Abstract
Til tross for optimal strålebehandling (RT), kjemoterapi og /eller kirurgi, et flertall av pasienter med lokalavansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) mislykkes behandling. For å identifisere nye gener mål for bedre tumorkontroll, utførte vi hele genom RNAi skjermer for å identifisere knockdowns at de fleste reproduserbart øker NSCLC cytotoksisitet. Disse skjermene identifisert flere proteasomer subenheter blant topp hits, inkludert den øverste treffet
PSMA1
, en komponent av kjernen 20 S proteasome. Stråling og proteasomhemmingen viste synergieffekter. Proteasomhemmingen resulterte i en 80-90% reduksjon i homolog rekombinasjon (HR), en 50% reduksjon i uttrykket av NF-kB-induserbare HR gener
BRCA1 Hotell og
FANCD2
, og en reduksjon av BRCA1, FANCD2 og RAD51 ioniserende stråling-indusert foci. IκBα RNAi knockdown reddet NSCLC radioresistance. Bestråling av mus med NCI-H460-xenografter etter induserbar
PSMA1
shRNA knockdown markant økt murine overlevelse sammenlignet med hver behandling alene. Proteasomhemmingen er en lovende strategi for NSCLC bestrålingssensibilisering via hemming av NF-kB-mediert uttrykk for Fanconi anemi /HR DNA-reparasjonsgener
Citation. Cron KR, Zhu K, Kushwaha DS, Hsieh G, Merzon D, Rameseder J, et al. (2013) proteasomhemmere Block DNA Repair og radiosensibilisere ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (9): e73710. doi: 10,1371 /journal.pone.0073710
Redaktør: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA
mottatt: 30 april 2013; Godkjent: 19 juli 2013; Publisert: 05.09.2013
Copyright: © 2013 Cron et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en American Society for Radiation Oncology (Astro) Junior fakultetet Career Forskning Training Award, et felles senter for strålebehandling Foundation Grant, en Dana-Farber /Harvard Cancer Center SPORE Utviklings Research Project Award i Lung Cancer Research, og National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award Number K08CA172354. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
strålebehandling (RT) er et kritisk modalitet i behandlingen av lunge cancer. Det er svært effektivt når sykdommen er lokalisert, og kurative doser kan administreres sikkert. For eksempel kan trinn I ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC) behandles med tilstrekkelig høye doser av ioniserende stråling (IR) for å gi 3-års lokale kontroll på cirka 90% [1]. Dette skyldes i stor grad de høye biologisk effektive doser (BED) som kan gis til isolerte lungesvulster ved hjelp av stereo kroppen strålebehandling bli. Dessverre, bare 15% av pasientene presentere slike svulster [2]. Mer avanserte tumorer, som er betydelig mer vanlig, kan ikke bli behandlet til høyere BED, på grunn av infiltrering av, eller nærhet til, radiosensitive strukturer, inkludert lungene, ryggmarg, spiserør og hjerte [3]. Denne begrensningen står for de høyere lokale feilrater på rundt 30% [4]. Systemiske midler blir derfor administrert for å forbedre strålingen respons. Slike midler inkluderer cytotoksiske kjemoterapeutika som selv har betydelige dosebegrensende toksisitet og begrensede effekter på tumorkontroll. Bare et mindretall av svulster vise genetiske funksjoner, for eksempel EGFR aktiverende mutasjoner [5] eller EML4-ALK trans [6], som gir mulighet for målrettet terapi; flere alternativer er nødvendig.
Flere genom-wide studier har blitt gjennomført i NSCLC, inkludert DNA-sekvensering [7], kopi nummer analyse [8] og genuttrykk profilering [9]. Disse studiene gitt en objektiv identifikasjon av de vanligste og viktigste genetiske og epigenetiske forandringer blant de 20-25,000 gener av det menneskelige genom [10]. De avslørte spennende assosiasjoner mellom gener og kliniske kovariater, men klarte ikke å direkte demonstrere årsak og virkning relasjoner mellom endringer og terapeutiske utfall. I motsetning til dette, kan RNA-interferens (RNAi) direkte demonstrere effekten av redusert genekspresjon i cellefysiologi og overlevelse [11].
