Abstract
Til dags dato, ondartede feokromocytomer og paragangliomas (PHEOs /PGLs) kan ikke være effektivt kurert og dermed nye behandlingsstrategier er sterkt behov. Lovastatin har blitt vist å effektivt indusere apoptose i mus PHEO celler (MPC) og de mer aggressive vev-avledede celler mus tumor (MTT), som ble ledsaget av redusert fosforylering av mitogen-aktivert kinase (MAPK) pathway spillere. Den MAPK pathway spiller en rolle i en rekke aggressive svulster og har vært forbundet med en undergruppe av PHEOs /PGLs, inkludert
K-RAS-
,
RET-
, og
NF1
-mutated svulster. Vårt mål var å etablere hvorvidt MAPK signal kan også spille en rolle i aggressive, succinatdehydrogenase (SDH) B mutasjon-avledet PHEOs /PGLs. Expression profilering og western blot analyse viste at spesifikke aspekter av MAPK-signal er aktive i SDHB PHEOs /PGLs, noe som tyder på at hemming av statin behandling kan være gunstig. Videre ønsket vi å vurdere om den anti-proliferativ effekt av lovastatin på MPC og MTT skilte seg fra det som utøves av fluvastatin, simvastatin, atorvastatin, pravastatin, eller rosuvastatin. Simvastatin og fluvastatin redusert celleproliferasjon mest effektivt, og de mer aggressive MTT-celler viste seg mer følsomme i denne henseende. Hemming av MAPK1 og tre fosforylering etter behandling med fluvastatin, simvastatin og lovastatin ble bekreftet av western blot. Økte nivåer av CASP-3 og PARP-spaltning bekreftet induksjon av apoptose etter behandling. Ved en konsentrasjon lav nok til ikke å påvirke celle-proliferasjon, migrering av spontan MPC og MTT ble signifikant inhibert innen 24 timer etter behandling. I konklusjonen, kan lipofile statiner presentere et lovende terapeutisk alternativ for behandling av aggressive menneske paragangliomas ved å indusere apoptose og hemme tumorspredning
Citation. Fliedner SMJ, Engel T, Lendvai NK, Shankavaram U, Nolting S, Wesley R , et al. (2014) Anti-Cancer Potential av MAPK Pathway Hemming i Paragangliomas-effekten av ulike Statiner på Mouse feokromocytom Cells. PLoS ONE 9 (5): e97712. doi: 10,1371 /journal.pone.0097712
Redaktør: Benjamin Edward Rich, Dana-Farber Cancer Institute, USA
mottatt: 10 januar 2014; Godkjent: 22 april 2014; Publisert: 20 mai 2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Finansieringen ble gitt av egenutført forskningsprogrammer av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development og National Human Genome Research Institute , National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA og den første Department of Medicine, University Medical Center Schleswig-Holstein, Lübeck, Tyskland. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nylig, lovastatin har blitt foreslått som lovende potensial terapeutisk alternativ for å behandle RET, NF1, og TMEM127 mutasjon-avledet katekolaminer produsere adrenalin og ekstra adrenal chromaffin celle svulster (feokromocytomer (PHEOs) og paragangliomas (PGLs), henholdsvis ) [1]. Imidlertid er det risiko for metastatisk sykdom i disse tumorene forholdsvis lav og tumorreseksjon er således nesten alltid kurativ. I kontrast, risikoen for ondartede PHEOs /PGLs er spesielt høy i tilfelle av succinatdehydrogenase B (SDHB) genmutasjoner [2], [3], og nye behandlingsstrategier er sterkt behov for denne tilstanden.
