Abstract
Eikosanoider er bioaktive fett meglere avledet fra arakidonsyre
1 (AA), som er utgitt av cytosolisk fosfolipase A
2 (CPLA
2). AA metaboliseres gjennom tre hovedveier, syklooksygenase (COX), lipoksygenase (LO), og cytokrom P-450, for å frembringe en familie av eikosanoider, som hver for seg har vist seg å ha pro- eller anti-tumorigen aktivitet i kreft. Men kreft progresjon avhenger trolig av komplekse endringer i flere eikosanoider produsert av kreftceller og ved svulstens mikromiljø og en systematisk undersøkelse av spekteret av eikosanoider i kreft har ikke blitt utført. Vi brukte væskekromatografi kombinert med tandem massespektrometri (LC /MS /MS) for å kvantifisere eikosanoider produseres under tumorprogresjon lunge i en ortotopisk immunkompetente mus modell av lungekreft, hvori Lewis lungekarsinom (LLC) celler blir injisert inn i lungene av syngene mus . Tilstedeværelsen av tumor øket produkter av både cyklooksygenase og lipoksygenase-banene i en tidsavhengig måte. Sammenligning av svulster dyrket i CPLA
2 knockout vs villtype mus, vi demonstrert at prostaglandiner (PGE
2, PGD
2 og PGF
2a) ble produsert av både kreftceller og svulsten mikromiljøet ( TME), men leukotriene (LTB
4, LTC
4, LTD
4, LTE
4) produksjonen krevde CPLA
2 uttrykk i TME. Ved hjelp av flowcytometri, utvinnes vi tumor-assosiert nøytrofile granulocytter og 2 typer tumorassosierte makrofager fra tumorbærende lungene og vi har definert sine distinkte eicosanoid profiler av LC /MS /MS. Kombinasjonen av flowcytometri og LC /MS /MS avslører kompleksiteten eicosanoid produksjon i lungekreft og gir en begrunnelse for å utvikle terapeutiske strategier som er rettet mot utvalgte cellepopulasjoner å hemme bestemte klasser av eikosanoider
Citation. Poczobutt JM , Gijon M, Amin J, Hanson D, Li H, Walker D, et al. (2013) eicosanoid Profilering i en ortotopiske Modell av Lung Cancer Progresjon ved massespektrometri Demonstrerer Selektiv produksjonen av leukotriener av betennelsesceller i mikromiljøet. PLoS ONE 8 (11): e79633. doi: 10,1371 /journal.pone.0079633
Redaktør: Anthony Peter Sampson, University of Southampton School of Medicine, Storbritannia
mottatt: 20 august 2013; Godkjent: 04.10.2013; Publisert: 11.11.2013
Copyright: © 2013 Poczobutt et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var levert av NIH R01 CA162226 R01 CA108610 P50 CA058187. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eikosanoider representerer en familie av bioaktive lipider produsert gjennom metabolisme av arakidonsyre. Arakidonsyre (AA) er en flerumettet fettsyre, som er innlemmet i sn-2-stillingen av membran fosfolipider. Familien av PLA
to enzymene hydrolyserer membran fosfolipider for å produsere frie fettsyrer og lysophospholipids. Mens flere former for PLA
2 har blitt identifisert, cytosolic PLA
2-α, utpekt i denne studien som CPLA
2, er spesifikk for arachidonoyl inneholder fosfolipider, og er det viktigste enzymet som er involvert i regulert frigjøring av AA i respons til mitogen eller inflammatoriske stimuli [1]. Gratis AA kan metaboliseres gjennom tre store veier [2]. Cyklo-oksygenaser (COX-1, 2) fremstille prostaglandiner, deriblant PGE
2 og PGI
2 samt tromboksaner, lipoksygenaser produsere hydroxyeicosatetraenoic syrer (hetes) og leukotriener, og cytokrom P450 epoxygenases produsere epoxygenated fettsyrer (Eets). Over 100 forskjellige eicosanoid arter har blitt identifisert [3]. De fleste av disse molekyler er utskilt fra cellene og opptre på en autokrin eller parakrin måte gjennom en familie av G-protein-koblede reseptorer [4]. Repertoaret av eikosanoider produsert av en bestemt celletype vil bli styrt av uttrykk av enzymer i veien, inkludert spesifikke nedstrøms synthases. For eksempel, PGE
2-produksjon vil bli regulert ved ekspresjon av cyklooksygenase-enzymene så vel som prostaglandin E2 synthases, mens spesifikke leukotriener, så som LTC
4 krever ekspresjon av 5-lipoksygenase, samt LTC
4 syntase.