Felles kort hårnål RNA (shRNA) skjermer, hvor kreftceller utsettes for flere tusen forskjellige shRNA sekvenser, i snitt ett gen knockdown per celle, har flere oppsiktsvekkende funksjoner. For det første kan virkningen av stabile shRNA knockdown over flere celle doblinger bli undersøkt, sammenlignet med forbigående transfeksjon av små interfererende RNA (siRNA) sekvenser med kortvarig virkning. Følgelig shRNA uttrykk ligner medikamentelle behandlinger som vanligvis gis over flere uker i stedet for dager. Også celler som ulike shRNA sekvenser effektivt konkurrere med hverandre i bassenget som de spre seg, noe som gir opphav til hits som gir mer uttalte effekter på spredning [12].
Fordi strålebehandling er bærebjelken i NSCLC behandling, gen silencings som resulterer i synergistisk cytotoksisk når den kombineres med ioniserende stråling (IR) er ønskelig. Mange kreftbehandlinger er additive i naturen, og er kombinert fordi de resulterer i differensialbivirkningsprofiler [13]. Synergistiske behandlinger som resulterer i større effekter når de administreres samtidig, i forhold til de additive effekter av hver behandlings gitt individuelt, kan tjene spesielt godt som radiosensibiliserende midler, ettersom RT levering kan være begrenset til et begrenset volum, og bivirkningene kan være mindre uttalt utenfor den bestrålte volum.
Demonstrasjon mekanismen av en radiosensitizing shRNA kan også avsløre biomarkører for pasientens valg og behandling vurdering. DNA-dobbelttrådbrudd (DSB sin) er blant effektene av IR som best korrelerer med sin cytotoksisitet. En enkelt ureparert DSB er tilstrekkelig til å føre til reproduktiv celledød via G2 arrest eller mitotisk katastrofe [14]. DSB sin er hovedsakelig reparert gjennom to veier, homolog rekombinasjon (HR) og ikke-homologe end-sammenføyning (NHEJ) [15]. Gene silencings eller små molekyl hemmere av enten sti kan fremme bestrålingssensibilisering.
Her undersøker vi proteasomhemmingen som en strategi for NSCLC bestrålingssensibilisering via hemming av DNA DSB reparasjon. Proteasomhemmingen har blitt undersøkt i flere kliniske studier melde NSCLC pasienter, med variable resultater. For eksempel, en fase II-studie av 114 pasienter behandlet med bortezomib pluss gemcitabin og karboplatin som førstelinjebehandling av avansert NSCLC, viste en svarprosent på 23% og en sykdomskontrollrate (svar + stabil sykdom) på 68%, og dermed beret videre studier [16]. Bortezomib viste ingen aktivitet som monoterapi i en fase II-studie av 14 pasienter, ingen av dem viste objektive responser, og tre (21%) hadde stabil sykdom varig 3.4-11.5 måneder [17]. Basert på våre data, foreslår vi at proteasomhemmere kan være nyttig som radiosensibiliserende, gitt sine undertrykkende effekt på NF-kB-mediert uttrykk av gener som kreves for HR veien.
Resultater
Multiple Proteasome gener er Top Hits hos NSCLC hele genomet RNAi Screens
En hel genom shRNA skjermen ble gjennomført i to NSCLC cellelinjer, A549 og NCI-H460. Disse linjene har felles genetiske egenskaper, inkludert mutasjoner i
KRAS Hotell og
STK11 plakater (aka LKB1). Disse mutasjoner er funnet i tumorer som er særlig aggressiv og motstandsdyktig mot terapi, og for hvilke målrettet terapi er utilgjengelige [18], [19]. Cellelinjene er villtype i
TP53 Hotell og derfor mindre sannsynlig, sammenlignet med muterte linjer, for å vise genomisk ustabilitet i løpet av en skjerm som strekker seg over flere uker [20]. Også deres genetiske likheten, i form av viktige onkogene og tumorsuppressorgener, øker sannsynligheten for at skjermen treff på en linje vil bli gjengitt i den andre (tabell S1).