En fersk New England Journal of Medicine Artikkel rapportert redusert kreftrelatert dødelighet hos pasienter som ble foreskrevet statiner tidligere diagnose [4]. Etter avtale med dette, mange
in vitro Hotell og
in vivo
studier viste anti-kreft effekt av lovastatin og andre statiner alene eller som en del av en samlet behandlingsregime for aggressive svulster (anmeldt i [ ,,,0],5] – [7]). Ved høyere konsentrasjoner enn det som er nødvendig for reduksjon av kolesterolnivåer, har statiner blitt vist å inhibere mevalonat pathway sterkt nok til å inhibere syntesen av isoprenoider, som virker som er nødvendige membranankere for riktig funksjon av visse proteiner [8]. Den anti-kreft effekt av statiner har hovedsakelig vært assosiert med inhibering av Ras-prenylation (dvs. farnesylering eller geranylgeranylation), som blant andre effekter, forstyrrer aktiveringen av nedstrøms spillere i MAPK-reaksjonsveien [9], [10]. Over-aktivering av mevalonat reaksjonsvei, inkludert MAPK-signalering har vist seg å være tilstrekkelig for celletransformasjon [11]. Overdreven MAPK signalering støtter apoptose inhibering, proliferasjon og migrasjon og er en viktig karakteristisk for mange krefttyper (oppsummert i [12], [13]). Ved PHEOs /PGLs, forhøyet MAPK pathway aktivitet er tydelig i
H-RAS
,
K-RAS
,
TMEM127
,
RET
,
NF1
, og muligens
MAX
mutasjon-relaterte svulster [14] – [22]
Så vidt vi vet, ikke noe bevis for økt MAPK signal i SDHB-avledet. PGLs har blitt presentert. I celler fra pasienter Cowden-lignende syndrom og SDHB eller D genvarianter, men økte nivåer av MAPK 1 og 3 fosforylering har blitt observert [23]. I nærvær av en aktiv MAPK vei, kan statiner gir en lovende behandling eller co-behandlingsalternativ for øyeblikket fatale ondartede PGLs.
Omfanget av anti-kreft effekt har vist seg å variere avhengig av modell og type av statin alle [24] – [30]. Derfor vurderte vi hvilke av de syv tilgjengelige statiner kan være mest effektive for PHEO /PGL behandling.
Materialer og metoder
Fluvastatin, pravastatin, lovastatin og simvastatin ble alle hentet fra Cayman Chemicals (Ann Arbor, Michigan); atorvastatin og rosuvastatin ble hentet fra Enzo Life Sciences, Inc. (Farmingdale, New York).
Cell kultur
Mus svulstvev-avledet (MTT) celler har nylig blitt utviklet i vårt laboratorium [31 ]. Alle dyrestudier er nødvendige for utvikling og karakterisering av MTT celler ble utført i samsvar med prinsippene og prosedyrene beskrevet i National Institute of Health Guide for omsorg og bruk av dyr, og godkjent av
Eunice Kennedy Shriver
National Institute of Child Health and human Development Animal Care og bruk Committee (Protocol antall ASP # 06-028). MTT celler tilhører NIH. Mus feokromocytom celler (MPC 4 /30PRR) var en generøs gave fra Dr. Tischler, dusker, Boston. Celler ble opprettholdt i DMEM (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY), supplert med 10% varme-inaktivert hesteserum (Hyclone Logan, UT), 5% føtalt bovint serum (Gibco), HEPES (Gibco), og penicillin ( 10.000 enheter /ml) /streptomycin (100,000 pg /ml) (Gibco) i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C. Medium ble endret annenhver dag, og cellene ble passert når 80-90% samløpet ble nådd. Alle statiner ble sammenlignet med den passende konsentrasjon av bærer (DMSO). Når statiner ble kombinert for å evaluere potensielle additive effekter, 25 uM av to forskjellige statiner ble sammenlignet med 50 pM av hver av de enkelte statiner.
proliferasjonsanalyser
celler ble sådd inn i kollagen belagt 96- brønners plater (BD Biosciences, San Jose, CA) på 10.000 celler per brønn, og lov til å feste i 24 timer. Deretter ble mediet byttet ut med konsentrasjoner på 6,25, 12,5, 25, og 50 uM av de forskjellige statiner, oppløst i supplert medium. Etter 0, 24, 48 og 72 timer med behandling, ble celleproliferasjon vurderes med Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche anvendt vitenskap, Indianapolis, IN) i henhold til produkthåndboken. Etter fire timers inkubering ble platene målt ved 490 nm med 650 nm referanse bølgelengde i en mikroplateleser (Victor
3 1420 multilabel telleren, Perkin Eimer, Waltham, MA). Alle forsøkene ble utført i fire eksemplarer og gjentatt minst to ganger.