Lungekreft er forbundet med det høyeste antallet kreftdødsfall hos både menn og kvinner, og understreker behovet for nye terapeutiske og forebyggende tilnærminger [5]. Studier på en rekke kreftformer, blant annet lungekreft, har innblandet individuelle eikosanoider som formidlere av kreft initiering, progresjon og metastasering. Mest omfattende studert er prostaglandiner, spesielt PGE
2. Studier i kreftcellelinjer har vist økt produksjon av PGE
2 formidlet gjennom induksjon av COX-2 og CPLA
2 uttrykk [6] – [8]. Hemming av prostaglandin produksjon via blokkering av enten CPLA
2 eller COX-2-hemmer vekst av transformerte ikke-småcellet lungecancerceller (NSCLC), og utvikling av tumorer i mus som respons på kjemiske karsinogener [9]. Vi viste at mus som er mangelfull i CPLA
2 (CPLA
2-KO) viser hemning av tumor lunge initiering ved hjelp av en kjemisk karsinogenese modell [10]. I motsetning til dette, PGI
2, som også er produsert nedstrøms fra COX-enzymer, har vist seg å hemme lungekreft initiering, samt å ha anti-metastatiske virkninger [11]. Øket ekspresjon av 5- og 12-lipoksygenase har også vært assosiert med tumorer, inkludert lungekreft [12]. I motsetning til dette ser ut til ekspresjon av 15-lipoksygenase-2 til å gå tapt i lungekreft, og kan spille en anti-tumorigen rolle [13]. Lipoksygenase-produkter har direkte virkninger på tumorceller, men er også regulatorer av angiogenese og kan modifisere immunfunksjon [12]. Nylig epoxyeicosatrienoic syrer (Eets) som produseres via cytokrom P450 reaksjonsveien har vært innblandet som regulatorer av metastasering, som virker i det minste delvis gjennom endoteliale-spesifikke effekter på fjerntliggende organer [14]. Mens kombinasjoner av COX og lipoksygenaseinhibitorer er blitt anvendt som terapeutiske midler og har vist seg fordelaktige effekter i NSCLC [15], effekter på metastase har ikke blitt undersøkt. I tillegg til studier som fokuserer på kreftceller, har flere rapporter implisert eikosanoider, spesielt PGE
2, slik som regulatorer av svulsten mikromiljøet (TME) [16], [17]. PGE
2 signale gjennom EP3 /EP4-reseptorer fører til rekruttering av kreft assosiert fibroblaster [18]. PGE
2 har også vist seg å være kritisk for å fremme dannelsen av T-lymfocytter regulatoriske [19]. Dermed er kreft progresjon vil sannsynligvis innebære komplekse endringene i flere eikosanoider med potensielt motstridende biologiske effekter. Både kreftceller og celler av mikromiljøet som er potente produsenter av eikosanoider, og tumorprogresjon vil avhenge av en integrert respons på et spektrum av eikosanoider produsert i en tid og rom måte.
En begrensning i lungekreft forskning er mangelen på egnede musemodeller av metastatisk lungekreft. Vi har nylig utviklet en immunkompetente ortotopisk modell i hvilken murine lungekreftceller er direkte implantert i venstre lapp i syngeniske mus [20], [21]. Disse cellene danner en primærtumor som over en periode på 3-5 uker metastasizes til lymfeknuter samt lever og hjerne. Ved hjelp av denne modellen, har vi vist at svulster vokser i mus globalt mangelfulle i CPLA
2 har en markert svekkelse i progresjon og metastasering [21]. Siden de injiserte tumorcellene uttrykt vill-type CPLA
2, indikerer disse data at produksjonen av eikosanoider av celler av svulsten mikromiljøet er kritisk for lungekreft progresjon og metastasering. Imidlertid har de kritiske eikosanoider medierer slik effekt ikke blitt definert.
Ankomsten av massespektrometrisk analyse av lipider har muliggjort måling av flere eicosanoid produkter fra både celler og vev [22]. Denne teknikken gjør det mulig for kvantitativ bestemmelse av et stort antall (mer enn 25) av forskjellige produkter. Målet med denne studien var å bruke massespektrometrisk tilnærming til systematisk definere endringer i eikosanoider under lungekreft progresjon, og bestemme hvilken rolle forskjellige cellepopulasjoner i å skape denne profilen. Bruke immunocompetent orthotopic modell i villtype og CPLA
2 knockout mus vi er i stand til å vurdere bidraget av svulsten mikromiljøet til produksjon av enkelt eikosanoider. Våre resultater viser en kompleks eicosanoid mønster under tumorprogresjon, og identifisere spesifikke betennelsesceller i TME som selektivt bidra til eicosanoid produksjon.