Hannon-Elledge biblioteket inneholder 74 705 distinkt shRNA sekvenser og mål nesten 18 000 gener [21]. Etter transduksjon med dette biblioteket og puromycin utvalg for stabile integranter ble cellene passert, og den relative representasjon av hver sekvens i en pool ble bestemt før og etter tolv populasjonsdoblinger. ShRNA sekvenser rettet mot gener er viktige for cellulær proliferasjon ble selektivt tapt. 1,667 gener var målene for minst ett shRNA sekvens som har overflod redusert med minst to ganger i løpet av passasjen i begge cellelinjer (tabell S2). Flere proteasomer subenheter nummererte blant treff i begge cellelinjer, inkludert den øverste treffet
PSMA1
, en underenhet av kjernen 20 S proteasome [22] (Fig. 1 og tabell S3).
diagram av 26 S proteasome viser flere hele genomet shRNA skjermen treff med følgende fargekode: top hit (rød), sterk hit ( en shRNA sekvens per gen i begge cellelinjene, mørk oransje), mindre hit (en shRNA sekvens per-genet i begge cellelinjer, lys orange), chymotrypsin-lignende proteolytiske katalytiske sete (ikke et treff, men markert for illustrerende formål, grønn). Hvert treff er merket med de to siste alfanumeriske tegnene i genets HUGO nomenklatur; for eksempel A1 = PSMA1, B5 = PSMB5, M1 = SHFM1.
proteasomhemmere sensitiv NSCLC Cells for stråling
doksycyklin-induserbar shRNA knockdown av
PSMA1
i A549 og NCI-H460 resulterte i tap av protein ekspresjon av både PSMA1 og PSMB5, en annen underenhet av kjernen 20 S proteasome og det katalytiske sete av chymotrypsin-lignende (CTL) aktivitet av proteosomet [22] (fig. 2A). Dette resultatet bekrefter avgjørende rolle
PSMA1
i 20 S proteasome montering. Behandling med lite molekyl proteasominhibitor bortezomib eller
PSMA1
shRNA knockdown forårsaket et tap av CTL-aktivitet (Fig. 2B).
(A) Western blot viser proteinnivåer PSMA1 og PSMB5 i A549 og NCI-H460 NSCLC celler etter
PSMA1
shRNA knockdown sammenlignet med ikke-tie shRNA kontroll. (B) chymotypsinlignende (CTL) proteasome aktivitetsanalyse i A549 (til venstre) og NCI-H460 (høyre) NSCLC-celler etter behandling med bortezomib, eller
PSMA1
siRNA knockdown. Alle resultater er gjennomsnitt ± SEM og normalisert til DMSO kjøretøy kontroll. (C) klonogene overlevelse analyse av A549 (til venstre) og NCI-H460 (høyre) etter IR og bortezomib. Merkede linjer viser prosent utryddelse av bortezomib-behandlede prøvene sammenlignet med DMSO kjøretøy kontroll på hvert IR dose. Alle resultater er gjennomsnitt ± SEM og normalisert til DMSO kjøretøy kontroll. (D) Apoptose deteksjonsanalyse av NCI-H460 etter 2 og 4 Gy IR og 50 nM bortezomib. Stolpene viser prosentandelen av celler i tidlig apoptose (venstre) eller sen apoptose (høyre) via Annexin V og propidum jodid flekker, respektivt. Alle resultater er gjennomsnitt ± SD og P-verdier ble beregnet ved hjelp av en to-tailed Student
t
test.
bortezomib er et aktivt middel
in vitro
i NSCLC linjer, inkludert A549 [23] og NCI-H460 [24], og det har tidligere vist radiosensitizing eiendommer i prekliniske studier [25]. Muligheten av proteasomhemmere for å forsterke virkningene av fraksjonert stråling, en klinisk metode for å levere stråling daglig i små doser for å minimere langtids toksisitet [26], ble derfor undersøkt. Bortezomib og fraksjonert stråling ga synergieffekter (Fig. 2C). Synergi ble også observert med enkeltdose-stråling (fig. S1), selv om resultatet med fraksjonert stråling er mer klinisk relevant. Denne synergistiske virkning på celledød ble formidlet i det minste delvis av apoptose; 2 Gy IR alene ikke indusere apoptose, mens kombinasjonen av IR og bortezomib indusert betydelig økt apoptose i forhold til hver behandling alene (Fig. 2D).
proteasomhemmingen Svekker Stråling-indusert DNA Double Strand Break Reparasjon av synkende homolog rekombinasjon
Gitt synergien mellom proteasomhemmingen og stråling, neste fastsatte vi om proteasomhemmere påvirker strålingsinduserte DNA-dobbelttrådbrudd (DSB sin) [26] (figur 3). I nøytrale komet analyser, NSCLC celler reparert det store flertallet av DNA DSB sin generert av høye doser stråling i løpet av én time. I motsetning til dette, bortezomib behandling før stråling vesentlig forsinket ved reparasjon av DNA DSB sin i det minste opp til 8 timer etter bestråling (Fig. 3A-B). Denne persistens av DSB kan føre til økt mitotisk katastrofe [27], som antas å være den dominerende årsak til celledød i bestrålte faste ondartede sykdommer.