Spontane cellemigrering assays
Cellene ble sådd ut på 60.000 celler per brønn for spontan migrering vurdering i en xCELLigence DP-enhet (Roche Diagnostics, Mannheim , Tyskland) som tidligere rapportert [32]. Den spontane migrering ble registrert i 24 timer i nærvær av 5 uM fluvastatin, lovastatin, simvastatin og alene, eller i kombinasjon med 100 mM trans, trans-farnesol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
MAPK sti gen-berikelse i SDHB PGLs
Expression data ble hentet fra tidligere presentert microarray data på 45 prøver av pseudohypoxic PHEOs /PGLs, inkludert 18 SDHB, 8 SDHD hode og hals (HN), 6 SDHD mage- og bryst (AT), og 13 VHL prøvene i forhold til normal binyremargen [33]. Som rapportert, prediksjon analyse av microarray identifisert 6937 gener som karakteristisk for en av de ulike undergrupper av pseudohypoxic PHEOs /PGLs. Disse ble kartlagt mot en liste over 254 MAPK pathway gener (Kyoto Encyclopedia of Gener og Genome Pathway). Dominerende over-uttrykk i SDHB prøvene sammenlignet med normal marg ble bekreftet av ANOVA og intervaller var basert på omfanget statistikk Studentized, Tukey sin «Ærlig signifikant forskjell» metoden.
Etikk erklæringen
Tissue samlingen var godkjent av Institutional Review board av
Eunice Kennedy Shriver
National Institutes of Child Health and human Development. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient.
Menneske svulstvev
PHEO /PGL vev ble umiddelbart frosset på reseksjon. Pasient og tumor informasjon for hver prøve er angitt i tabell 1. Frosne prøver ble homogenisert på is i Tissue Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific Inc., Lafayette, CO, USA) med 0,1% fosfatase-inhibitor (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , MA, USA) og en proteasehemmer Komplett Mini tablett per 10 ml oppløsning (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA). Homogenatene ble sentrifugert ved 10 000 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble anvendt som proteinekstrakt.
Cell høste
Cellene ble sådd ut i kollagen belagte plater [34] på 600 000 celler /ml og tillatt å feste i minst 18 timer før media ble endret til 25 um statin løsninger eller DMSO kontroll. Behandlingsoppløsninger ble fornyet etter 24 timer. Etter 48 timers behandling, ble cellene samlet opp med en gummistav og vasket 3 ganger i iskald PBS ved sentrifugering ved 500 x g. Celler ble samlet inn på 1500 × g, oppløst i 0,1% cholamidopropyldimethylammoniopropanesulfate, som inneholder en proteasehemmer Komplett Mini tablett per 7 ml oppløsning (Roche Applied Science) og 0,5% fosfatase Inhibitor Cocktail 2 (Sigma-Aldrich). Prøvene ble lydbehandlet i 2 minutter på is og deretter sentrifugert ved 10 000 x g i 10 min, 4 ° C. Supernatanten ble brukt som proteinekstrakt.