eksperimentelle prosedyrer
Cells
Luciferase-uttrykke Lewis lunge carcinoma celler (LLC-Luc) ble oppnådd fra ATCC og holdt i DMEM (Corning Cellgro # 19-017-CV) inneholdende 10% føtalt bovint serum, penicillin /streptomycin og G418 (500 ng /ml).
mus
CPLA
2 knockout (CPLA
2-KO) mus på en C57BL /6 bakgrunn [21], [23] og villtype C57BL /6 mus ble avlet og vedlikeholdes i Senter for komparativ medisin ved University of Colorado Denver. Forsøkene ble gjort i 12-16 uker gamle mus, både menn og kvinner, med mus av ulik alder og kjønn likt representert i alle eksperimentelle grupper. Alle prosedyrer ble utført under protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Colorado Denver.
ortotopiske Mouse modell
Advisor-Luc celler (2 × 10
5) ble suspendert i PBS inneholdende 15% Matrigel (BD Biosciences) og injisert i parenchyma fra venstre lunge lapp gjennom brystkassen ved hjelp av en 30G nål. For å direkte visualisere lunge en 4-5 mm snitt ble gjort i huden under venstre skulder og underhudsfett ble fjernet. Etter prosedyren ble snittet lukkes med veterinær lim. Primær tumorstørrelse ble målt ved hjelp av digitale calipers.
Utvinning og massespektrometri måling av eicosanoids
Mus ble ofret på 2 eller 3 uker etter kreftcelle injeksjon og hele venstre lunge lapp som inneholder svulsten var skåret ut, veiet og flash-frosset i flytende nitrogen. Frosne vev ble homogenisert i 1 ml iskald sukrose-buffer (250 mM sukrose, 50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) inneholdende proteaseinhibitorer ved hjelp av motordrevet homogenisator. Aliquoter ble tatt for proteinmåling. Den gjenværende Homogenatet ble umiddelbart blandet med 2 volumdeler iskald metanol. Protein ble målt ved anvendelse av Bradford-reagens (Bio-Rad).
Eikosanoider ble ekstrahert og analysert i det vesentlige som beskrevet tidligere, med noen modifikasjoner [24]. Etter tilsetning av stabile isotop-merkede interne standarder (2 ng av hver, med unntak av de cys-LTS, hvorav 5 ng ble tilsatt) til metanolholdige homogenater, ble eikosanoider ekstrahert ved hjelp av fast fase-patron (Strata-X 33 um Polymer Reversed fase, Phenomenex), eluert med metanol, tørket og resuspendert i 60 pl av 2 volumer av løsningsmiddel A (8,3 mM ammoniumacetat, pH 5,7) og 1 volum av løsningsmiddel B (acetonitril /metanol 65:35 v /v). En 25 ul-prøve ble deretter analysert ved LC-MS /MS ved å bruke en Ascentis C18 HPLC-kolonne (150 x 2 mm, 5 um; Supelco) tilkobles med den elektrospray kilde for en trippel kvadrupol massespektrometer (Sciex API-3000, PE-Sciex , Thornhill, Ontario, Canada). Prøvene ble eluert ved en strømningshastighet på 200 mL /min med en lineær gradient fra 25% til 100% av løsningsmiddel B, som ble øket fra 25% til 85% i 24 min, til 100% i 26 minutter, og holdt ved 100 % i ytterligere 12 min. ble utført massespektrometrisk analyse i negativ ion modus bruker flere reaksjon overvåking av følgende spesifikke
m /z
transitions:
369.300→169.100TXB
2
369.300→163.1006-keto-PGF
1α
353.300→193.100PGF
2α
351.300→271.200PGE
2
351.300→233.200PGD
2
333.300→189.100PGA
2 og PGJ
2
315.300→203.20015deoxy-PGJ
2
351.300→217.200LXA
4
351.300→221.200LXB
4
335.300→195.100LTB
4
335.200→115.1005,6-diHETEs
365.300→195.10020-COOH-LTB
4
351.300→195.10020-OH-LTB
4
624.500→272.200LTC
4
495.400→177.100LTD
4
438.300→333.300LTE
4
319.300→115.1005HETE
335.300→203.2005HpETE
317.300→203.2005oxoETE
319.300→179.10012HETE
319.300→219.20015HETE
343.300→245.20017OH-DHAa
343.300→273.20017OH-DHAb
327.300→283.200DHA
303.300→205.200AA
319.200→191.1005,6-EET
319.200→155.1008,9-EET
319.200→208.10011,12-EET
319.200→175.10014,15-EET
373.300→173.100[
2H
4]-TXB
2
357.300→197.100[
2H
4]-PGF
2α
373.300→167.100[
2H
4]-6-keto-PGF
1α
355.300→275.200[