(A) Visualisering av en nøytral komet assay som viser IR-indusert DNA DSB i NCI-H460-celler 1, 4 og 8 timer etter 40 Gy IR og pre-behandlet med 50 nM bortezomib forhold til DMSO kjøretøykontroll. (B) Kvantifisering av den nøytrale kometmetoden via oliven øyeblikk (til venstre) og% DNA i halen (til høyre) ved 1, 4 og 8 timer etter 40 Gy IR med og uten 50 nM bortezomib i NCI-H460-celler. Hvert datapunkt representerer 3 uavhengige duplikate eksperimenter på minst 50 celler. Alle resultater er gjennomsnitt ± SD og P-verdier ble beregnet ved hjelp av en to-tailed Student
t
test. (B) GFP reporter analysen for homolog rekombinasjon etter proteasomhemmingen i 24 timer via bortezomib eller
PSMA1
siRNA knockdown i A549 (til venstre) og NCI-H460 (høyre). Alle resultater er gjennomsnitt ± SD og normalisert til DMSO kjøretøy kontroll (Veh) eller nonsilencing siRNA kontroll. P-verdier ble beregnet ved hjelp av en to-tailed Student
t
test.
For å observere effekten av bortezomib eller RNAi knockdown av
PSMA1
på DNA-reparasjon, en GFP reporter konstruksjon for HR [28] ble innført i A549 og NCI-H460-celler. Sammenlignet med ubehandlede celler, de som ble behandlet med enten bortezomib eller
PSMA1
siRNA viste en statistisk signifikant reduksjon i HR-mediert reparasjon av I-
SCE
I-indusert DNA DSB sin (Fig. 3C). Lignende resultater ble observert for NHEJ (fig. S2). Disse resultatene viser en direkte effekt av proteasomhemmingen på mekanismer for DNA DSB reparasjon, i samsvar med tidligere studier [29] -. [31]
For å forstå mekanismen av HR-hemming, vi utforsket effekten av bortezomib på kjernekraft fokus dannelsen av viktige proteiner i Fanconi Anemi (FA) /HR veien. IR-indusert RAD51 atom fokus formasjonen, som er en biomarkør for HR [32], ble betydelig redusert med bortezomib eller
PSMA1
RNAi (Fig. 4A, Fig. S3-S4). FANCD2 protein uttrykk og IR-indusert FANCD2 fokus formasjon var tilsvarende redusert med bortezomib eller
PSMA1
RNAi (Fig. 4B, fig. S3-S4). Til slutt, IR-indusert BRCA1 fokus formasjonen ble betydelig redusert med bortezomib eller
PSMA1
RNAi (fig. 4C, fig. S3-S4). Samlet utgjør disse data tyder på at proteasomhemmingen kan påvirke HR-mediert reparasjon av IR-indusert DNA DSB sin ved å redusere tilgjengeligheten eller rekruttering av nøkkel FA /HR proteiner for å skade nettsteder.
(A) Etter bortezomib × 24 timer eller
PSMA1
knockdown × 72 timer, A549 eller NCI-H460-celler ble bestrålt deretter fast etter 6 timer. RAD51 foci ble påvist ved immunfluorescens. Celler med ≥ 5 foci ble scoret som positive (n 100). Alle resultater er gjennomsnitt ± SEM. P-verdier ble beregnet ved hjelp av en to-tailed Student t-test. Bilder viser representative bilder for NCI-H460 behandlet med bortezomib, bar = 10 mikrometer. (B) Som i (A), men for FANCD2, herunder Western blot og immunfluorescens. (C) Som (A), men for BRCA1.