Western blot
For å beregne proteinkonsentrasjoner Quant-iT Protein Assay Kit (Invitrogen, Life Technologies Corporation) ble brukt. Like protein mengder tumorekstrakter i PAGE gel LDS prøvebuffer (Thermo Fisher Scientific) eller celleekstrakter i Lämmli buffer ble lastet på 4-20% Criterion TGX prefabrikerte gels (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) eller hånd kastet 12 % geler, adskilt ved hjelp av natrium-dodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese og overført til PVDF-membraner (Immobilon-P, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). Membranene ble blokkert i 5% fettfri tørrmelk i fosfatbufret saltvann (pH 7,4) med 0,01 til 0,05% Tween 20 (Sigma-Aldrich Co.) i 1 time. Antistoffer ble oppløst i 5% bovint serumalbumin eller 5% ikke-fett tørrmelk i tris-bufret saltløsning (pH 7,6) med 0,01 til 0,05% Tween 20. Membraner ble inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C og i 1 time ved romtemperatur. Primære antistoffer ble kanin anti-spaltede-caspase-3, kanin anti-P44 /p42 MAPK, kanin anti-fosfo-P44 /p42 MAPK, kanin anti-PARP, kanin anti-GAPDH (Cell Signaling, Technology Inc.), muse anti -β-aktin (Sigma-Aldrich). Sekundære antistoffer ble HRP-bundet esel-anti-kanin (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA), geite-anti-kanin, og geite-anti-mus (begge DAKO North America, Inc., Carpinteria, CA). Membraner ble inkubert i Super Signal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Thermo Fisher Scientific) og utsatt for High Performance Chemiluminescence film (GE Healthcare) eller inkuberes i Amersham ECL Prime Western blotting Detection Reagent (GE Healthcare) og visualisert i en ChemiDoc system (Bio-Rad Laboratories). Membraner ble strippet med Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific) før re-blokkering og inkubasjon med et annet sekundært antistoff.
Statistisk analyse
En to-trinns tilnærming ble brukt til å vurdere anti-proliferative effekt av hvert medikament for å redusere cellenes levedyktighet. I det første trinnet, ble hver av de 6 legemidler sammenlignet separat til kjøretøyet for hvert nivå av behandlingsvarighet, dose, og celletype. Dataene som brukes for disse analysene var de (replikert) forhold mellom medikament brønn verdiene dividert med gjennomsnittet av de tilhørende sett av DMSO-kontrollverdier. Disse forholdstall, fra to til fire uavhengige eksperimenter, ble analysert ved bruk av en to-veis fast-effekter ANOVA. De resulterende p-verdier ble Bonferroni-korrigert ved å multiplisere dem med 24, antall konfigurasjoner av varighet, dose, og celletype for et gitt medikament. Deretter ble stoffene som samlet betydelig redusert spredning valgt, og de mest effektive varighet og doser for hvert legemiddel for hver celletype ble vurdert: ved en innledende ANOVA, etterfulgt av rangering på grunnlag av post-ANOVA innretning, fulgt av Student-Newman- Keuls (SNK) post hoc tester for å fastslå noe som betyr signifikant forskjellig. De overordnede forestillinger av de 3 beste resultater legemidler ble sammenlignet med en 4-veis ANOVA (faktorer: narkotika, varighet, dose, og celletype); igjen SNK post hoc tester ble utført for å bestemme hvilke stoffer ble samlet vesentlig forskjellige.
Effekten av kombinert statiner i forhold til hver enkelt statin ble evaluert på en analog måte. Data er presentert som gjennomsnittet og standardfeilen (basert på ANOVA og delta-metoden) på minst to uavhengige eksperimenter. Statistiske beregninger ble utført i Stata (Slipp 12, StataCorp., College Station, Texas, USA).
Resultater
Evidence for MAPK-signal i SDHB PHEOs /PGLs
som tidligere vist, lovastatin som utøves en sterk anti-proliferativ effekt på MPC og MTT-celler, som var forbundet med nedsatt fosfo-MAPK 1 og 3 (pMAPK1 /3) nivåer [1]. For å vurdere om statin behandling kan være til nytte for pasienter med metastatisk PGLs, vi vurdert om pMAPK1 /3 var til stede i de aggressive SDHB-avledet PGLs og andre arvelige PHEOs /PGLs (Fig. 1a). Pasient og tumor informasjon for hver prøve er vist i tabell 1. Blant de humane PHEOs /PGLs de pMAPK1 /3 nivåer var svært variabel. Selv om den gjennomsnittlige pMAPK1 /3 plan var forholdsvis lav i SDHB svulster i forhold til andre testede prøvene, fosforylering var tydelig i fire av seks SDHB prøver. Ingen forskjell mellom primær SDHB PGLs og SDHB-metastaser var tydelig.
