Abstract
Bruk av tyrosinkinasehemmere (TKI) mot EGFR /c- møtt i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) har vist seg å være effektiv i å øke pasient progresjon overlevelse (PFS), men deres effekt er begrenset på grunn av utviklingen av resistens og tumorresidiv. Derfor forstå de molekylære mekanismene bak utvikling av resistens i NSCLC er nødvendig for å utvikle nye og effektive terapeutiske tilnærminger for å forbedre pasientens utfall. Denne studien tar sikte på å forstå mekanismen for EGFR /c-Met tyrosinkinaseinhibitor (TKI) motstand i NSCLC. H2170 og H358-cellelinjer ble gjort motstandsdyktige mot SU11274, en c-Met-inhibitor, og erlotinib, en EGFR inhibitor, ved trinnvise økninger i TKI eksponering. IC
50 konsentrasjoner av resistente linjer viste en 4-5 og 11-22-ganger økning for SU11274 og erlotinib, respektivt, når sammenlignet med foreldrelinjene. Videre mTOR og Wnt signalering ble undersøkt i begge cellelinjer for å bestemme deres rolle i mediering TKI motstand. Vi observerte en 2-4-fold oppregulering av mTOR signal proteiner og en 2- til 8-fold oppregulering av Wnt signalproteiner i H2170 erlotinib og SU11274 resistente celler. H2170 og H358-celler ble ytterligere behandlet med mTOR-hemmer everolimus og Wnt inhibitor XAV939. H358 resistente celler ble hemmet med 95% av en trippel kombinasjon av everolimus, erlotinib og SU11274 i forhold til 34% av en dobbel kombinasjon av disse stoffene. Sperre H2170-celler viste ingen følsomhet for XAV939, mens resistente celler ble hemmet signifikant (39%) av XAV939 som et enkelt middel, så vel som i kombinasjon med SU11274 og erlotinib. Lignende resultater ble oppnådd med H358-resistente celler. Denne studien tyder på en roman molekylære mekanismen av resistens i lungekreft
Citation. Fong JT, Jacobs RJ, Moravec DN, Uppada SB, Botting GM, Nlend M, et al. (2013) Alternative signalveier som potensielle terapeutiske mål for Vinne EGFR og c-Met Inhibitor Resistance i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (11): e78398. doi: 10,1371 /journal.pone.0078398
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 03.04.2013; Godkjent: 11 september 2013; Publisert: 04.11.2013
Copyright: © 2013 Fong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold award nummer R21CA158965-01A1 https://www.nih.gov til Neelu Puri. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Dr. Marie Nlend er ansatt av Thermo Fisher Scientific . Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
EGFR og c-Met er både svært uttrykt i NSCLC-tumorer og deler felles signalveier [1] – [3]. Mens TKI mot EGFR og c-Met, er banebrytende cancerterapi, er deres individuelle efficacies begrenset [4] på grunn av utviklingen av resistens [5]. c-Met forsterkning står for mer enn 20% av ervervet resistens mot EGFR TKI i NSCLC både
in vitro Hotell og
in vivo product: [6], [7]. Videre utvikling av sekundære «gatekeeper» mutasjon T790M står for 50% av all ervervet resistens mot EGFR TKI både
in vitro Hotell og
in vivo product: [8]. Også, dens tilstedeværelse før behandling med TKI resulterer i primær motstand mot EGFR-TKI terapi [9]. Derfor, for å undersøke mekanismer for resistens er det viktig å gjennomføre ytterligere
in vitro-studier for å bestemme
target-proteiner som er ansvarlige for TKI motstand i NSCLC.
SU11274 er en ATP-konkurrerende lite molekyl inhibitor av katalytiske aktiviteten til c-Met [10] og er effektiv mot NSCLC [11]. Tivantinib, en c-Met TKI som hemmer tumorvekst i mus [12], er for tiden i fase III kliniske studier og har vist seg å øke PFS fra 9,7 til 16,1 uker når gitt i kombinasjon med erlotinib [13], [14]. I disse studiene bare visse pasient undergrupper (KRAS mutanter, ikke-plateepitel histologi og EGFR villtype status) viste signifikant økt PFS [14], noe som tyder på at nye TKI må legges til denne kombinasjonen. I tillegg behandling med en kombinasjon av MetMab (anti c-Met mAb) og erlotinib reduserte risikoen for død med tre ganger i bare en undergruppe av pasienter positive for c-Met uttrykk [15]. Mens bruken av kombinerte terapi modaliteter kan begrense muligheten for svulster til å utvikle resistens [7], forstå mekanismen av resistens er den beste tilnærmingen for å forbedre målrettet terapi [16].