proteasomhemmingen Blocks NF-kB indusert ekspresjon av Fanconi Anemi /homolog rekombinasjon Gener
neste utforsket forholdet mellom proteasome hemming og FA /HR vei via NF-kB signalering. Dalton og kolleger [33] tidligere viste at bortezomib reduserer FA /BRCA genuttrykk i myelomatose celler, og at NF-kB oppregulerer transcriptionally FA /BRCA veien. For eksempel, NF-kB bindes direkte til promoteren til
FANCD2
, basert på den elektroforetiske mobilitet skift-analyse (EMSA) (Fig. 5A). En mekanisme som bortezomib nedregulerer NF-kB veien er gjennom hemming av proteasome-mediert degradering av IκBα [34]. IκBα, som sequesters NF-kB i cytoplasma, og fosforylering av IκBα ved hemmer av NF-kB kinaser (IKKS) utgivelser NF-kB, slik at det er adgang til kjernen [35]. Bortezomib nedregulerer også NF-kB veien ved å fremkalle kjernefysisk translokasjon av IκBα, noe som resulterer i undertrykkelse av NF-kB p65 /50-avhengig transkripsjon [36].
(A) Diagram av NF-kB arrangører på
FANCD2 Hotell og
BRCA1
gener. (B) uttrykk ved qPCR av
FANCD2
følgende proteasomhemmingen ± 30 nM (A549) eller 50 nM (NCI-H460) bortezomib eller ± induserbar
PSMA1
shRNA, og ± 10 Gy IR. Alle verdier er normalisert til ACTB og alle resultatene er gjennomsnitt ± SEM. (C) Som (B), men med BRCA1. (D) NSCLC celle overlevelse etter bortezomib og IR er delvis reddet av
IkBα
siRNA knockdown når utført på forhånd. Celleviabilitet ble analysert ved hjelp av en ATP luminescens basert analyse som måler relative lysende enheter (RLU). Alle resultater er gjennomsnitt ± SEM.
Vi har derfor søkt å finne ut om IR-indusert transkripsjon av FA /HR gener
FANCD2 Hotell og
BRCA1
er redusert med proteasomhemmingen. Transkripsjon av
FANCD2 Hotell og
BRCA1
økt i løpet av 30 minutter etter bestråling, og ble vesentlig blokkert av bortezomib eller
PSMA1
RNAi (Fig. 5B-C). Denne korte tidsskalaen kunne redegjøre for den kortsiktige effekten på DSB reparasjon observert i kometmetoden. Å etablere kausalitet, utførte vi en redning eksperiment i NSCLC celler forbehandlet med IκBα siRNA. Cellene ble deretter underkastet proteasomhemmingen og bestråling. IkBa knockdown reddet radioresistance og celle overlevelse av bortezomib-behandlede celler (fig. 5D). Disse dataene etablere en rolle for proteasomhemmere som radiosensibiliserende, via blokade av NF-kB indusert uttrykk for FA /HR gener (Fig. 6).
proteasomhemmingen bortezomib eller
PSMA1
knockdown resultater i en økning i IκBα, som i sin tur reduserer NF-kB binding til arrangører av FA /HR gener inkludert
FANCD2 Hotell og
BRCA1
. Dette reduserer tilgjengeligheten av disse DNA-reparasjons proteiner for rekruttering til DNA skadesteder, noe som resulterer i redusert RAD51 fokus formasjon og HR etter induksjon av DNA-dobbelttrådbrudd av ioniserende stråling.
Kombinasjon av proteasomhemmingen og stråling forbedrer tumorkontroll
neste søkt å fastslå om proteasomhemmingen kan være en nyttig strategi
in vivo
. Dårlig penetrasjon av bortezomib i svulstene kan begrense sin effekt i solide maligniteter [37]. Vi har derfor testet om induserbar
PSMA1
RNAi knockdown forbedrer kontroll av xenotransplantater behandlet med fraksjonert strålebehandling (RT).
For å administrere fraksjonert RT, brukte vi et lite dyr stråling forskningsplattform (SARRP) som kan levere CT-veiledet konforme RT for svulster hos mus [38], [39]. Denne plattformen sikrer fullstendig behandling av tumoren samtidig minimere bestråling av uninvolved vev. Det er også tilrettelagt volumetriske vurderinger av tumorvekst og delvis korrelert (r = 0,61) med kalibermålinger (Fig. 7A-B).