A. Western blot av pMAPK1 /3, totalt MAPK1 /3, og GAPDH i menneskelige PHEOs /PGLs. Pasient og tumor informasjon for hver prøve er vist i tabell 1. Forkortelser: B) SDHB, D) SDHD, N) NF1, M) normale adrenal medulla. B. Heatmap viser uttrykk for 21 MAPK pathway gener i pseudohypoxic PHEOs /PGLs. Uttrykk av disse 21 genene ble signifikant forhøyet i SDHB forhold til normal marg (p 0,002). Hver prøve ble tildelt et nummer. Den tilsvarende prøve identifikator fra den opprinnelige artikkelen [33] er gitt i tabell S1. Pasientinformasjon og link til avsatt data er gitt i den opprinnelige artikkelen.
I tillegg har vi evaluert mRNA uttrykk profilen til MAPK pathway gener i pseudohypoxic PHEOs /PGLs. Kartlegging av 254 MAPK pathway gener til 6937 tidligere identifiserte gener av interesse [33] avslørte en kamp på 85 gener. Hierarkisk clustering av de 85 genene avdekket to gensamlingene, hvorav den ene inneholdt 21 gener som syntes å være mer høyt uttrykt i SDHB og SDHD-JA PHEOs /PGLs forhold til normal binyremargen og SDHD-HN og VHL PHEOs /PGLs (Fig. 1B). En nærmere titt på disse 21 genene avslørte generell økt uttrykk i SDHB prøvene i forhold til normal binyremargen (p 0,002) (Fig. 1B) og en ANOVA av de enkelte gener med post-hoc evaluering bekreftet signifikant høyere uttrykk for MAPK12, CACNB3 , CACNG7, MAP4K2, MAP3K9, og MAPK6 i SDHB PHEOs /PGLs enn normalt binyremargen (p≤0.02). Dermed visse aspekter av MAPK signal synes å være aktivert i de mest aggressive SDHB-avledet PHEOs /PGLs, så rettet mot denne veien kan være en lovende ny behandling tilnærming.
Sammenligning av
in vitro
efficacies av forskjellige statiner
for å bestemme effektiviteten av forskjellige statiner på PHEOs /PGLs, vi brukte to musemodeller; MTT og MPC cellelinjer. Ingen bevis for succinatdehydrogenase dysfunksjon eller underenhet mutasjon er ventet i MPC eller MTT-celler, men ikke noe bedre in vitro-modellen eksisterer for å studere effekten av nye terapeutiske muligheter for PHEOs /PGLs. Relativ cellelevedyktighet ble redusert med økende behandlingsvarighet og konsentrasjonen av de forskjellige statiner for MPC og MTT. Varighet av tre dager med behandling med høyest konsentrasjon av 50 uM var mest effektiv for alle statiner (fig. 2) og viste en betydelig høyere virkning sammenlignet med samme dose og statin på den andre dag av behandlingen (SNK p≤0.029 for alle statiner unntatt pravastatin, som var ineffektive).
Prosent betydelig resultater over alle statiner for alle behandlingsdoser ved de ulike behandlingsvarigheter for MPC (A) og MTT (B). Prosentandelen av betydelige resultater ble økt i MTT forhold til MPC etter 48 og 72 timer, noe som tyder på at MTT er mer følsomme for behandling med statiner.
Forekomst av betydelig redusert i forhold levedyktighet i forhold til kjøretøy økte med dose og behandlingsvarigheter, og disse effektene var mer uttalt for MTT enn MPC, som indikerer en høyere følsomhet av den mer aggressive celletype til behandling med statiner (fig. 2).
den anti-proliferative effekt av de seks statiner forskjellig signifikant (p 0,0001). Lovastatin, simvastatin, fluvastatin og viste høyeste inhibering proliferasjon (fig. 3). Direkte sammenligning av deres anti-proliferative efficacies avdekket høyere potens av simvastatin og fluvastatin sammenlignet med lovastatin (p = 0,033; simvastatin vs lovastatin SNK p = 0,043, fluvastatin vs lovastatin SNK p = 0,031).