2H
4]-PGE
2
339.300→197.100[
2H
4]-LTB
4
629.500→272.200[
2H
5]-LTC
4
500.300→177.100[
2H
5]-LTD
4
443.300→338.300[
2H
5]-LTE
4
327.300→116.100[
2H
8]-5HETE
311.300→267.200[
2H
8]-AA
Quantitation ble utført ved bruk av standard isotopfortynning som beskrevet tidligere [25]
Utarbeidelse av enkelt celle suspensjon og sortering av flowcytometri
Mus ble ofret på 2,5 uker etter kreftcelle injeksjon, ble sirkulasjonen dynket med PBS /heparin (80 U /ml, Sigma), og venstre lungelappen inneholdende tumorer ble skåret ut. Vev fra 4 mus ble slått sammen, mekanisk dissosiert, inkubert ved 37 ° C i 40 minutter med Collagenase A (1 mg /ml, Roche) og DNase I (40 ug /ml, Sigma), og behandles ved hjelp av GentleMACS dissociator C-rør (Miltenyi Biotec). Dannede encellede suspensjoner ble filtrert gjennom 70 mikrometer celle siler (BD), i henhold til de røde blodcellene-lyse hjelp hypoton buffer og filtrert andre gang gjennom 40 mikrometer celle siler. Før farging ble FcγR blokkert med anti-CD16 /CD32 (BD Biosciences) i 20 minutter. Celler ble farget i 1 time ved 4 ° C med følgende antistoffer: CD11b-FITC (klon M1 /70, BD Biosciences), SiglecF-PE (klon E50-2440, BD Biosciences), Ly6G-PE-Cy7 (klon 1A8, BD Biosciences), F4 /80-APC (Clone CI: A3-1, AbDSerotec), CD11c-APC-Cy7 (Clone HL3, BD Biosciences). Cellene ble sortert ved University of Colorado Cancer Center flowcytometrisystemer Kjerne hjelp XDP-100 (Beckman Coulter). Sorterings strategi involvert med unntak av rusk og celle dubletter ved lysspredning, og døde celler av DAPI (1 pg /ml). Data ble analysert ved hjelp Kaluza programvare (Beckman Coulter)
Behandling av flowcytometri-sortert celler for måling av eicosanoid produksjon
Umiddelbart etter sortering, 1,5 -. 2,0 × 10
5 av celler av hver type ble pelletert, resuspendert i PBS uten serum og behandlet med kalsium ionofor (A23187, 0,5 pM) i 12 minutter. Reaksjoner ble avsluttet ved tilsetning av iskald metanol.
Kvantitativ sanntids-PCR
Total RNA ble isolert fra strømnings-cytometri-sorterte cellene ved bruk av RNeasy QIAshredder og Micro kit (Qiagen) . Ekstrahert RNA ble omdannet til komplementært DNA med den iScript cDNA syntese kit (BioRad). Real time PCR ble utført ved hjelp av MyIQ Real Time PCR Detection System (BioRad) med følgende primere: CPLA
2: Fwd 5′-GTGGTGGCCATTTTGGGTTC-3 «, Rev 5′-TCGGGGTGAGAGTACAAGGT-3′, COX-2: Fwd 5»-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC-3 «, 5′-Rev CACGTAGTCTTCGATCACTATC-3′, COX-1: 5»-Vs ATGGATACTGGCTCTGGGAA -3 «, 5′-Rev CTGAGTTGTAGGTCGGAGGG -3′, 5-LO: Vs 5»- ACTACATCTACCTCAGCCTCATT-3- «, Rev 5’GGTGACATCGTAGGAGTCCAC-3», LTC4S: Fwd 5’GTCTTCCGAGCCCAGGTAAA-3 «, Rev 5’CGCGCGTATCCCTGGAAATA-3», LTA4H: Fwd 5’ATCTCTCTTCCCATCGCCCT-3 «, Rev 5′-CTTTCGGGACAGACACCTCT-3» , TXAS1: VS: 5’GCTTCCACCTTCTGTATCCC-3 «, Rev: 5’TCTCGGTTCTTATTGGGCAG-3», MAGL: VS: 5’CGAACTCCACAGAATGTTCCCTA -3 «, Rev: 5’ACAAAGATGAGGGCCTTGGGT – 3», β-actin: Fwd : 5’GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 «, Rev 5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATG- 3», GAPDH: Fwd 5’CGTGGAGTCTACTGGTGTCTTC – 3 «, Rev 5’CGGAGATGATGACCCTTTTGGC -3» Ubiquitin C: VS: 5’CCACACAAAGCCCCTCAATC-3 «, Rev: 5’AAAGATCTGCATCGTCTCTCTCAC-3 «
Statistiske . Computational Analyser
Vi brukte Friedman Chi-Square test analyse for å vurdere forskjellen mellom tumorbærende lungene fra WT og CPLA
2-KO mus høstet på 3 uker. Rank score, i stedet for rå eicosanoid nivåmålinger, ble brukt i testen. Vi søkte False Discovery Rate (FDR) kontrollen til p-verdier hentet fra Chi-Square test, for å korrigere for multiple sammenligninger. FDR verdier betraktes som «justert» P-verdier. Vi konkluderte med at en forening er viktig når FDR verdien er mindre enn 0,05.
