Abstract
FoxO proteiner er viktige regulatorer i cellenes stoffskifte og er kjent for å være noder i flere signalveier, spesielt de som involverer PI3K /AKT og mTOR. FoxO proteiner først og fremst fungere som transkripsjonsfaktorer, men fersk studie antyder at cytosolic FoxO1 deltar i reguleringen av autophagy. I denne studien finner vi at cytosolic FoxO1 faktisk stimulerer celle autofagi i flere kreftcellelinjer, og at det regulerer ikke bare basal autofagi, men også at indusert av rapamycin og som svar på næringsmangel. Disse resultatene viser betydningen av FoxO1 i cellemetabolismen regulering uavhengig av dets transkripsjonsfaktor-funksjon. I motsetning til FoxO1, finner vi nært beslektet FoxO3a er en negativ regulator av autofagi i flere kreftcellelinjer, en tidligere ikke funksjon for dette proteinet, forskjellig fra sin funksjon i godartede fibroblast og muskelceller. Induksjon av autophagy ved knockdown av FoxO3a ble funnet ikke å være formidlet gjennom undertrykkelse av mTORC1 signalering; heller, ble det regulatoriske rolle FoxO3a på autofagi fast bestemt på å være gjennom sin evne til å transcriptionally undertrykke FoxO1. Denne komplisert samspill av FoxO1 og FoxO3a antyder en kompleks checks- og balanserer forholdet mellom FoxO3a og FoxO1 i å regulere autofagi og celle metabolisme
Citation. Zhu WL, Tong H, Teh JT Wang M (2014) gaffelhode Box Protein O3 transkripsjonsfaktor Negativt Regulerer Autophagy i humane kreftceller ved å hemme gaffelhode Box Protein O1 Expression og cytosolic Opphopning. PLoS ONE 9 (12): e115087. doi: 10,1371 /journal.pone.0115087
Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina
mottatt: 17 juli 2014; Godkjent: 18 november 2014; Publisert: 29.12.2014
Copyright: © 2014 Zhu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Direktoratet for Science, Technology and Research (A * STAR) og National Medical Research Council of Singapore. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Autophagy er et sterkt konservert cellulær prosess, sentral til responsen av cellen til ernæring /energi, så vel som vekstfaktor status [1], [2]. Hensiktsmessig en av de store oppstrøms regulatorer av autofagi er PI3K-AKT-mTOR signalering, sensorer for vekstfaktor stimulering, aminosyre og celleenerginivåer som er sentrale for cellevekst og proliferasjon [3] – [5]. Faktisk er autophagy reguleres parallelt med cellulær metabolisme og proliferasjon, og danner et integrert svar på de ytre og indre miljø. For eksempel når nærings og energinivået oppfattes som lav, celleproliferasjon og anabole aktiviteten nedgang mens autofagi øker for å gi energi og makromolekyler for viktige cellefunksjoner [6]. Mens hemming av autofagi kan føre til celledød, langvarig induksjon av overdreven katabolsk aktivitet, for eksempel autofagi, kan også føre til celle død; begge disse prosessene kan utnyttes som nye tilnærminger for behandling av kreft [7] – [10]. Derfor, er en grundig forståelse av autophagy regulering i forskjellige celle sammenhenger viktig for å etablere potensialet for terapeutisk manipulering av denne prosessen.