Studier av vår gruppe og andre indikerer at c-Met og EGFR har betydelig crosstalk som øker effektiviteten for TKI kombinasjoner
in vitro product: [1], [17]. Dette skyldes det faktum at HGF kan transactivate EGFR og fosforylering av EGFR kan aktivere c-Met resulterer i synergistiske effekter på tumorvekst [18] – [20]. Derfor undersøkte vi en ny terapeutisk tilnærming for å overvinne motstanden mot EGFR, c-Met og EGFR /c-Met TKI kombinasjonsterapier i NSCLC. For ytterligere å forstå hvordan cellene utvikler denne motstand vi utviklet H2170 og H358 NSCLC-cellelinjer med ervervet resistens mot TKI av c-Met, og EGFR en kombinasjon av begge. Disse cellelinjene ble valgt fordi de uttrykker høye nivåer av EGFR og c-Met, er synergi hemmet av EGFR /c-Met TKI og ikke har pre-eksisterende EGFR eller c-Met motstand forårsaker mutasjoner.
Forrige studier har vist økte effektivitet med kombinasjonsterapier sammenlignet med monoterapiene [13], [14], [21] – [24]. Den mTOR-hemmer rapamycin er i stand til å samarbeide med c-Met inhibitor PHA665752 i NSCLC [25]. Videre, ved hjelp av erlotinib og rapamycin eller everolimus (en oralt administrert derivat av rapamycin) i kombinasjon har vist synergieffekter på celle levedyktighet, spredning og autofagi [26], [27]. Denne kombinasjonen ble også vist å gjenopprette gefitinib følsomhet [28]. Men disse studiene bare administrert EGFR og mTOR-inhibitorer i kombinasjon. I våre undersøkelser har vi funnet at mTOR-inhibitorer kan øke effektiviteten av EGFR /c-Met-TKI kombinasjonsbehandling for NSCLC
in vitro
. Videre har det blitt foreslått at krysstale mellom EGFR og Wnt bane kan delta i begynnelse og progresjon av tumorigenese og krysstale mellom ligander for separate RTK-mediert veier kan legge til rette for resistens mot TKI [29]. Hyperaktivitet av Wnt i brystkreft har vist seg å transactivate EGFR og omvendt, kan aktivert EGFR bidra til økt effekt av den kanoniske Wnt veien [30] – [33]. I tillegg har studier på pasienttumorsnitt vist en positiv sammenheng mellom EGFR aktiverende mutasjoner og kjerne akkumulering av β-catenin i grunnskolen NSCLC [34]. Det har også vist seg at den Wnt /β-catenin veien har en betydelig rolle i celle vedlikehold, patogenese og motstand følgende EGFR inhibering i NSCLC [35].