MPC ( A-F) og MTT (G-K) ble behandlet med ▪ 6,25 uM, ▴ 12,50 uM, ▾ 25,00 uM, og ⧫ 50,00 uM av atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, rosuvastatin og simvastatin for 24, 48 og 72 timer.
i tillegg til etablering som statin er mest effektive i å hemme celleproliferasjon i MPC og MTT, utforsket vi om å kombinere to forskjellige statiner kan øke effekten. Interessant, de fire mest effektive kombinasjoner alle inkludert simvastatin: simvastatin /lovastatin, simvastatin /fluvastatin, simvastatin /atorvastatin og simvastatin /rosuvastatin. Imidlertid har ingen av disse kombinasjonene redusert i forhold levedyktighet mer effektivt enn de tre mest effektive statiner, fluvastatin, simvastatin og lovastatin alene (Fig. 4).
Relativ levedyktigheten til MPC (A) og MTT (B) de angitte doser og varighet for de mest effektive kombinerte behandlinger, inkludert simvastatin forhold til simvastatin alene.
Western blot viste at de tre mest effektive statiner alt hemmet MAPK fosforylering ved 48 h av behandling med 25 mikrometer (fig . 5A). I tillegg, fluvastatin, simvastatin, lovastatin og økt spaltningsprodukt nivåer av CASP-3 og PARP, noe som indikerer økt apoptose (Fig. 5B).
A. Western blot viser redusert nivå av pMAPK1 /3 i behandlet kontra ubehandlet MPC og MTT i forhold til totalt MAPK1 /3 og GAPDH. B. Western blot viser redusert nivå av intakt PARP (topp band) og økte nivåer av kløyvde PARP (lavere band) i behandlet kontra ubehandlet MPC og MTT. I samsvar, kløyvde CASP-3 ble forhøyet i behandlede celler, noe som indikerer apoptose. Cellene ble behandlet med 25 mikrometer av den angitte statin i 48 timer.
Spredning av verken MPC eller MTT ble påvirket av 6,25 mikrometer av noen testet statin etter 24 eller 48 timer. Imidlertid spontan cellemigrering av MPC, og MTT ble sterkt inhibert ved behandling med 5 uM av fluvastatin, simvastatin og lovastatin (fig. 6). Vandrende kapasitet ble delvis reddet ved tilsetning av 100 uM trans, trans-farnesol.
MPC (A) og MTT (B) ble sådd ut i kjøretøy (Ctr), 5 uM fluvastatin (Fluva), 5 uM simvastatin (Simva ), 5 mikrometer lovastatin (Lova) med eller uten 100 mikrometer trans, trans farnesol (FOH) og spontan migrasjon ble registrert for 24.
Diskusjoner
til dags dato, ingen kurativ behandling Det er etablert for metastatisk PHEOs /PGLs. Imidlertid har flere nye terapeutiske strategier nylig blitt testet i modellorganismer [35] – [38], inkludert lovastatin [1]. Tidligere statiner har blitt rapportert å redusere spredning, overlevelse, cellesyklusprogresjon, og migrasjon i andre celler, inkludert aggressive kreftmodeller, blant annet av MAPK-reaksjonsveien inhibering [10], [25] – [27], [29], [30 ], [39] – [41]. Foreløpig er det imidlertid bevis for at statin behandling vil være potent i den mest aggressive typen PHEOs /PGLs, altså de med SDHB mutasjoner [42], er mangelfull.
Våre data tyder på at MAPK1 /3 fosforylering er til stede i noen SDHB-PGLs, inkludert metastaser. Etter avtale en tidligere studie viste økt MAPK1 /3 fosforylering i udødelig lymphoblastoids fra pasienter med Cowden lignende syndrom og kimcellelinje SDHB eller SDHD genvarianter eller mutasjoner [23]. I tillegg er flere MAPK pathway gener syntes å være mer høyt uttrykt i SDHB-PGLs enn i normale binyremargen. Den eksakte funksjon og potensial involvering av de identifiserte genene i SDHB-mutasjon mediert tumorigenesis gjenstår å bli vurdert.