Resultater
Flere eikosanoider er økt i tumorbærende mus
Ved hjelp av en orthotopic immunocompetent musemodell, hvori tumorceller ble injisert inn i lungene hos mus, har vi tidligere viste at tap av CPLA
2 i tumoren mikromiljøet inhibert lungekreft metastase [21]. Disse effektene er antakelig på grunn av endret produksjon av spesifikke eikosanoider kritiske for tumorprogresjon og metastasering. Å definere spekteret av eikosanoider produseres under lungetumorprogresjon hos orthotopic lungekreft modellen vi brukte væskekromatografi kombinert med tandem massespektrometri (LC /MS /MS)
Lewis lungekarsinom celler (LLC-Luc. 2 × 10
5), avledet fra en lunge adenokarsinom i en C57BL /6 mus, ble injisert inn i den venstre lungelappen av syngeniske WT mus. Hele venstre lungelappen inneholdende tumorer ble høstet ved 2 og 3 uker etter injeksjon, sammen med venstre fliker fra kontrollmus injisert med PBS /Matrigel. Eikosanoider ekstrahert fra de høstede lungene ble analysert ved LC /MS /MS og normalisert til proteininnholdet i prøven. Vi overvåket flere produkter av den cyklooksygenase (COX), lipoksygenaser (LO), og cytokrom P450-trasé. I tillegg målte vi gratis arakidonsyre (AA) og dokosaheksaensyre (DHA).
I WT mus nivåer av eikosanoider ble generelt økt med kreft progresjon, men med ulike grader av induksjon og ulike tidsmessige mønstre (tabell 1 og Figur 1). Vi differensiert en gruppe av eikosanoider som var oppregulert 3-7 ganger på tidligere to-ukers tidspunkt (tidlig eikosanoider): PGE
2, PGF
2α, LTC
4 og LTE
4 (fig. 1A). Nivåer av denne undergruppe av eikosanoider ble ytterligere økt til 3 uker. Sammenlignet med Matrigel-injiserte mus, PGE
2 ble oppregulert 45-fold, som var den høyeste økningen av alle eikosanoider. LTC
4 og LTE
4 ble også sterkt øket, 12 og 13 ganger, respektivt. Nivåene av PGF
2α ikke ytterligere økning på 3 uker. En annen gruppe inkludert eikosanoider som ikke ble økt ( 2-fold) på 2 uker, men økte betydelig på 3 uker (slutten av eikosanoider, fig 1B.). Noen av de sene eikosanoider: PGD
2, TXB
2 (den stabile metabolitten av TXA
2) og AA ble sterkt oppregulert (7-10 ganger sammenlignet med Matrigel injisert), mens andre (5-, 12-, ble 15-HETE, og DHA) oppregulert moderat (3-4 ganger). LTB
4, som var upåviselig ved 2 ukers tid punkt, ble påvist i 50% av dyrene i 3 uker. To av eikosanoider: LTD
4 og 6-keto-PGF
1α (den stabile metabolitten av PGI
2), var uendret eller bare marginalt oppregulert på enten 2 eller 3 uker (figur 1C.). Verken lipoxiner eller cytokrom P450-produkter (5,6-EET, 8,9-EET, 11,12-EET, 14,15-EET), ble oppdaget på noen tidspunkter.
Advisor-Luc celler eller matrigel (kontroll) ble injisert inn i venstre lungelappen av WT C57Bl /6-mus og tumorbærende og styrer lungene ble høstet 2 eller 3 uker etter injeksjonen. Eicosanoid-nivåene ble analysert ved hjelp av LC /MS /MS og normalisert til proteininnholdet i prøven. Nivåer på grafer er uttrykt som fold over kontrollen. A. Tidlig eikosanoider – indusert 3 ganger på 2 uker, og ytterligere økning på 3 uker. B. Late eikosanoider – ikke oppregulert ( to ganger) på to uker, men økte på 3 uker. C. Uendret eikosanoider.