Våre data viser at tilsetningen av wnt inhibitorer til TKI SU11274 og erlotinib oppnå betydelig redusert levedyktighet i cellelinjer med ervervet resistens mot kombinasjonen EGFR /c-Met TKI behandling. Vi foreslår at aktivering av alternative signalveier er en mulig molekylære mekanismen av resistens i NSCLC, utnytte c-Met, EGFR, mTOR og Wnt-hemmere kan gi betraktelig bedre lungekreft pasienten prognose og være grunnlag for nye kliniske studier.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
SU11274: [(3Z) -N- (3-klorfenyl) -3 – ({3,5-dimetyl-4 – [(4- -methylpiperazin-1-yl) karbonyl] 1 H-pyrrol-2-yl} metylen) -N-metyl-2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonamid] og XAV939: [3,5, 7,8-tetrahydro-2- [4- (trifluormetyl) fenyl] -4H-thiopyrano [4,3-d] pyrimidin-4-on] ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Erlotinib og Everolimus ble innhentet fra LC Laboratories (Woburn, MA). Tivantinib ble hentet fra Chemietek (Indianapolis, IN). Alle inhibitorer ble suspendert i DMSO og holdt i 0,1 ml alikvoter ved -20 ° C. HGF ble oppnådd fra Peprotech (Rocky Hill, NJ) og EGF ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Phosphospecific kanin mAbs for p-EGFR (Tyr1068, Clone D7A5), ble p-mTOR (Ser2448, Clone D9C2) og p-4E-BP1 (Thr37 /46, Clone 2855) hentet fra Cell Signaling Technology, Inc (Beverly, MA) . Phosphospecific kanin polyklonale antistoffer for p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, 2532) og p-p70S6K (Tyr421 /Ser424, 9208) ble hentet fra Cell Signaling Technology. En kanin polyklonalt antistoff for p-c-Met (Tyr 1003, 44882G) ble oppnådd fra Invitrogen (Carlsbad, CA). En mus mAb for aktiv β-catenin (klon 8E7, 05-665) ble oppnådd fra Millipore (Billerica, Massachusetts). For Wnt signale studier, ble alle antistoffer hentet fra Wnt signal antistoff sampler kit fra Cell Signaling Technology (2915). Ufosforylerte kanin mAbs for p70S6K (2708) og mTOR (2983) ble hentet fra Cell Signaling Technology. Ufosforylerte c-Met (C-12, sc-10), og EGFR (1005, sc-03) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). En mus mAb for β-aktin (A5441) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Mus (7076) og kanin (7074) IgG sekundære antistoffer ble oppnådd fra Cell Signaling Technology. Alle antistoffer ble brukt som beskrevet i produsentens instruksjoner.
Cellelinjer og cellekultur
H358 og H2170 NSCLC cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, CRL-5807 og CRL-5928, henholdsvis) og dyrket i henhold til sine instruksjoner. Cellelinjer ble inkubert ved 37 ° C og 7% CO
2 og holdes i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (Thermo Fisher Scientific, Pittsburg, PA, Cat No: SH3002701) supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, Georgia) og 1% (v /v) antibiotika /antimycotic (Invitrogen, Cat No: 15 240). For å studere effekten av erlotinib og SU11274 som enkle terapeutiske midler, så vel som i kombinasjon, ble H358 og H2170 cellene sådd ut i 6-brønns plater og behandles etter 24 timer. Deretter ble MTT levedyktighet analyser og Western blot utført som beskrevet nedenfor. IC
50 verdier for hver cellelinje ble beregnet ved hjelp av Sigma Plot V12.0 (SYSTAT Software, San Jose, California).
MTT Celleviabilitet Analyser
Celleviabilitet ble målt med en MTT kolorimetrisk fargestoff reduksjon assay (Sigma, St. Louis, MO, USA) ved anvendelse av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) i henhold til produsentens instruksjoner. Hvert eksperiment ble utført i 96-brønners plater i replikater på seks for hver behandling tilstand og gjentatt tre ganger. Celler ble platet ut ved 5000 celler /brønn og ble behandlet med inhibitorer etter 24 timers vekst. Ved 96 timer etter utplating ble cellenes levedyktighet prosent beregnet i forhold til kontroll ved å måle absorbansen ved en bølgelengde på 570 nm. Celler behandlet med tivantinib ble eksponert bare i 24 timer, hvoretter stoffet ble fjernet. Cellene ble deretter vasket og inkubert i ytterligere 72 timer som beskrevet av tidligere forskere [12].
Fremstilling av cellelysater og Western blotting
Celler ble dyrket og lysert som beskrevet tidligere [36] , [37] i buffer inneholdende 20 mM Tris (pH, 8,0), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% NP-40, 0,42% NaF, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mM natriumortovanadat, og 10 mM protease inhibitor cocktail (Sigma- Aldrich). Cellelysater ble separert ved 7,5% eller 10% SDS-PAGE under reduserende betingelser. Proteinene ble deretter overført til immobilisering membraner (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Membranene ble deretter probet med de nevnte antistoffer. Blottene ble visualisert ved hjelp av en forbedret chemiluminescence kit (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) og kvantifisering av modulering av forskjellige proteiner ble utført ved hjelp av NIH ImageJ programvare.
