for PV-infeksjon [40], [41] eksemplarer av denne studien hadde tidligere blitt behandlet med formalin, derfor hypotesen om en overfladisk forurensning synes usannsynlig.
En negativ PV-immunomerking forbundet med resultatene negative real-Time PCR (både for viral DNA og mRNA) i alle de andre lesjoner (hyperplastiske og neoplastiske) inkludert i denne studien tyder på at CPV1 har sannsynligvis ingen rolle i patogenesen av canine oral lesjoner forskjellig fra VPS.
Som konklusjon, med denne studien undersøkte vi rolle CPV1 i et bredt spekter av forskjellige neoplastiske og hyperplastiske lesjoner som oppstår i munnhulen hos hund. CPV1 var sterkt assosiert med VPS. Siden tilstedeværelse og transkripsjonen aktivitet av CPV1 har bare blitt påvist for vps, virker det usannsynlig at CPV utgjør en høy risiko for neoplastisk progresjon. I tillegg til å utvide antallet tilfeller som ble testet for tilstedeværelse av CPV1, ville det være viktig å undersøke rollen til andre typer av CPVs i patogenesen av de mest vanlige kreftformer i munnhulen hos hunder. Tatt i betraktning våre resultater, tror vi at CPV1-induserte lesjoner har en lav risiko for ondartet progresjon og at bruk av CPV1 som modell for HPV-assosiert hode- og halskreft er derfor ikke støttes av våre data, særlig ettersom forekomsten av CPV1 i testet SCCS var veldig lavt.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Histologiske kjennetegn ved de 22 plateepitel og virus papillomer i denne studien. Funksjoner av forskjellige svulster ble gradert: 1 = svak /mild; 2 = moderat; . 3 = høy /alvorlig
doi: 10,1371 /journal.pone.0112833.s001 plakater (docx)
Tabell S2.
Histologiske kjennetegn ved de 33 SCCS av denne studien. IB = inklusjonslegemer; IHC = immunhistokjemi. Funksjoner av forskjellige svulster ble gradert: 1 = svak /mild; 2 = moderat; 3 = høy /alvorlig. Immunhistokjemi analyser med usikkert resultat (?) Ble klassifisert som negative og usikre positivitet støtt ble ansett som en gjenstand. N /A = ikke utført på grunn av snaut materialet tilgjengelig for RNA ekstraksjon
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0112833.s002 plakater (DOCX)
bekreftelser
Forfatterne ønsker å takke dr Emilia del Rossi og Luca Stefanelli for deres innsats og teknisk støtte for denne studien.