I konklusjonen minst en undergruppe av pasienter med aggressive PGLs som viser MAPK1 /3 fosforylering kan ha nytte av statin behandling. Våre data tyder på at denne pasientgruppen ikke kan begrenses til å klynge 2 PGL pasienter. Fastsettelse av MAPK1 /3 fosforylering fra sak til sak i metastatisk PGLs kan være nyttig for estimering av en potensiell nytte av statin behandling.
I en tidligere utgitt microarray basert studie som sammenlignet PHEOs /PGLs med ulike genetiske bakgrunn, SDHx-deriverte svulster viste redusert MAPK veien genuttrykk i forhold til RET NF1, TMEM127, og sporadiske PHEOs /PGLs [21]. Avviket mellom dette resultatet og våre data kan skyldes det faktum at i forhold til RET NF1, TMEM127, og enkelte sporadiske PHEOs /PGLs, oppreguleringen av MAPK signal gener kan være marginal i SDHB PHEOs /PGLs, og dermed ikke påvisbar i fravær av normal kontroll vev. Våre microarray data viste motstridende uttrykk mønstre i SDHB og SDHD-HN PGLs med hensyn til MAPK signale gener; dermed gruppere disse prøvene kan tilsløre det overuttrykk av MAPK-relaterte gener i SDHB PHEOs /PGLs sammenlignet med andre PHEOs /PGLs. Her presenterer vi flere MAPK signal gener som er oppregulert i forhold til normale binyremargen. De konkluderer dermed med at statin behandling av seg selv eller i kombinasjon med andre terapeutiske regimer kan være til fordel i visse SDHB-avledede PHEOs /PGLs
For tiden er syv forskjellige statiner er på markedet som -., I tillegg til deres kolesterol senking egenskaper – har vist seg å påvirke flere kreft relevante veier [43], [44]. Deres farmakologiske virkninger og påvirker genekspresjon har vist seg å være forskjellig [43], [45], [46], og således, avhengig av cellene som skal behandles, har de mest effektive stoffet som skal bestemmes. Her viser vi at i tilfelle av MPC og MTT, den lipofile statiner fluvastatin, simvastatin og lovastatin betydelig redusert celleproliferasjon, med simvastatin og fluvastatin viser litt sterkere effekter. Pravastatin har vist seg å være ineffektive i flere cancermodeller [47], [48], som kan være på grunn av dets hydrofile egenskaper og mangelen på egnede transportører på tumorceller. I andre studier som sammenligner virkningene av flere statiner, simvastatin eller fluvastatin dukket opp mer effektiv enn lovastatin [24], [30]. For ytterligere undersøkelser, kan det tas hensyn til det faktum at de farmakokinetiske egenskapene til fluvastatin har blitt rapportert å være å foretrekke fremfor de av simvastatin og lovastatin [45].
Interessant nok de mer aggressive MTT-celler viste seg å være mer følsomme for statin behandling, noe som indikerer at mer aggressiv celler kan være mer mottakelige for den anti-proliferative effekter av statiner. Forskjellen i mekanismen rende MTT mer mottakelige gjenstår å bli belyst.
Den maksimale statin konsentrasjon rapportert i menneskeblod etter oral administrasjon (12,3 mm) [49] var i området på vår tredje høyeste konsentrasjon (12,5 mm) , som i betydelig grad redusert celleproliferasjon i MPC og MTT ved 48 eller 72 timer etter behandling med fluvastatin, lovastatin, simvastatin og. Holstein et al. rapportert at opp til 415 mg /m
2 oralt hver seks timer over fire dager ble godt tolerert av pasienter med alvorlige kreftsykdom som [49]. Men gjorde blod statinnivåer ikke øke i en lineær måte, og dermed oral administrasjon kan ikke være det beste alternativet for å oppnå høye konsentrasjoner vev. Optimal administrasjon teknikker for å oppnå målrettede konsentrasjoner må bestemmes. Ubetydelige effekter av statiner på normale celler i forhold til kreftceller har blitt rapportert [24], [50].