Spesifikk fosforylering av c-Met /EGFR og andre signalveier via HGF /EGF og deres hemming
Celler ble fratatt av vekstfaktorer ved inkubasjon i 24 timer i serumfritt medium inneholdende 0,5% BSA, med eller uten inhibitorer. Etter behandling ble cellene stimulert med 40 ng /ml HGF i 7,5 minutter eller 5 ng /ml EGF i 5 minutter ved 37 ° C. Etter å ha forberedt lysatene ble western blotting utført som beskrevet ovenfor.
immunfluorescens
10000 celler ble sådd ut på glass kammer lysbilder (Lab-Tek, Scotts Valley, CA) og lov til å følge i 24 timer i serumfritt medium med 0,5% BSA. Cellene ble deretter behandlet med EGF i 15 minutter og fiksert med 01:01 aceton: metanol og visualisert med p-EGFR (Y1068) primær antistoff, anti-kanin DyLight 488 (grønn) sekundært antistoff (Thermo Fisher Scientific) og Hoechst fargestoff for atom farging (blå) ved hjelp av et Zeiss Axio Observer Z1 fluorescerende mikroskop. NIH ImageJ programmet ble brukt til å måle total celle fluorescens intensitet over 8 mikroskopiske felt per tilstand og verdier ble i gjennomsnitt.
DNA Sekvense
5 millioner celler ble sådd ut på diameter retter 150 mm og lov til å følge og vokse i medier som beskrevet ovenfor. DNA ble ekstrahert ved hjelp av Qiagen DNeasy® Blood Tissue kit (kat. Nr. 69504) etter produsentens anvisninger. PCR ble deretter utført for å forsterke exon 18-21 av EGFR ved anvendelse av primere beskrevet av Paez et al [38], ved bruk av AmpliTaq Gold ® PCR Master Mix (Applied Biosystems, kat. Nr. 4327058). PCR-produktene ble renset ved hjelp av GeneJET ™ PCR Purification Kit (kat. Nr. K0701) og ble deretter sekvensert ved University of Illinois DNA Services Facility.
Statistisk analyse
statistiske analyser ble gjennomført ut ved hjelp av SPSS 17.0 programvare. Gjentatte målinger av ANOVA med flere parvise sammenligninger og tilpassede kontraster med Bonferroni justeringer ble utført. Statistisk signifikans ble bestemt med α på 0,05. For å bekrefte forskjellene mellom behandlingene en sammenkoblet to-tailed Student
t
-test ble også brukt. For alle analysene ble en p-verdi på mindre enn 0,05 anses å være statistisk signifikant.
Resultater
Etablering av medikamentresistente cellelinjer
For å finne passende konsentrasjoner av SU11274 , erlotinib og en kombinasjon av begge TKI for utvikling av resistente cellelinjer, H2170 og H358-cellelinjer ble behandlet med progressivt økende konsentrasjoner av SU11274 (2,5 til 17 pM) [1], erlotinib (0. 5-14 uM) [39 ], eller begge SU11274 (1,25 til 13,5 mm) og erlotinib (0,25 til 9 mm) i 96 timer. H2170 og H358-cellelinjer ble valgt fordi de ikke har EGFR TK eller c-Met-mutasjoner. IC
50-verdier for individuelle TKI eller en kombinasjon ble bestemt for hver cellelinje (tabell 1). Cellene ble deretter behandlet med økende konsentrasjoner av SU11274 [1], erlotinib, [39], eller en kombinasjon i flere uker, hvoretter fem individuelle resistente kloner ble isolert fra enkeltceller, ekspandert og deretter sjekket for stabil motstand etter hvert seriepassasje (en gang per uke ) [40]. -Resistente celler ble dyrket i fravær av TKI til 12 passasjer (12 uker) og ble funnet å beholde motstand. Resistente kloner fra cellelinjer som er beskrevet i tabell 1, med IC
50 konsentrasjoner (bestemt som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder) 4-5 ganger høyere for SU11274, 11-22 ganger høyere for erlotinib, og 6-8- ganger høyere for SU11274 og 15-30 ganger høyere for erlotinib i kombinasjon, ble isolert og valgt for videre studier. Lavere konsentrasjoner var nødvendige for kombinasjon motstand, siden vi observert økt effekt av erlotinib og SU11274 når de ble brukt i kombinasjon. Lignende resultater ble oppnådd med andre resistente kloner (data ikke vist).