10
6 NCI-H460-celler transfektert med doksycyklin-induserbar
PSMA1
shRNA ble injisert i flankene av 6-8 uker gamle NCR nakne mus. Når tumorer nådde 3 mm diameter (dag 0),
PSMA1
knockdown ble innledet med doksycyklin drikkevann. En uke senere, RT ble igangsatt for å gi til sammen fem 4 Gy fraksjoner annen hver dag ved hjelp av et lite dyr strålings forskning plattformen (Sarr). (A) Ortogonale bilder fra en kjegle bjelke computertomografi (CT) skanne, erholdt ved hjelp av SARRP, av en mus som bærer en subkutan xenograft. (B) Korrelasjon av volumetriske tumormålinger ved hjelp av SARRP cone beam CT sammenlignet med tradisjonelle målepunktene. (C) Behandling skjema. (D) Mus ble deretter fulgt inntil tumorene nådde 2 cm i diameter, ble dyrene døende eller i 100 dager. (E) Kaplan-Meier analyser ble utført med parvise log-rank tester for å vurdere forskjeller i overlevelse. Tall overlevende ut av 10 mus per gruppe på dag 100 er angitt i parentes. For RT vs. RT +
PSMA1
knockdown, log rank
P =
0,0003.
Mus ble implantert med NCI-H460-celler husing en doksycyklin-induserbar
PSMA1
shRNA konstruere. En uke etter initiering av
PSMA1
knockdown, tumorer ble bestrålt til en dose på 20 Gy i fem fraksjoner. Etter RT behandlinger,
PSMA1
knockdown ble avviklet, og musene ble fulgt i opptil 100 dager etter svulstdannelse (Fig. 7C). Ubehandlet mus viste rask utvikling av svulster. Mus behandlet med enten RT eller den induserbare
PSMA1
knockdown i tumorceller viste også progressiv tumorvekst og dårlig overlevelse. Mus behandlet samtidig med begge behandlinger imidlertid viste minimal til ingen xenograft vekst og 100% overlevelse (Fig. 7D-E). IR-indusert FANCD2 fokus formasjonen ble også redusert i vevsprøver viser induserbar
PSMA1
knockdown (Fig. 8A). Reduksjonen i disse foci kan tjene i fremtiden som en biomarkør for reduksjon av IR-indusert aktivering av FA /HR sti å følge proteasomhemmingen. Betydelig økt IR-indusert γ-H2AX foci i tumorprøver vedvart 1, 6 og 24 timer med
PSMA1
knockdown sammenlignet med kontrollen, indikerer forsinket DNA DSB reparasjon. (Fig. 8B-C).
(A) FANCD2 immunfluorescens på 10 Gy bestrålt vs. ubestrålte NCI-H460-transplantater utvinnes fra mus med eller uten doksycyklin-indusert
PSMA1
shRNA uttrykk i tumor celler. Bar = 10 mikrometer. (B) γ-H2AX immunhistokjemi i NCI-H460 xenografttumorer med eller uten doksycyklin-indusert
PSMA1
shRNA knockdown, utvunnet fra mus 1, 6 og 24 timer etter 10 Gy bestråling. Bar = 10 mikrometer. (C) Kvantifisering av immunhistokjemi for γ-H2AX i (B). Celler med ≥ 5 foci ble scoret som positive (n 400 celler). Alle resultater er gjennomsnitt ± SEM. P-verdier ble beregnet ved hjelp av en to-tailed Student t-test.
De dramatiske resultater observert med
PSMA1
knockdown er i kontrast med de som ble observert tidligere med bortezomib
in vivo
, inkludert genetisk modifiserte musemodeller (GEMMs) av lunge adenokarsinom [40]. Gitt resultatene med
PSMA1
knockdown, evne til bortezomib å radiosensibilisere NCI-H460-xenografter ble undersøkt for å finne ut om det kan være større tumorici-dal-effekten med denne kombinasjonsterapi. Det var ingen signifikant forskjell i overlevelse av mus behandlet med radioterapi med eller uten bortezomib (figur S5). For å finne ut om dette var på grunn av dårlig svulst narkotika penetrasjon, ble chymotypsinlignende proteasome aktivitet undersøkt i tumorer behandlet med eller uten bortezomib i forhold til svulster med eller uten PSMA1 knockdown. Det var betydelig mer proteasomhemmingen følgende PSMA1 knockdown i forhold til at etter bortezomib (figur S6). Dette tyder på at begrenset effekt observert med bortezomib
in vivo
kan være relatert til dårlig svulst narkotika penetrasjon, som skulle forklare avvikene i resultatene
in vitro Hotell og
in vivo
.