At ikke-giftige konsentrasjoner, oppnåelige ved oral administrasjon, har statiner blitt rapportert å vise en annen anti-kreft effekt , hemming av cellemigrering og invasjon [9], [47], [51]. Av denne grunn testet vi konsekvensen av de effektive statiner, lovastatin, simvastatin, fluvastatin og på spontan motilitet celle av MPC, og MTT ved 5 uM. Våre proliferasjonsanalyser viste ingen reduksjon i proliferasjon ved 6,5 uM innen 24 timer etter behandling. Lovastatin, fluvastatin, simvastatin og effektivt inhiberer migrasjonen av MPC, og MTT i løpet av 24 timer. Migrasjonen-inhibering som syntes å være i det minste delvis avhengig av farnesyl uttømming, ettersom nærværet av trans, trans-farnesol delvis reddet vandrende kapasitet. Men selv en forholdsvis høy konsentrasjon på 100 uM trans, trans-farnesol ikke helt omvendt anti-vandringseffekten av de tre statiner. Således kan farnesylering uavhengig effekt av statiner på MPC og MTT ikke utelukkes. I en tidligere studie, og geranylgeranyl-pyrofosfat har vist seg å være mer effektiv i å reversere effekten av statiner enn farnesylpyrophosphate [24]. I tillegg har de ikke-mevalonat pathway avhengige statin effekter på kreftceller har også blitt beskrevet [43].
Etter oral administrering av statiner ikke gir konsentrasjoner så høye som anvendt her for å oppnå de beste anti-proliferative effekter i vitro, kombinert administrering av andre medikamenter synes å være en lovende strategi. Den multikinasehemmer inhibitorer sunitinib og sorafenib også påvirke MAPK reaksjonsveien, og har vist seg å være effektive i en progressiv metastatisk PGLs [52], [53]. Sunitinib behandling viste gunstige kliniske effekter i åtte av 17 pasienter med progressive metastaserende PGLs. Interessant, 6 av responderne utføres SDHB-mutasjoner. Imidlertid, siden de fleste anti-neoplastiske medikamenter, kan bivirkningene av multikinasehemmer inhibitorer være alvorlig og ni av de 17 pasientene som ble behandlet med sunitinib måtte avbryte behandlingen eller redusere dosen til slutt.
En synergistisk effekt av fluvastatin og sorafenib har blitt presentert for melanomceller in vitro [54]. Dette har potensiale med avtagende multikinasehemmer inhibitorkonsentrasjoner, som kan avlaste strengheten av bivirkninger mens anti-tumor ytelse opprettholdes. Men videre studier mandat til å fastslå om kombinasjon av multikinasehemmer hemmere med statiner kan ha additiv effekt med aggressive PGLs. Som tidligere rapportert, har kombinert hemming av PI3K /AKT og mTORC1 /2 signale blitt foreslått som lovende terapeutisk regime for visse PGLs [1].
I konklusjonen, kan statiner være til nytte alene eller i kombinasjon med andre terapeutiske regimer hos pasienter med aggressiv PHEOs /PGLs som viser MAPK pathway aktivitet.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Eksempel tall fra figur 1A med tilsvar Chip identifikatorer og eksempel identifikatorer fra Shankavaram Fliedner et al. 2013 neoplasi 15: 435-447. Pasientinformasjon og link til avsatt microarray data er gitt i den opprinnelige artikkelen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0097712.s001 plakater (XLSX)
Takk
Vi ville takke Dr. Tischler og Dr. Martiniova for å gi MPC og MTT celler, henholdsvis. Vi er takknemlige også til Dr. Perwitz, Ms Maushagen, og Ms Resch for å gi råd og antistoffer ekspert. I tillegg ønsker vi å uttrykke vår takknemlighet til Prof. Aherrahrou og Dr. Perwitz, for sjenerøst dele deres utstyr.