SU11274 resistente (SR) celler utstillings nedsatt følsomhet for oral c-Met-hemmer, tivantinib
Effekten av tivantinib, en oral c-Met-TKI for tiden i kliniske forsøk [12], [14], ved inhibering av cellevekst i paren og resistente celler ble undersøkt. Celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner av tivantinib i 24 timer, hvoretter stoffet ble fjernet [12]. Cellene ble deretter vasket og inkubert i ytterligere 72 timer og til slutt en MTT levedyktighet Analysen ble utført. Som vist på fig. 1, ved 0,1 uM tivantinib, ble H2170 parentale celler inhiberes med 32% sammenlignet med ubehandlede parentale celler, mens resistente celler ble kun inhibert med 10% sammenlignet med ubehandlede resistente celler (p 0,01). Munshi et al har også vist følsomhet for submicromolar konsentrasjoner av tivantinib i NSCLC som observert i våre studier [12]. En 3-gangers reduksjon i inhibering ble observert i H2170 resistente celler sammenlignet med parentale celler (n = 6, p 0,01). I SR H358-celler ble behandlet med 0,2 uM tivantinib, ble en 3,7 gangers reduksjon i inhibering sett i resistente celler sammenlignet med parentale celler (n = 6, p 0,01) (Fig1B). Disse dataene tyder på at SR-celler er også motstandsdyktig mot tivantinib.
H2170 og H358-celler ble behandlet med tivantinib (0,01 til 0,4 mm) i 24 timer, ble tivantinib fjernet, og cellene ble inkubert i 72 timer, hvoretter MTT levedyktighet analysen ble utført. SR H2170-celler viste en 3,2-ganger reduksjon i følsomheten for den anti-proliferative effekt av tivantinib ved 0,1 uM tivantinib sammenlignet med foreldreceller. En 3,7 gangers reduksjon i vekst-hemming ble også observert i SR H358-celler med 0,2 uM tivantinib sammenlignet med foreldreceller. Viste data er representative for tre uavhengige eksperimenter som viser lignende resultater (n = 6, p 0,01).
Den T790M sekundære mutasjon er ikke nødvendig for erlotinib motstand
Resultater av DNA Sanger sekvensering av PCR-produkter av eksoner 18-21 fra H2170 og H358 foreldre og resistente celler viste ingen sekundær erlotinib /gefitinib T790M eller D761Y motstand punktmutasjoner [41]. Disse resultatene bekrefter at cellene våre ikke har kjent sekundære mutasjoner som ville føre til motstand. Således kan den mekanismen som de er resistente være på grunn av alternative signalering gjennom andre reseptorer enn EGFR.
Effekt av EGF og erlotinib på EGFR fosforylering og signaleringsproteiner i to resistente NSCLC-modeller
I for å forstå mekanismen for erlotinib motstand, sammenlignet vi to forskjellige erlotinib-resistente cellelinjer, H2170 ER og ER H358, med sine respektive foreldrecellelinjer. Celler ble behandlet med enten fortynningsmiddel, EGF, erlotinib eller EGF + erlotinib. Erlotinib resistente (ER) H2170-celler viste seg å oppvise konstitutivt autofosforyleres EGFR (Y1068) i fravær av sin ligand, EGF (19 gangers økning), mens ER-H358-celler viste en 6-gangers reduksjon i p-EGFR (Y1068) i tilstedeværelsen av EGF (figur 2A). Disse resultatene ble bekreftet av immunfluorescens som viste en minimal effekt av EGF på EGFR fosforylering i ER H2170 celler. Etter behandling på +/- EGF, ble foreldre H2170 og H2170-ER-celler farget ved hjelp av et spesifikt primært anti-fosfo EGFR (Y1068) antistoff og DyLight 488-konjugert geite-antimuse sekundært antistoff fosforylert EGFR (grønn) og kjerner ble farget blå med Hoechst fargestoff. Dette tyder autofosforylering av EGFR (Fig 2B). Når samlede fluorescensenheter ble målt, ble det observert en 3.8- og 1,7-ganger økning i fluorescens i nærvær og fravær av EGF henholdsvis i resistente celler sammenlignet med parentale celler (n = 8, s 0,01). Interessant nok var det ingen signifikant forskjell i fluorescens i H2170 ER-celler i nærvær og fravær av EGF (p 0,01).