Diskusjoner
Hensikten med denne studien var å etablere en begrunnelse for proteasomhemmingen som en strategi for NSCLC bestrålingssensibilisering. Vi tenkte at siden DNA-dobbelttrådbrudd (DSB sin) korrelerer med cytotoksisitet av ioniserende stråling (IR) [26], agenter som forsinker reparasjon av disse pausene kan opptre som radiosensibiliserende. Følgelig vi observert nedgang i homolog rekombinasjon (HR) etter proteasomhemmingen betydelige forsinkelser i DNA DSB reparere både
in vitro Hotell og
in vivo, etter og reduserte nivåer av IR-indusert uttrykk og skader nettstedet lokalisering av DNA reparasjonsproteiner. Proteasomhemmere funksjon, i hvert fall delvis, ved å blokkere NF-kB veien ved å interferere med nedbrytning av IκBα, som hemmer nedstrøms NF-kB aktivitet [34], [35]. Bortezomib redusert IR-indusert ekspresjon følgende proteasomhemmingen av Fanconi anemi (FA) /BRCA-genene, de fleste som har antatte NF-kB bindingssteder [33]. Viktigere, reddet vi bortezomib-indusert Radiosensitivity av stanse IκBα, støtter den foreslåtte mekanismen. Proteasomhemmere derfor synes å radiosensibilisere NSCLC ved å forstyrre DNA DSB reparasjon ved å redusere uttrykket av viktige NF-kB-induserbare HR gener.
En alternativ forklaring på effekten av proteasomhemmingen på Radiosensitivity er gjennom induksjon av apoptose . Flere studier har vist en økning i apoptose etter behandling med bortezomib [41]. Apoptose har ikke vist seg som den dominerende modus av celledød i bestrålt NSCLC. For eksempel høye doser som 20 Gy bestråling av A549 eller NCI-H460-celler gi forekomst av apoptose av bare 5-35% [42]. NCI-H460-celler behandlet med både 2 Gy IR og bortezomib viste økt apoptose i forhold til hver behandling alene. Av notatet, utholdenhet av DNA DSB sin etter bestråling av celler eksponert for proteasomhemmere kan også selv bidra til apoptose.
Vi observerte reduserte veksten av NSCLC xenografter følgende proteasomhemmingen kombinert med RT. GEMMs av lungekreft kan brukes til å bekrefte effekten i grunnskolen lungesvulster behandlet
in situ
. Utforske dette i flere GEMMs kan ha den ekstra fordelen av å identifisere genotyper som spesielt reagerer på proteasomhemmingen. For eksempel svulster som oppstår fra mus husing induserbar
KRAS Hotell og
TP53
mutasjoner svart på bortezomib, i motsetning svulster fra mus med mutant
KRAS Hotell og villtype
TP53 product: [40]. Vi observerte markerte forskjeller i overlevelse med induserbar proteasome knockdown i NSCLC xenografter uttrykker villtype
TP53
, som er i kontrast med disse resultatene. Vi foreslår at kombinasjonen med stråling kan låse opp potensialet proteasomhemmingen til et bredere spekter av tumor genotyper.
Fastsettelsen av proteasomhemmere i klinikken vil kreve forbedring i tumor levering. Bortezomib ga relativt lite proteasomhemmingen i våre xenograft studier sammenlignet med doksycyklin-indusert
PSMA1
shRNA knockdown. Strategier inkludert liposomal innkapsling, som har blitt ansatt for doxorubicin [43], eller bruk av andre generasjons proteasomhemmere som carfilzomib, marizomib eller MLN9708 [44] kan forbedre solid svulst penetrasjon og proteasomhemmingen.