Sletting av CPLA
2 i TME forskjellig påvirker eikosanoider
Siden CPLA
2 er det hastighetsbegrensende enzym i eicosanoid biosyntese, målte vi eicosanoid produksjon i lungesvulster dyrket i CPLA
2-Knockout mus. For å oppnå dette, samtidig som de WT mus ble injisert, vi også injisert kjøretøy (Matrigel) eller LLC-Luc-celler i mus som mangler globalt CPLA
2. Med denne eksperimentelle strategi, er CPLA
2 slettet i alle celler i svulsten mikromiljøet, mens villtype uttrykk opprettholdes i kreftcellene. Dyrene ble avlivet ved 2 og 3 uker etter injeksjonen og eicosanoid-profiler i tumor-bærende eller kontroll venstre lungelappen ble bestemt ved LC /MS /MS.
Som vist i fig. 2A, vekst av primære svulster var ikke annerledes i villtype vs. CPLA
2-KO mus, i tråd med vår forrige observasjon [21]. Analyse av eicosanoid profiler (tabell 2 og 2B Fig.) Viste at basalnivåer av eikosanoider i CPLA
2-KO mus var generelt noe lavere, men ikke signifikant forskjellig fra WT kontrollmus. Med lungetumorprogresjon, økt eicosanoid produksjon i både WT og CPLA
2-KO mus; imidlertid at økningen var signifikant avstumpet i tumorbærende CPLA
2-KO mus. Nivået av hemning i CPLA
2-KO mus varieres innen vide grenser mellom de forskjellige analytter, i området fra 25% til over 90% inhibering. Dette resultatet indikerer at man kan lage et skille mellom eikosanoider som produseres hovedsakelig av mikromiljøet (fullstendig hemmet i innstillingen av CPLA
2 knockout), og eikosanoider bidratt både med mikromiljøet og kreftceller (redusert delvis). Detaljert analyse av eicosanoid profilene viste at AA og DHA viste den minste reduksjon i forbindelse med CPLA
2-mangel, ca. 25% etter 3 uker (tabell 2). 5-, 12- og 15-HETE var i gjennomsnitt redusert med 50% i CPLA
2-KO-mus sammenlignet med WT-mus (Tabell 2). Produkter av COX vei viste ulike grader av hemming i innstillingen av CPLA
2 mangel. Mens TXB
2 og 6kPGF
1α ble redusert med 80% etter 3 uker, de andre prostaglandiner (PGE
2, PGD
2 og PGF
2a) var i gjennomsnitt 50% lavere enn i WT mus (Tabell 2 og 2B fig.). Den største inhibering forbundet med CPLA
2-mangel i mikromiljøet ble påvist i den leukotrien-gruppen (tabell 2 og 2B fig.). Økningen i begynnelsen av leukotriener, LTC
4 og LTE
4, ble forsinket inntil 3 uker i CPLA
2-KO-mus sammenlignet med WT mus, og deres nivåene ble redusert med 90% for LTC
4 og 75% for LTE
4. Leukotrien LTB
4, som ble indusert i 3 wk WT tumorbærende lungene, ble ikke påvist i CPLA
2-KO mus som helst punkt. Nivåene av LTD
4, mens ikke økt med tumorprogresjon, var lavere med 80% i 3-ukers CPLA
2-KO svulster.
Advisor-Luc celler eller matrigel (kontroll) var injisert i venstre lungelapper av WT eller CPLA
2-KO mus. Injeksjonene ble gjort på 3 forskjellige dager med kontroll vs. svulsten og WT vs. CPLA
2-KO grupper likt representert på hver dag. Venstre fliker som bærer tumorer og kontroll Lungene ble høstet 2 eller 3 uker etter injeksjon ble eikosanoider analysert ved LC /MS /MS og normalisert til proteininnholdet i prøven. Hvert punkt representerer en enkelt mus. Barer representerer medianverdier. A. vekt på tumorbærende og kontrollere lungene B. Velg eikosanoider
distinkte populasjoner av betennelsesceller i TME har ulike eicosanoid profiler
TME er sammensatt av flere celletyper, inkludert inflammatoriske celler, fibroblaster og adaptive immunceller. For å begynne å definere hvilke av disse cellepopulasjoner produserer leukotriener i innstillingen av tumorprogresjon, brukte vi flowcytometri å isolere betennelsesceller fra lungene av tumorbærende mus. Ved hjelp av markører som tidligere er brukt for å karakterisere betennelsesceller i lungene, vi definert nøytrofile (Neu, CD11b + /Ly6G +), samt to populasjoner av makrofager, som er utpekt som maca (SigF + /CD11c + /F480 + /CD11b lav) og MacB (F480 + /CD11b + /Ly6G- /SigF-), (fig. 3A). Basert på tidligere studier [26], [27], Maca representerer bosatt alveolære makrofager [27], mens MacB er en heterogen befolkning i hovedsak består av infiltrerende monocytter og makrofager, og inneholder også interstitielle makrofager, og CD11b + dendrittiske celler [27], [ ,,,0],28]. I innstillingen av tumorer, ble antallet celler MacB markert øket, mens Maca populasjonen var ikke signifikant endret sammenlignet med kontroll-mus ikke injisert med cancerceller (Fig. 3B).