gaffelhodeboks protein O transkripsjonsfaktorer (FoxOs) er evolusjonært konserverte proteiner som opptar regulerings noder i multiple signalveier som er viktige for cellulær respons til ekstern energi, ernæring, og vekstfaktor stimulering. Som sådan, at de er involvert i regulering av anabolske og katabolske tilstander av celler, og i vekst, proliferasjon, og celledød avgjørelser [11] – [17]. Det er ikke overraskende derfor at dysfunksjon i disse proteiner virkninger på patologiske prosesser som diabetes, aldring og kreft [12], [16] -. [19]
FoxO proteiner har blitt rapportert å være regulatorer av mobilnettet autophagy, en prosess som er nært bundet til anabole /katabolsk tilstand av cellen. Flere studier har antydet at FoxO3a spesielt fremmer ekspresjon av autophagy gener, noe som fører til økt autofagi [20] – [22]. Disse og andre funn har ført til oppfatningen at FoxO proteiner generelt er aktivatorer av autofagi gjennom sin funksjon som transkripsjonsfaktorer [23], [24]. I denne visningen blir funksjonene til ulike FoxO proteiner anses like og overlappende med hensyn til å fremme autophagy, med vev distribusjon regnskap for deres differensial effekt i spesifikke celle sammenhenger. Et viktig fokus for regulering av FoxO proteiner har vært på sin cellulær lokalisering, som er reversibelt regulert av deres post-translasjonelle modifiseringer, først og fremst at av fosforylering [25] – [28], og acetylering [29], [30] i respons miljømessige stimuli. Disse post-translasjonelle modifikasjoner er nært knyttet til den cellulære lokalisering av FoxO proteiner og deres interaksjon med effektorer, og derfor anses å være viktige i reguleringen av nivået av aktivitetene til disse proteinene [31], [32]. Faktisk har de siste resultatene antydet at cytosolic FoxO1 kan fremme autofagi, som svar på ernæringsmessig stress, ved direkte interaksjon med Atg7, demonstrerer de kompliserte rollene til denne gruppen av proteiner i å regulere autofagi [33].
Det var nylig rapporterte at FoxO3a kan fremme FoxO1 avhengig autophagy i human embryonisk nyre og mus embryo fibroblast celler, som blir mediert av FoxO3a oppregulering av PI3K katalytisk subenhet, påfølgende AKT aktivering og økt cytosoliske fordeling av FoxO1 [34]. I kontrast, fant vi at FoxO3a hemmer, snarere enn forsterker, autofagi i flere kreftcellelinjer. Videre vises FoxO3a undertrykkelse av autofagi å være mediert av ned-regulere transkripsjon av FoxO1, som gir ny innsikt i hvordan FoxO3a og FoxO1 kan samhandle og utøve motstridende effekter på celle autofagi. Disse funnene har avdekket en uventet rolle FoxO3a i autofagi, og fremheve kompleksiteten FoxO signale og dens biologiske effekten i ulike celle sammenhenger.
Materialer og Metoder
Reagenser og antistoffer
antistoffer som gjenkjenner menneskelige GAPDH, FoxO1 (C29H4), FoxO3a (75D8), p-4EBP1 (T37 /46), p-S6 (S240 /244), Atg5, flagg, og Histone H3 var fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA); Antistoffer for LC3 (APG8A) var fra Abgent (San Diego, California). Den protease-inhibitor cocktail var fra Roche (Basel, Sveits). Alle cellelinjer som brukes i studien ble oppnådd opprinnelig fra American Type Culture Collection.
Cell kultur og medikamentell behandling
Celler ble opprettholdt ved 37 ° C med 5% CO
2 i DMEM (Invitrogen, North Andover, MA) supplert med 10% FBS (Hyclone, Novato, CA), 50 enheter /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin (Invitrogen). Ytterligere behandling med forskjellige inhibitorer, for eksempel rapamycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), cykloheksimid (Sigma-Aldrich), og klorokin (Sigma-Aldrich) ble utført i DMEM supplementert med 10% FBS; detaljene for hver behandling tilstanden er kjent i de respektive figur legende. For annen sult behandling, ble cellene kultur i serum gratis, eller D-glukose fritt medium, henholdsvis.