resultatene av proteasomhemmingen i NSCLC pasienter som behandles uten strålebehandling har vært blandet [16], [17]. Proteasomhemmingen ble undersøkt med samtidig kjemoradioterapi i en fase I studie av tolv pasienter [45]. I denne doseøkning studien, pasienter med patologisk dokumentert Stage IIIA-B-sykdom fikk ukentlig carboplatin og paclitaxel, sammen med bortezomib 0,3-0,7 mg /m
2 ganger ukentlig, under strålebehandling til en dose på 61,2 Gy i 34 daglige fraksjoner, etterfulgt av kirurgisk reseksjon. Det var ingen uventede akutte toksisitet i løpet av kjemoradioterapi; Grade 2-3 myelosuppresjon var vanlig, som forventet med carboplatin og paclitaxel. Dessverre imidlertid tre av ni pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon døde postoperativt; to døde to til tre dager etter operasjonen og en tredje døde 21 dager etter operasjonen. Det ble konkludert med at forsinket toksisitet var alvorlig og uforutsigbar. Men alle tre pasienter hadde gjennomgått en riktig pneumonectomy etter høydose neoadjuvant kjemoradioterapi. Høyre pneumonectomy følgende neoadjuvant terapi har vært forbundet med betydelig økt dødelighet risiko, uavhengig av tilførsel av nye systemiske midler. For eksempel har det vært en rapportert 18% behandlingsrelatert dødelighet etter riktig pneumonectomy, sammenlignet med en 4% rente etter venstre pneumonectomy etter neoadjuvant strålebehandling til en median dose på 54 Gy med samtidig kjemoterapi [46].
Hva var bemerkelsesverdig om fase i-studie [45] var den høye frekvensen av patologisk komplett respons (pCR) observert hos pasienter behandlet med neoadjuvant kjemoradioterapi inkludert bortezomib. Prøver fra fem av de ni pasientene (56%) som gjennomgikk kirurgisk reseksjon viste en PCR, og en ytterligere to viste 99% nekrose. Dette sammenligner gunstig til 17,7% pCR rente observert i INT-0139 etter neoadjuvant kjemoradioterapi blant 164 pasienter som gjennomgikk reseksjon [47]. Disse dataene tyder på at, med forsiktighet, kan proteasomhemmingen være verdt å utforske videre kombineres med radikal kjemoradioterapi, kanskje i kirurgiske kandidater eller for venstre sidige eller andre svulster som ikke krever riktig pneumonectomy for reseksjon.
Til slutt, proteasome hemmere kan uforholdsmessig nytte pasienter med tumorer stole på HR-mediert reparasjon av stråleinduserte DNA DSB sin. For eksempel har høyt nivå av RAD51 proteinekspresjon blitt assosiert med redusert overlevelse av NSCLC [48]. Også har dårlig differensierte NSCLC tumorer økt uttrykk av HR gener [49]. I en analyse av publiserte microarray data fra 442 pasienter [9], høye nivåer av
RAD51 Hotell og
BRCA1
ble hver assosiert med redusert total overlevelse (figur S7). Disse funksjonene kan tjene som biomarkører som predikerer respons på proteasomhemmere som radiosensibiliserende. Dessuten kan reduksjoner i stråling-indusert DNA DSB reparasjon protein brennpunkter, inkludert FANCD2 og BRCA1, etter behandling med proteasomhemmere, fungere som biomarkører for respons hos behandlede tumorer.
Materialer og metoder
Reagenser
bortezomib ble kjøpt fra Selleck Chemicals (Houston, TX). 800 mM lager i DMSO ble lagret ved -20 ° C, og før bruk ble fortynnet og lagret ved 4 ° C i opp til en uke. Alle behandlinger var ved en sluttkonsentrasjon på 30 nM for A549 eller 50 nM for NCI-H460, med mindre annet er angitt. Følgende antistoffer ble brukt på de nevnte fortynninger for vestlige immunoblotter: PSMA1 (ARP40417, Aviva Systems Biology, San Diego, CA, 1:2000), PSMB5 (BML-PW8895, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, 1:1000), FANCD2 (sc-20022, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 1:200), vinculin (sc-25336, Santa Cruz Biotechnology, 1:1000), anti-mus (NA931v, GE Healthcare UK forente, Little Chalfont, Buckinghamshire , Storbritannia, 1:3000) og anti-kanin (NA934v, GE Healthcare UK United, 1:3000) pepperrot peroksidase bundet sekundære antistoffer. Følgende antistoffer ble brukt på de nevnte fortynninger for immunfluorescens: BRCA1 (sc-6954, Santa Cruz Biotechnology, 01:50), RAD51 (PC-130, EMD Millipore, Billerica, MA, 1:1000), FANCD2 (sc-20022 https://array.nci.nih.gov/caarray/project/details.action?project.experiment.publicIdentifier=jacob-00182.