LLC-Luc-celler ble injisert inn i venstre lungelapper av WT eller CPLA
2-KO mus og tumorbærende lungene ble høstet 2,5 uker senere. Vev fra 4 mus ble slått sammen, og inflammatoriske celler ble gjenvunnet ved strømningscytometri. A. Sekvensiell flowcytometri gating strategi som brukes til å gjenopprette betennelsesceller: Neu: nøytrofile (CD11b + /Ly6G +), Maca makrofager (SigF + /CD11c + /Ly6G-) og MacB makrofager (F480 + /CD11b + /Ly6G- /SigF-). B. antall celler utvinnes av flowcytometri fra injiserte eller tumorbærende venstre lungelapper av WT og CPLA
2-KO mus. Data viser gjennomsnittet fra 3 separate eksperimenter, med hver sorterings utført på en pool av 4 mus. Feilsøylene viser SEM
For å bestemme potensialet for eicosanoid produksjon av disse tre gruppene av betennelsesceller, utvinnes vi dem ved flowcytometri fra lungene av tumorbærende mus, og undersøkt mRNA uttrykk av enzymer i eicosanoid sti ved QRT-PCR. Analyse av mRNA viste signifikante forskjeller i ekspresjonen av eicosanoid spredningsveier enzymer mellom forskjellige inflammatoriske celler (fig. 4). Alle tre populasjoner uttrykt CPLA
2, selv om nivåene var høyere i Maca celler enn i MacB eller nøytrofile. COX-1 ble også uttrykt i alle 3 celletyper, og vi ikke påvise signifikante forskjeller i nivåene, noe som tyder på at alle disse populasjonene kan produsere prostaglandiner. Men COX-2 ble selektivt uttrykt i nøytrofile, med lave nivåer i MacB og nesten umulig å oppdage i Maca. Siden inflammatoriske cytokiner induserer prostaglandiner gjennom økt COX-2 uttrykk, ville vi spår at prostaglandin produksjonen skulle formidles hovedsakelig gjennom nøytrofile granulocytter og MacB. Tromboksan-syntase TXAS1 ble også påvist i alle tre celletyper. 5-LO var høyest i Maca celler, nøytrofile uttrykt 50-70% lavere nivåer, og uttrykk i MacB var 90% lavere enn i Maca. Dette skulle tilsi at leukotriene produksjon i innstillingen for tumorprogresjon er i stor grad hentet fra Maca eller nøytrofile, med rekruttert MacB befolkningen bidrar svært lite. LTA4H ble uttrykt i alle 3 celletyper, mens ekspresjonen av LTC4S var begrenset bare til Maca celler. Alle de analyserte enzymer ble uttrykt på samme nivå i WT og CPLA
2-KO mus, med unntak av CPLA
2, som, som forventet, var ikke påvises i celler avledet fra CPLA
2-KO . Ettersom fri AA kan frigjøres av andre enzymer enn CPLA
2, slik som monoacyl glycerol lipase (MAGL) [29] vi målte MAGL nivåer i isolerte celler. Maçã celler viste høye nivåer av MAGL sammenlignet med enten MacB celler eller nøytrofile celler (data ikke vist). Dette resultatet fører til prediksjon at CPLA
2 mangel vil ha mindre påvirkning på eicosanoid produksjon av Maca celler enn ved MacB eller neutrophils.To bekrefte potensialet for eicosanoid produksjon av Maca, MacB og nøytrofile populasjoner ble cellene utvunnet fra tumorbærende mus ved strømningscytometri og stimulert med kalsiumionofor A23187. Eicosanoid produksjon ble bedømt ved LC /MS /MS (fig.5). Sammen med de sorterte celler, undersøkte vi eicosanoid produksjon av dyrkede Advisor-Luc kreftceller. Den største repertoar av eikosanoider ble produsert av Maca celler. Etter avtale med sin høye uttrykk for 5-LO og eksklusivt uttrykk for LTC4S, Maca var de eneste som er i stand til å produsere cysteinyl leukotriener, LTC
4 og LTD
4. Maca også produsert LTB
4, om enn mindre enn nøytrofile, 5-HETE, og 5oxoETE. Til tross for deres lave ekspresjon av COX-2, men i samsvar med ekspresjon av COX-1, Maca celler var i stand til å produsere PGE
2 og TXB