sirnas, primere og plasmider
siRNA-1 av FoxO1 (5’UUG UAC AGG Ugu CUU CAC UUG GGU C-3), siRNA-1 av FoxO3a (5′-AUU GAC CAA ACU UCC CUG Guu AGG C-3 «) og siRNA av Atg5 (5»-AUU CCA UGA Guu UCC GAU UGA UGG C -3 «) ble innkjøpt fra Invitrogen; siRNA-2 av FoxO1 (5»-ACA GCA UGC GAC UCA AUC UGC AGU U-3 «) [35] og FoxO3a (5′-GAG CUC UUG GUG GAU CAU C-3′) [36] ble syntetisert fra Sigma- Aldrich. Forover og bakover primere for Real-time PCR var: FoxO1, 5»-AACCTGGCATTACAGTTGGCC-3 «og 5′-AAATGCAGGAGGCATGACTACGT-3′; FoxO3a, 5»-CTTCAAGGATAAGGGCGACAG-3 «og 5′-TCGTCCTGGACTTCATCCA AC-3′; Atg4c, 5»-GCAGGAGATTGGTATGGACCAGCT-3 «og 5′-GGATGCCTT GCTTCTTCAACTGCT-3′; LC3, 5»-AGACCTTCAAGCAGCGCCG-3 «og 5′-ACACTGACAATTTCATCCCG-3′; Atg7, 5»-GATCCGGGGATTTCTTTCACG-3 «og 5′-CAGCAGCTTGGGTTTCTTGAT-3′; Atg12, 5»-TCTATGAGTGTTTTGGCAGTG-3 «og 5′-ATCACATCTGTTAAGTCTCTTGC-3′; Bnip3, 5»-GCCCGGGATGCAGGAGGAGA-3 «og 5′-GAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC-3′; 18S, 5»-AAGTTCGACCGTCTTC TCAGC-3 «og 5′-GTTGATTAAGTCCCTGCCCTTTG-3». Flag-FoxO1 [37] og flagg FoxO3a [38] ekspresjonsplasmider ble kjøpt fra Addgene (Cambridge, MA). Flag-FoxO1-ΔDB (sletting av rester 208-220 av FoxO1) og Flagg-FoxO3a-3A (Alanine substitusjon av Thr 32, Ser 253 og Ser 315 av FoxO3a) ekspresjonsplasmider ble konstruert ved hjelp QuikChange II seterettet mutagenese Kit (Stratagene , Santa Clara, CA). Flag-FoxO3a (r), som er bredt typen FoxO3a protein kodet av cDNA motstandsdyktig mot siFoxO3a vi brukt i studien, ble generert av mutere åtte siRNA-1 av FoxO3a målretting basepar i villtype Flag-FoxO3a plasmid hjelp QuikChange II seterettet mutagenese Kit (Stratagene). Alle plasmider ble verifisert ved DNA-sekvensering. Den tandem fluorescerende mRFPGFP-LC3 plasmid var en gave fra Dr. Tamotsu Yoshimori [39].
transfeksjon med siRNA eller ekspresjonsvektorer
transfections ble gjort ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) basert på produsentens protokoll ; de transfekterte cellene ble utsatt for ønskede behandlinger for 24-48 timer etter transfeksjon som beskrevet i respektive figur sagn.
cytosol-kjerne fraksjone
Høstede celler ble suspendert i kald buffer (100 mM Tris- HCl pH 7,6, 15 mM Mg (OAc)
2, 10 mM KOAc, 10 mM PMSF, 0,5% NP40, 1% protease inhibitor cocktail), og stå på is i 20 min, før sentrifugering ved 2500
g
i 5 min ved 4 ° C. Supernatanten fraksjon ble samlet som den cytoplasmiske ekstrakt. Pelleten ble vasket en gang med samme buffer før de blir suspendert ved 4 ° C i kjerner lyserer buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,6, 42 mM NaCl, 50 mM EDTA, 10 mM PMSF, 2% SDS, 1% protease inhibitor cocktail ). Etter 10 min inkubering på is, ble suspensjonen ultralydbehandlet i 3 minutter på is før sentrifugering ved 12.000
g
i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fraksjon ble samlet som den kjernefysiske ekstrakt.
Immunoblotting og analyse
Celler utsatt for den behandling som er angitt i den aktuelle figuren legende ble høstet, lysert, og proteinkonsentrasjon bestemt i henhold til standardprotokollen. Proteiner ble separert ved SDS-PAGE og immunoblot analyse ble utført ved hjelp av en forbedret chemiluminescence prosedyre (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
Confocal avbildning og analyse
Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyde , etterfulgt av permeabiliseringen med kald metanol. For celler som gikk gjennom immunofluorescent merking, ble de faste, permeabiliserte celler inkubert med blokkeringsbuffer (5% normalt geiteserum, 0,3% Triton X-100 i PBS) i 1 time ved romtemperatur, etterfulgt av inkubasjon i passende fortynnet antistoffet i antistoff fortynningsbuffer (1% BSA, 0,3% Triton X-100 i PBS) over natten ved 4 ° C. Cellene ble deretter vasket tre ganger med PBS og deretter inkubert med enten FITC-geit-anti-kanin (1:1000) eller rhodamin-geit anti-mus IgG sekundære antistoffer (1:1000), som hensiktsmessig, i antistoff fortynningsbuffer i 1 time ved romtemperatur. Alle confocal bilder ble tatt med en Carl Zeiss LSM 710 konfokal mikroskop (Oberkochen, Tyskland). Imaging data ble analysert ved Metamorph Analysis Software (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA). Colocalization effektiviteten av mRFP til at av GFP fluorescerende signalene ble målt ved hjelp ImageJ programvare.