A. EGFR autofosforyleres i ER H2170 og nedregulert i H358-E4 resistente cellelinjer. p-mTOR (S2448) og nedstrøms signal protein fosfor-p70S6K (T389) er oppregulert i begge resistente cellelinjer. H2170 og H358 foreldre og resistente cellelinjer ble sultet over natten i 0,5% BSA og deretter behandlet med eller uten 7,0 mM av erlotinib i 24 timer og cellene ble stimulert med 10 ng /ml EGF i 2,5 minutter. Høyere konsentrasjoner av erlotinib ble anvendt da disse NSCLC-cellelinjer som ikke har noen EGFR TK mutasjon. Autofosforylering av EGFR på Y1068 ble observert i fravær av EGF i ER H2170-celler som ikke ble sett i ER H358-E4-celler. Oppregulering av p-mTOR og dens nedstrøms protein phosho-p70S6K (T389) er sett i H2170 resistente linjer +/- erlotinib. ER H2170 celler viser økt EGFR fosforylering +/- EGF. Oppregulering av p-ERK (2-5 ganger) ble også observert i ER- H2170 og H358-celler i +/- erlotinib B. For å bekrefte autofosforylering av EGFR, ble cellene sådd ut på kammers objektglass, tillates å følge i 24 timer og deretter sultet over natten. Cellene ble deretter behandlet med +/- EGF i 15 minutter, fiksert med aceton: metanol og visualisert med p-EGFR (Y1068) primært antistoff og kanin anti DyLight sekundært antistoff (Thermo Fisher Scientific) (grønn) eller Hoechst fargestoff for nukleær farging ( blå) på et Zeiss Axio Observer Z1 fluorescerende mikroskop. Graf som viser relative gjennomsnittlig celle fluorescens enheter per 8 mikroskopiske felt. Det var en 3,8 ganger økning i fluorescens når man sammenligner foreldre til resistente celler i fravær av EGF i H2170 celler.
Vi studerte videre effekten av erlotinib motstand på mTOR sti, en viktig regulator av kreft celle vekst [42], ved å måle p-mTOR og dens nedstrøms substrat p-p70S6K. I ER H358 og H2170 celler, oppregulering (2-4 ganger) av p-mTOR ble observert i nærvær av erlotinib (figur 2A). I tillegg oppregulering (2 ganger) p-p70S6K ble også observert i ER H2170 og H358-celler i nærvær av erlotinib. Videre, p-ERK ble også oppregulert (2-5 ganger) i ER H2170 og H358-celler i nærvær og fravær av erlotinib (figur 2A). Ingen modulering av total mTOR, EGFR, p70S6K eller ERK ble observert (figur S1). Våre resultater tyder på at mTOR-reaksjonsveien og andre reseptorer kan oppregulere p-p70S6K derved å mediere motstand via to separate mekanismer i H2170 og H358 NSCLC-modeller.
Effekt av HGF og SU11274 på c-Met fosforylering og signaleringsproteiner i to NSCLC modeller
for å forstå motstanden mekanisme for å c-Met-hemmere, etablerte vi SR H2170 og SR H358 cellelinjer og behandlet dem med fortynningsmiddel, HGF, SU11274 og HGF + SU11274. SR H2170 og SR H358-celler viste en 4- og 1,5 ganger nedregulering av henholdsvis p-c-Met (Y1003), med noen endringer i total c-Met nivåer som analyseres ved western blotting (fig 3). Nedregulering synes å være helt uavhengig av enhver SU11274 behandling siden nedregulering ble observert etter seks passasjer i fravær av medikamentet. Dette kan indikere at SR H2170 og H358 ikke benytter p-c-Met som et middel for motstand som skulle tilsi en separat mekanisme. I likhet med ER celler i ubehandlede SR H2170-celler, har vi funnet en betydelig oppregulering (20-ganger) p-p70S6K, et protein på nedstrømssiden av mTOR som er involvert i kreftcelleoverlevelse [42], og en oppregulering ble observert i celler behandlet med HGF og SU11274 (fig 3). En to-fold oppregulering i p-4E-BP1, protein nedstrøms av mTOR som fremmer tumorigenicity, ble observert i begge SR H2170 og H358-celler (fig 3). Ingen modulering av total mTOR, ble EGFR, p70S6K eller ERK observert i noen av cellelinje (Fig S1). Disse resultatene indikerer at den mTOR-reaksjonsveien kan være involvert i mediering motstand.