2. Interessant nok var eicosanoid produksjon av Maçã celler fra CPLA
2-KO mus redusert i forhold til WT, men bare med omtrent 50%. Disse dataene tyder på at ytterligere trasé distinkte fra CPLA
2, slik som MAGL handling for å tilveiebringe AA i disse cellene. MacB cellene produserte lavere nivåer av eikosanoider. Som de mangler 5-LO, MacB var ikke i stand til å produsere leukotriener. Til tross for ekspresjon av enzymer i cyklooksygenaseveien, MacB produsert bare lave nivåer av PGE
2 og TXB
2, som ble redusert med 80% i innstillingen av CPLA
2-KO. Nøytrofile, som uttrykker 5-LO, men ikke LTC4S, produsert LTB
4 på nivåer 3 ganger høyere enn Maca, men ingen cysteinyl leukotriener. I samsvar med sin høye uttrykk for COX-2, nøytrofile produsert PGE
2, på nivåer 4 ganger høyere enn Maca. De har også produsert 5-HETE og TXB
2, på nivåer lavere enn Maca celler. I innstillingen av CPLA
2-mangel, nøytrofil produksjon av eikosanoider ble redusert over 90% sammenlignet med WT mus. Blant andre metabolitter, 12-HETE, PGF
2α, 15-HETE, AA, og DHA ble produsert av alle 3 celletyper. I motsetning til myeloide celler utvinnes fra TME, LLC-Luc celler produsert et begrenset spekter av eikosanoider. Deres viktigste produkt var PGE
2, oppdaget på nivåer rundt 10 ganger høyere enn i myeloide celler. Vi har også oppdaget at PGF
2α, 15-HETE og relativt lave nivåer av DHA og AA. Det er ingen leukotrienene ble påvist, i samsvar med våre in vivo data som indikerer at leukotriener er selektivt produsert av TME.
Relative mRNA-ekspresjon i celler utvunnet fra tumorbærende lungene ved strømningscytometri. Ekspresjon ble bedømt ved QRT-PCR, normalisert til det geometriske gjennomsnitt av β-aktin, GAPDH, Ubiquitin C, og 18s, og uttrykt som% Maks blant de analyserte cellegrupper. Eksperimenter ble utført på 2 separat injisert og analysert bassenger av mus (4 mus per WT eller cPLA2-KO gruppe per pool). Fylte sirkler – pool # 1, åpne sirkler – pool # 2, bar -. Gjennomsnitts av bassengene
eicosanoid produksjonen i cellene utvinnes fra tumorbærende lungene ved flowcytometri. Gjenvundne celler ble stimulert med ionofor A23187 (0,5 pM) i 12 minutter. Ekstraherte eikosanoider ble analysert ved LC /MS /MS. Eksperimenter ble utført på 2 separat injisert og analysert bassenger av mus (4 mus per WT eller cPLA2-KO gruppe per pool). Fylte sirkler – pool # 1, åpne sirkler – pool # 2, bar -. Gjennomsnitts av bassengene
Diskusjoner
Eikosanoider representerer en stor familie av bioaktive signalmolekyler med variert og potensielt motstående biologiske effekter. Selv om mye arbeid har fokusert på spesifikke eikosanoider og deres rolle i kreft, har det ikke vært en systematisk forsøk på å definere spekteret av disse molekylene i innstillingen av kreft. En stor mengde litteratur har definert både pro- og anti-tumorigen roller for produkter av både cyklooksygenase og lipoksygenase trasé [30], [31]. Våre studier benyttet en immunkompetente ortotopisk modell av lungekreft progresjon, kombinert med en lipidomiske massespektrometri metode for å demonstrere at lungekreft er forbundet med progresjon økning i flere eicosanoid produkter som er avledet fra både cyklooksygenase og lipoksygenase-reaksjonsveier. Individuelle eikosanoider viste forskjellige tidsavhengigheter, med et delsett økes ved det tidligste tidspunkt analysert, mens et andre subsett syntes å ha en mer forsinket løpet av induksjon. Flere produkter (f.eks 6k-PGF
1α) ikke ble endret, og produkter av cytokrom P450 sti eller lipoxiner ble ikke påvist i vår modell.