Kvantitativ PCR assay
Celler utsatt for siRNA knockdown eller gen over-uttrykk protokoller ble høstet i henhold til standard protokoll. Total RNA ble ekstrahert ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter ble først-cDNA syntetisert under standardbetingelser med Hevet First-strand Synthesis System (Invitrogen). Kvantitativ PCR ble utført med CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA). Mengden av transkripsjon ble normalisert til nivået av ribosomale proteiner 18S.
Dataanalyse
statistiske forskjeller ble vurdert av Student
t
test. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant ved p 0,05 (*) og
p
0,01 (**)
Resultater
FoxO3a regulerer negativt autofagi, i motsetning til FoxO1. som fremmer autofagi
Flere rapporter har vist involvering av FoxO proteiner i å regulere autofagi, men presis måte for denne reguleringen og hvilke roller ulike FoxO proteiner kan spille i denne prosessen, spesielt rollene til forskjellige FoxO proteiner i forskjellige celle sammenheng, krever videre avklaring. Undertrykkelse av FoxO1 nivåer i prostata kreft PC3-celler ved siRNA knockdown inhiberte cellulær autophagy, både i henhold til basale betingelser og som indusert av rapamycin (fig. 1A), eller serum og glukosemangel (Fig. 1B). To sirnas målretting FoxO1 trykt autofagi i PC3 celler, som vurderes av LC3-II, noe som tyder på et mål spesifikk effekt av denne forskriften (Fig. 1C). Disse data er i overensstemmelse med ideen om at FoxO1 er en positiv regulator av autophagy [23], [33], [34]. For å undersøke hvilken rolle FoxO3a i PC3 cellene ble lignende studier utført ved hjelp av siRNA målretting FoxO3a. Overraskende, ble en motsatt effekt observert ved undertrykkelse av FoxO3a uttrykk; sirnas målrettet mot FoxO3a forbedret basal autofagi så vel som det som blir indusert av rapamycin, målt ved lipidert LC3 nivåer (Fig. 1D). Denne reduksjonen av FoxO3a uttrykk ytterligere forbedret autofagi indusert av enten serum eller glukose sult (fig. 1E), noe som tyder på en generell involvering av FoxO3a i reguleringen av autophagy i respons til ernæring og vekstsignaler i PC3 kreftceller. Induksjon av autofagi av FoxO3a undertrykkelse ble validert med to FoxO3a målretting siRNAs (Fig. 1 F), minsker sannsynligheten for at dette blir en off-target effekt. Tidligere studier i myotubes og fibroblaster har vist at FoxO3a spiller viktige roller i å fremme autofagi [20], [34]; derfor dette resultatet antyder komplekse og cellekontekstspesifikke roller FoxO3a i reguleringen av autophagy. Det virket sannsynlig at det er klare forskjeller mellom muskel og fibroblast celler og epitelceller-avledet kreftceller i denne forskriften. For å avgjøre om den overraskende negativ regulering av autofagi av FoxO3a var begrenset til PC3 prostata kreft celler, undersøkte vi effekten av FoxO3a stanse i HCT116 tykktarm og MDA-MB-231 brystkreftcellelinjer. I likhet med den observasjon i PC3-celler, knockdown av FoxO3a førte til LC3-II høyde i begge cellelinjer (Fig. 2A), og dette demonstrerer denne negative regulering av autophagy ved FoxO3a er ikke begrenset til en enkelt kreftcellelinje.
(A) Immunoblot-analyse av lysater fra PC3-celler transfektert med kontroll siRNA (siLuc) eller som målretting FoxO1 (siFoxO1), med eller uten rapamycin behandling. PC3-celler ble transfektert med de indikerte siRNA i 48 timer før etterfølgende behandling med DMSO, 20 nM eller 100 nm rapamycin (Rap) i 24 timer før høsting og prosessering. (B) PC3-celler ble transfektert med de indikerte siRNA i 48 timer forut for endring av medium, hvoretter cellene ble underkastet de angitte vekstbetingelser; Disse forholdene er DMEM i nærvær (normal) eller fravær av 10% FBS (serum -), eller i fravær av D-glukose (med 10% FBS), som angitt. Cellene ble høstet 6 timer etter eksponering for disse betingelsene, og bearbeidet for immunoblot-analyse av indikerer proteiner. (C) knockdown av FoxO1 med to målretting sirnas undertrykker autofagi i PC3 celler. (D, E, F) viser tilsvarende studie prosedyrer som (A, B, C), men med sirnas målretting FoxO3a i PC3 celler. Alle forsøk har blitt utført tre ganger med samme resultat.