Cellene ble sultet over natten og deretter behandlet med eller uten 8,0 mM SU11274 i 24 timer. Celler ble stimulert med 40 ng /ml HGF i 2,5 minutter, hvoretter western blot-analyse ble utført. Nedregulering av p-c-Met (Y1003) ble observert i begge cellelinjer. Oppregulering av p-p70S6kinase (S371) ble observert i SR H2170 celler. Oppregulering av p-4E-BP1 (T37 /46) ble også observert i begge cellelinjer +/- SU11274.
Aktivering av Wnt veien bidrar til EGFR /c-Met TKI motstand
Wnt pathway regulerer cellulær proliferasjon og spiller en nøkkelrolle i utviklingen av lungekreft [43], [44]. Siden β-catenin signal ble vist å aktivere ERK signalveien [45] undersøkte vi p-ERK (T202 /Y204) og aktiv β-catenin i respons til HGF over tid i SR H2170 celler. Vi har funnet at p-ERK forble forhøyet i mer enn 120 minutter i SR H2170 celler, men bare i 30 minutter i parentale celler (figur 4A). Interessant, i ikke-stimulerte celler, basalnivåer av aktiv β-catenin (2 ganger) og p-ERK (5,6 ganger) var høyere, og forble forhøyet i 120 minutter etter HGF behandling i SR H2170-celler sammenlignet med foreldre celler etter en 60 minutters inkubasjon (n = 3, p 0,01) (figur 4A), noe som antyder crosstalk av c-Met, mTOR og Wnt pathway. Etter behandling med SU11274 og HGF, observerte vi en 3-8 ganger økning i aktiv β-catenin i nærvær og fravær av SU11274 i SR H2170 celler (figur 4B). Et 2-3 gangers oppregulering av p-LRP6 i nærvær og fravær av SU11274 ble også sett. Oppregulering av proteiner assosiert med Wnt veien ble bekreftet i ER H2170 celler. Vi observerte en 2-4 ganger økning og 3-5 gangers økning av p-LRP6 i fravær eller nærvær av erlotinib, respektivt. LRP6 fosforylering kan indikere aktivering av Wnt veien [46]. Vi observerte også en 2-3,5 ganger høyere uttrykk for Axin1, en regulator av LRP6, og senere Wnt veien [31] (figur 4C).
A. I SR H2170 celler, HGF indusert uttales p-ERK signal forhold til foreldre celler. Cellene ble sultet i 48 timer og deretter stimulert med 40 ng /ml HGF. Western blotting i SR H2170 indikerte at HGF aktivert p-ERK (T202 /Y204) holdt seg høy i 120 minutter i forhold til foreldrelinjene. Basale nivåer av aktive β-catenin var også to ganger høyere og holdt seg høy (3,6 ganger) i 120 minutter etter HGF behandling i SR H2170 celler sammenlignet med de som er i foreldre celler i løpet av 60 minutter inkubasjon. Disse forsøk ble utført i tre eksemplarer. Relativ densitometri av p-ERK /β-aktin i SR H2170-celler ble avbildet som er et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter (n = 3, p 0,01). B. Regulering av proteiner i Wnt signalveien etter behandling av H2170 med SU11274. Oppregulering av pLRP6 (2 til 3.0-ganger) og β-catenin (3-8,0-ganger) ble observert hos resistente H2170-celler i nærvær eller fravær av SU11274. C. Regulering av proteiner i Wnt signalveien etter behandling av ER H2170 celler med erlotinib. Oppregulering av LRP6 (2-5 ganger), og Axin1 (2 til 3,5 ganger) ble sett i resistente H2170 celler i nærvær eller fravær av erlotinib.