(A) PC3, MDA-MB-231, og HCT116-celler ble transfektert med kontroll siRNA (siLuc) eller som målgruppe FoxO3a (siFoxO3a). Deretter ble disse cellene eksponert for å styre kjøretøyet eller 50 uM klorokin 72 timer etter transfeksjon i 3 timer før cellelysatene forberedelse for immunoblotanalyse av de angitte proteiner. (B) Konfokalmikroskopi av MDA-MB231 celle som stabilt uttrykker tandem fluorescerende mRFP-GFP-LC3 etter transfeksjon med enten kontroll eller FoxO3a siRNA. Bilder ble tatt 72 timer etter transfeksjon av den angitte siRNA. (C) Kvantitativ analyse av bildene fra forsøket er vist i felt B ved hjelp av MetaMorph programvare for å bestemme det gjennomsnittlige antall RFP-positive partikler per celle i kontroll (siLuc) og siFoxO3a behandlede celler. (D) colocalization analyse av RFP og GFP fra forsøket beskrevet i panel B for å vurdere autophagic progresjon. RFP og GFP colocalization antydet med Pearson Koeffisienter ble analysert ved ImageJ programvare. Både i (C) og (D), 50 celler ble analysert for hver tilstand. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. ( «**»,
p
0,01), og detaljerte metoder er beskrevet i eksperimentelle prosedyrer. (E) PC3-celler ble transfektert med kontroll siRNA (siLuc) eller som målretting Atg5 (siAtg5), FoxO3a (siFoxO3a), eller kombinasjon av begge, som angitt. Cellene ble høstet 72 timer etter transfeksjon, og lysatene ble behandlet for analyse.
Mønsteret av LC3-I og LC3-II nivåer alene er ikke tilstrekkelig til å illustrere den faktiske autophagy prosess, som enten øket initiering av autophagy eller redusert progresjon av autophagy til lysosomal degradering systemet kan føre til heving av LC3-II. For å klargjøre hvilken rolle FoxO3a i denne prosessen, bestemt vi virkningen av FoxO3a stanse på selve autofagi forandring ved hjelp av to tilnærminger. En tilnærming er involvert behandling av cellene med klorokin i nærvær av FoxO3a knockdown, som ble utført i alle tre cancercellelinjer, dvs. PC3, MDA-MB-231 og HCT116-celler. Undertrykkelse av FoxO3a resulterte i akkumulering av LC3-II i disse celler; og tillegg av klorokin ytterligere økte LC3-II, noe som tyder på at FoxO3a undertrykkelse økt LC3-II via autofagi induksjon (Fig. 2A). Den andre tilnærmingen involverte måling av progresjonen av autophagosomes inn i de sure autophagolysosomes ved konfokal avbildning. MDA-MB-231 celler som stabilt uttrykker tandem florescence protein mRFP-GFP-LC3 ble transfektert med FoxO3a siRNA eller kontrollere siRNA; Deretter ble samlokalisering av GFP med RFP, en indikator på autophagosome-lysosome fusjon og protein degradering, undersøkt [39]. GFP fluorescens er labil i sure forhold; derfor tap av grønne florescence som er observert som delokalisering av RFP fra GFP sporer økning i surhet i autophagosomes som de utvikler seg til autophagolysosomes. I dette systemet FoxO3a tie ikke bare ført til økt LC3 positiv brennpunkter, men også til en betydelig reduksjon i GFP ko-lokalisering med RFP, reflekterer status for økt autophagy fluks (Fig. 2B, 2C, 2D). Videre siRNA mediert reduksjon av Atg5 nivåer hemmet autofagi indusert av FoxO3a knockdown (Fig. 2E), som gir bevis for at undertrykkelsen av FoxO3a fremme autophagy induksjon i en Atg5 avhengig måte. Disse data klart fast at, mens FoxO1 fremmer autofagi som forventet, FoxO3a regulerer negativt prosessen i disse kreftcellene, spille en motsatt rolle.
For ytterligere å teste hypotesen om at FoxO3a er en negativ regulator av autofagi i kreftcelle linjer, en target-spesifikk redning studie ble utført i PC3 celler ved ektopisk uttrykk for FoxO3a (r), som koder for samme protein sekvens som villtype FoxO3a men inneholdt stille mutasjoner som gjør det motstandsdyktig mot FoxO3a siRNA. Immunoblot-analyse viste at ektopisk ekspresjon av FoxO3a (r) undertrykket både basal autofagi og autophagy indusert av FoxO3a knockdown, i forhold til den i de celler som uttrykker vektoren kontroll (Fig. 3A). Verdt å merke seg, ekspresjon av en form for FoxO3a, kalt FoxO3a-3A (ute av stand til å bli fosforylert av AKT), som utelukkende lokalisert til cellekjernen [20], hemmet autophagy så mye som villtypen FoxO3a som lokalisert både i kjernen og i cytosol (fig. 3B). Disse funnene antydet at FoxO3a regulerer negativt autofagi gjennom sitt atom, mest sannsynlig transkripsjonen funksjon
(A) PC3 celler ble transfektert med enten kontroll siRNA eller som målgruppe FoxO3a.; hver gruppe av celler ble også ko-transfektert med enten ektopisk ekspresjon av vektorkontroll eller som uttrykker FoxO3a (r). Cellelysatene ble høstet for immunoblot 72 timer etter transfeksjon. (B) PC3 celler ble transfektert med 3 forskjellige uttrykk plasmider, som er vektor-Flag kontroll, flagg-FoxO3a eller Flag-FoxO3a-3A, henholdsvis; cellelysatene ble preparert 72 timer etter transfeksjon for immunoblotanalyse av de angitte proteiner.
FoxO3a regulering av autophagy er mediert av FoxO1
Det ble bemerket at knockdown av FoxO3a resulterte i en økning på FoxO1 proteinnivå (fig. 4A), øke muligheten for at FoxO1 formidler autofagi induksjons virkning fra FoxO3a undertrykkelse. For å undersøke forholdet mellom FoxO1 og FoxO3a i reguleringen av autophagy, vi samtidig undertrykket ekspresjon av disse to proteiner. Samtidig knockdown av FoxO1 ikke bare hemmet basal autofagi som forventet, men også helt avskaffet heving av autophagy indusert av FoxO3a knockdown (fig. 4A), noe som tyder på at FoxO1 er uunnværlig i autofagi induksjon følge FoxO3a undertrykkelse. Transfeksjon av to forskjellige sirnas målrettet mot FoxO3a både medførte forhøyet FoxO1 proteinnivå (fig. 4B), som gjør muligheten for off-target virkninger av sirnas en usannsynlig scenario. Konsekvent til virkningen på proteinnivå, vurdering av transkripsjon av real-time PCR viste en økning på FoxO1 uttrykk med FoxO3a knockdown (fig. 4C), noe som tyder på at FoxO3a transcriptionally regulerer FoxO1 nivå. Videre behandling av celler med cykloheksimid samtidig med FoxO3a knockdown eliminert økningen av FoxO1 proteinnivå (fig. 4D), noe som gir ytterligere bevis for FoxO3a regulere ekspresjon, ikke stabiliteten av FoxO1. Samlet utgjør disse data støtter konklusjonene at økningen i FoxO1 følge FoxO3a knockdown er sannsynlig et resultat av økt transkripsjon og syntese av FoxO1.