Veksten av H2170 og H358 kombinasjon resistente (CR) celler blir hemmet av everolimus og XAV939
Siden mTOR veien er involvert i anti-kreft narkotika motstand [47], følsomhet for mTOR-hemming i CR H2170 og H358 cellelinjer ble testet. Behandling med 1 uM everolimus inhibert H358 parentale celler med 40% og resistente celler med kun 20%. Interessant, den samme konsentrasjonen av everolimus hemmet veksten av parentale celler og fullstendig resistente celler med 95% når de anvendes i kombinasjon med enten SU11274 (8 pM) eller erlotinib (8 pM) (figur 5A). Lignende resultater ble funnet i CR H2170-celler (99% inhibisjon av vekst, data ikke vist). Vi testet deretter effekten av Wnt inhibering i resistente celler. H2170 foreldre og CR cellelinjer ble behandlet med økende konsentrasjoner av XAV939 og en MTT levedyktighet Analysen ble utført. Interessant, parentale celler viste liten eller ingen respons på XAV939 imidlertid CR-celler ble hemmet på en dose responsive måte (figur 5B). Videre, når XAV939 ble kombinert med SU11274 (8 pM) og erlotinib (8 pM), ble en 85% reduksjon i levedyktighet observert i CR-celler. Dette tyder på at Wnt signal har en viktig rolle i resistente celler.
Celler ble behandlet for 96% veksthemming ble observert når everolimus ble brukt med både SU11274 og erlotinib. B. Foreldre H2170 celler viser liten eller ingen hemming når gitt økende konsentrasjoner av XAV939. Omvendt, CR H2170-celler når de ble behandlet med XAV939, ble inhibert på en dose responsive måte. H2170 CR celler som viser 40% hemming til Wnt antagonist XAV939 (10 mm) alene, viste en 85% hemming med trippel kombinasjon av XAV939, SU11274 og erlotinib (p 0,01). Hvert eksperiment for hver behandling tilstand ble gjentatt tre ganger.
Diskusjoner
molekylært målrettet TKI har blitt en integrert del av behandlingen som brukes av leger for å bekjempe tidligere botemiddel NSCLC. Imidlertid har ervervet resistens mot TKI sterkt begrenset i hvilken grad denne behandlingen kan brukes effektivt. I motsetning til tidligere studier som har fokusert på EGFR mutasjoner [8], [48] undersøkte vi mulig alternativ signalveier i medikamentresistente cellelinjer. Vi studerte to NSCLC-modell cellelinjer som viste enten oppregulering (H2170) eller nedregulering (H358) p-EGFR og nedregulering p-c-Met (H2170 og H358). -Resistente celler ikke vise enten T790M eller D761Y mutasjoner, noe som tyder på at bruk av en annen signaleringsmekanisme for å overvinne erlotinib følsomhet. Interessant både H2170 og H358 resistente celler vise oppregulering av mTOR veien. Videre H2170 resistente cellelinjer viste modulering av både mTOR og Wnt trasé som antyder sine roller i mekanismen av resistens.
Foreløpig ingen kobling er etablert mellom c-Met TKI motstand og mTOR i NSCLC. Men tidligere studier tyder på at inhibering av c-Met kinase aktivitet som fører til redusert aktivering av PI3K /AKT /mTOR-reaksjonsveien i transformerte celler [25]. Men i denne studien, observerte vi ingen fosforylering av c-Met i H2170 og H358 resistente cellelinjer ved behandling med SU11274. Dette tyder på at SU11274, samtidig som en effektiv inhibitor av c-Met fosforylering, har liten effekt på hemningen av mTOR og dens nedstrøms signalbaner som er nødvendige for cellevekst og overlevelse i resistente linjer [25]. Siden resistente cellelinjer er blitt vist å proliferere i nærvær av SU11274, foreslår vi at alternative reaksjonsveier ha en viktig rolle i å overvinne c-Met-inhibering og ytterligere molekyl målretting kan være nødvendig for å hemme cellevekst. Rollen til mTOR-reaksjonsveien i resistensmekanismer er dokumentert av et 2-4-gangers økning i p-mTOR i resistente H2170 og H358-celler sammenlignet med parentale celler som respons på behandling erlotinib. Dessuten er p-p70S6K, og p-4E-BP1 også oppregulert i resistente cellelinjer, således at mTOR-reaksjonsvei synes å være sterkt aktivert ved eksponering for EGFR /c-Met TKI.