(A) PC3 celler ble transfektert med siRNA for luciferase (siLuc) , FoxO1 (siFoxO1), eller FoxO3a (siFoxO3a), eller kombinasjoner, som angitt. Cellene ble høstet 72 timer etter transfeksjon, og cellelysater behandlet for immunoblotanalyse av de angitte proteiner. (B) FoxO3a knockdown med to FoxO3a målretting siRNA å illustrere effekten på FoxO1 protein nivå. (C) Real-time PCR-analyse av FoxO1 og FoxO3a mRNA nivåer i kontroll siRNA (grå) eller FoxO3a siRNA (svart) transfekterte celler. Celler ble høstet og behandlet 48 timer etter transfeksjon; 18S ribosomalt RNA ble analysert som normalisering kontroll. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. ( «**»,
p
0,01). (D) PC3 celler ble transfektert med kontroll siRNA eller FoxO3a siRNA som angitt. Etter 48 timer med transfeksjon ble celler behandlet med enten DMSO kontroll eller 10 pg /ml cykloheksimid i 24 timer som indikert før den ble høstet for immunoblotanalyse av de angitte proteiner. Den FoxO1 /GAPDH ratio for hver tilstand er som presenteres etter bandet kvantifisering av ImageJ. (E) Real-time PCR-analyse av endogent FoxO1 ekspresjonsnivået i PC3-celler transfektert med enten kontroll-plasmid (vektor) eller som uttrykker FoxO3a (r); i hver gruppe av plasmidet transfekterte cellene, enten kontroll siRNA eller FoxO3a siRNA ble samtidig innført. Cellene høstes for RNA forberedelse og q-PCR-analyse 72 timer etter transfeksjon; FoxO1 transkripsjonsnivåer ble analysert, som beskrevet i eksperimentelle prosedyrer. 18S ble benyttet som normaliseringskontroll. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. ( «**»,
p
0,01). Alle forsøk har blitt utført tre ganger med samme resultat.
For ytterligere å undersøke potensialet negative transkripsjonsregulering av FoxO1 av FoxO3a, vi vurdert effekten av FoxO3a overekspresjon på endogen FoxO1 transkripsjon. Når det innføres i PC3-celler, ble direkte innvirkning av FoxO3a (r) på FoxO1 ekspresjon observert, med eller uten samtidig knockdown av FoxO3a. Den hemmende effekten av FoxO3a (r) på basal FoxO1 ekspresjon var beskjedne, men signifikant. I kontrast, innføring av FoxO3a (r) nesten helt utslettet økningen av FoxO1 transkripsjon indusert av FoxO3a siRNA, og bringer den tilbake til nær basalnivået (fig. 4E). Dette FoxO3a redning studien gir direkte bevis for FoxO3a hemming av FoxO1 transkripsjon i PC3 celler. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at FoxO3a regulerer cellulær autofagi negativt ved å hemme transkripsjon av FoxO1, en positiv regulator av autofagi og celle metabolisme.
Høyde i cytosol FoxO1, som følge av FoxO3a undertrykkelse, induserer autophagy
det er vel-etablert at FoxO1 positivt regulerer autofagi ved økning av transkripsjon av enkelte autophagy gener [23], [24]. Imidlertid har nyere studier gitt overbevisende bevis for at cytosolic FoxO1 fremmer autofagi uavhengig av sin transkripsjonsregulerende aktivitet [33], [34]. Denne studien hittil har vist at undertrykkelse av FoxO3a økt transkripsjon og total FoxO1protein nivå, noe som er årsaken til forhøyet autophagy. Det er imidlertid uklart om dette FoxO1 avhengig autofagi er hovedsakelig på grunn av sitt atom eller cytosolic funksjon. Vi søker å definere dette spørsmålet ved hjelp av et par ulike tilnærminger. Fraksjonering av PC3 cellelysat følgende knockdown av FoxO3a viste en signifikant økning av cytosolisk FoxO1, mens mengden av kjerne FoxO1 forbli uforandret (Fig. 5A). Dette resultatet tyder på at den økede FoxO1 som følge av FoxO3a undertrykkelse hovedsakelig akkumuleres i cytosol. Vi spekulere at denne hovedsakelig cytosoliske heving av FoxO1 var den sannsynlige årsaken for aktivering av autophagy følgende FoxO3 knockdown, i samsvar med noen nylige rapporter [33], [34]. I samsvar med den fraksjoner studien, RT-PCR kvantifisering av kjente FoxO målgener som er involvert i autofagi, slik som Atg4c, Atg7, LC3, Atg12, og Bnip3, viste ingen signifikant økning i ekspresjon ved FoxO3a knockdown selv om FoxO1 ble hevet som forventet (fig . 5B)
(A) PC3-celler ble transfektert med siRNA for luciferase (-) eller FoxO3a (siFoxO3a) som angitt, og høstet for immunoblotanalyse av de angitte proteiner 72 timer etter transfeksjon.; se Eksperimentelle metoder for detaljer. Histone H3 og GAPDH ble brukt som lastekontroll for kjernefysiske og cytosoliske proteiner, henholdsvis. Bandet mengde forhold, FoxO1 /GAPDH og FoxO1 /Histone H3, for hver tilstand ble oppnådd ved hjelp ImageJ. (B) Real-time PCR-analyse for de relative uttrykk nivåer av de angitte autofagi relaterte gener 48 timer etter transfeksjon av PC3 celler med kontroll siRNA (svart) eller to ulike siRNAs rettet mot FoxO3a (lys og mørk grå, henholdsvis). Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. (C, D) Over-uttrykk for en transkripsjon funksjon inaktiv /cytosolic form av FoxO1, FoxO1-ΔDB, øker autofagi. Mengdene av LC3 positiv vesikkel av både PC3 (panel C) og H1299 (panel D) celler ble sammenlignet i den samme analysen mellom Flag-FoxO1-ΔDB over-uttrykkende celler og un-transfekterte celler. FITC og rhodamin merkede sekundære antistoff ble anvendt for påvisning av anti-LC3 eller anti-Flag tag, respektivt. Den autofagi nivå i hver celle befolkningen ble kvantifisert ved hjelp MetaMorph programvare; data ble plottet på den høyre side av hvert panel. 50 celler ble analysert for hver tilstand. Data ble presentert som gjennomsnitt ± SEM ( «**»,
p
0,01).
For å direkte vurdere virkningen av cytosoliske FoxO1 på autofagi i PC3 kreftceller, introduserte vi inn i celler et uttrykk vektor som inneholder Flag-merket FoxO1 modifisert til å ha en defekt DNA bindende mutasjon, FoxO1-ΔDB [33]. Den FoxO1-ΔDB dermed uttrykt er ikke-fungerende som en transkripsjonsfaktor og interessant, nesten utelukkende lokalisert til cytosol. I begge PC3 celler (Fig. 5C) og H1299 celler (fig. 5D), Flag-FoxO1-ΔDB protein ble utelukkende lokalisert til cytosol som forventet [33] og Flagg-FoxO1-ΔDB uttrykker celler (røde) hadde markert høyere nivå av autophagosomes enn for de un-transfekterte celler. Bildeanalyse har vist statistisk signifikant økning av autophagosome i celler som uttrykker cytosolically lokalisert FoxO1. Disse dataene gir direkte bevis for å støtte ideen om at cytosolic opphopning av FoxO1 i disse kreftcellene faktisk fremmer autofagi, uavhengig av sitt atom funksjon.
cytosolic FoxO1-mediert induksjon av autofagi er uavhengig av undertrykkelse av mTORC1 aktivitet
mTORC1 er et velkjent sensor for ernæring og vekstfaktor signale; det hemmer autophagy som respons på vekstsignalering. Derfor undersøkte vi aktiviteten til mTORC1 signaliserer når FoxO1 eller FoxO3a uttrykk er undertrykt med siRNA. FoxO3a knockdown førte til en betydelig heving av autofagi sett ovenfor; ble ikke observert noen signifikante endringer i mønsteret av fosfor-4EBP1 og fosfor-S6 i celler med FoxO3a knockdown mens autofagi ble markert indusert (Fig. 6A, DMSO), noe som tyder på at heving av autophagy indusert av FoxO3a knockdown var trolig ikke gjennom hemming av mTORC1 . Verdt å merke seg, FoxO1 knockdown-mediert nedregulering av autofagi ble ledsaget av en hemming av mTORC1 signalering, basert på både fosfor-4EBP1 og fosfor-S6 mønstre (Fig. 6B, DMSO), som også støttet tanken om at FoxO regulering av autofagi var ikke formidlet gjennom den klassiske mTORC1 signalisering i dette tilfellet.
(A) PC3 celler ble transfektert med sirnas målretting FoxO3a som angitt. Etter 48 timer med transfeksjon, ble cellene underkastet behandling rapamycin i 24 timer før behandling for immunoblotanalyse av de angitte proteiner. (B) PC3-celler gjennomgikk tilsvarende undersøkelse som beskrevet i (A), bortsett fra siRNA målretting FoxO1 ble anvendt som angitt. Alle forsøk har blitt utført tre ganger med samme resultat.
For å ytterligere evaluere samspillet mellom mTOR signal og FoxO regulert autofagi, vi kombinert enten FoxO3a eller FoxO1 knockdown med rapamycin behandling i PC3 celler.
