Abstract
BAD, en pro-apoptotiske proteiner i BCL-2-familien, har nylig blitt identifisert som en integrator av flere anti- apoptotiske signalveier i prostatakreftceller. Dermed aktivering av EGFR, GPCR eller PI3K veien fører til dårlig fosforylering og hemming av apoptose. Økte nivåer av BAD i prostata karsinom har også blitt rapportert. Det viser seg motstridende at i stedet for å begrense ekspresjon av pro-apoptotiske protein, prostata kreftceller velge å øke BAD nivåer samtidig holde den under stram fosforylering kontroll. Analyse av effekten av dårlig på prostatakreft xenografter har vist at økt BAD uttrykk forbedrer tumorvekst, mens knockdown av BAD uttrykk ved shRNA hemmer tumorvekst. Vev kultur eksperimenter vist at økt BAD uttrykk stimulerer spredning av prostata kreft celler. Disse resultatene tyder på at økt uttrykk av BAD gir en proliferativ fordel å prostatakreft, mens BAD defosforylering øker følsomheten for prostata kreft celler til apoptose. Kombinasjon av proliferative og apoptotiske egenskaper ber prostata kreft celler til å bli «avhengige» til økte nivåer av fosforylert BAD. Dermed kinaser som fosforylerer BAD er plausible terapeutiske mål; mens overvåking BAD fosforylering kan brukes til å forutsi tumor respons til behandlinger
Citation. Smith AJ, Karpova Y, D’Agostino R Jr, Willingham M, Kulik G (2009) uttrykk av Bcl-2 Protein BAD fremmer prostatakreft vekst. PLoS ONE 4 (7): e6224. doi: 10,1371 /journal.pone.0006224
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 10 mars 2009; Godkjent: 11 juni 2009; Publisert: 13.07.2009
Copyright: © 2009 Smith et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH /NCI tilskuddet R01 CA118329, Department of Defense Prostate Cancer Research Program Grant PC073548, tilskudd fra Comprehensive Cancer Center og WFUSM Interim tilskudd GK; AS ble støttet av NIH Award T32CA079448. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den hyppigste diagnosen kreft og den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn i USA [1]. Foreløpig er det ingen effektiv behandling for androgen-uavhengig avansert prostatakreft [2]. Mekanismer som gjør at prostata kreft celler til å unngå apoptose kan bidra til terapeutisk motstand. Således økte nivåer av flere vekstfaktorer, inkludert FGF, EGF, IL-6 og GPCR-agonister som aktiverer anti-apoptotiske signalveier, har blitt rapportert i androgen-uavhengig prostatacancer [3] – [7]. Anti-apoptotiske signaler kan enten post-translatorisk endre apoptose regulatoriske proteiner eller endre sine uttrykk nivåer. Faktisk har økt ekspresjon av anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner, så vel som inhibitorer av apoptose proteiner (RSU) i prostatakreft blitt rapportert [8], [9]. Også har vi nylig vist at i prostatakreftceller, pro-apoptotiske Bcl-2 proteinet BAD spiller en unik rolle som samlingspunkt av flere anti-apoptotiske signalveier som inkluderer konstitutivt aktiv PI3K, aktivert EGFR og GPCR [6].
BAD, BCL-XL /BCL-2-antagonist forårsaker celledød, ble først identifisert i en gjær to hybrid skjerm samspill med BCL-2 eller BCL-XL [10]. BAD er en unik BH3-bare familiemedlem i at reguleringen er i hovedsak mediert gjennom sine konserverte fosforyleringsseter (seriner 112, 136, og 155 basert på musen sekvens) [11], [12]. Fosforylert BAD unnlater å binde BCL-XL eller BCL-2 proteiner, og har vært ansett som en apoptose sentinel inaktivert av anti-apoptotiske signaler. Ved uttak av overlevelsesfaktorer BAD blir defosforylert, forskyver balansen av pro- og anti-apoptotiske Bcl-proteiner som utløser frigjøring av cytokrom c, SMAC og AIF fra mitokondrier og deretter fører til apoptose [12]. Dermed ville det ikke være overraskende om kreftcellene redusere BAD uttrykk.
En fersk studie har vist at dårlig uttrykk er forhøyet i prostata karsinom sammenlignet med lav uttrykk i normal prostata epitel [13]. Det virker counterintuitive at prostataceller ville vie ekstra ressurser for å opprettholde BAD fosforylering i stedet for å eliminere dens uttrykk. Det er mulig at i tillegg til å regulere apoptose, kan BAD spille en positiv rolle i prostata tumorvekst.
Her rapporterer vi at økt BAD uttrykk stimulerer spredning av prostata kreft celler i vev kultur og prostata tumorvekst
in vivo
. På samme tid øker BAD defosforylering følsomheten av prostatacancerceller til apoptose. Denne kombinasjonen av proliferative og apoptotiske egenskaper skaper forutsetninger for prostata kreft celler «avhengighet» til økte nivåer av fosforylert BAD. Dermed kinaser som fosforylerer BAD er plausible terapeutiske mål.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Prostatakreft cellelinjer, LNCaP og c4-2, var gaver fra Dr. Leland Chung (Emory University, Atlanta GA). C4-2BADLuc celler ble generert ved trans c4-2 celler med vill-type BAD (HA-BAD-pTRE2hygro) og ildflue luciferase (PGL3) mens pTRE2hygro og ildflue luciferase (PGL3) ble transfektert inn c4-2 celler til å generere C4-2Luc . LNCaP-celler ble opprettholdt med T-medium supplert med 5% føtalt bovint serum, og c4-2-celler ble opprettholdt med RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum. Alle celler ble holdt ved 5% CO
2 ved 37 ° C
Antistoffer og andre reagenser
Antistoffer ble hentet fra følgende kilder:. BAD, fosfor-spesifikke BAD (seriner 112 , 136, 155) fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA); ERK fra Zymed Laboratories (South San Francisco, CA); sekundært pepperrot-peroksidase-konjugert antistoff benyttet for Western blot fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Alle andre kjemikalier (mindre dette er spesifisert) ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Vev kultur reagenser ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California).
shRNA eksperimenter
En lentiviral vektor (pLL3.7) [14] ble brukt med en shRNA innsats av glødet oligonukleotider. Den dårlige DNA-målsekvenser ble anvendt var 5′-TGAAGGGACTTCCTCGCCCGT-3 «og 5′-GGCTTGGTCCCATCGGAAG-3». HEK 293-celler ble transfektert med pLL3.7 vektor inneholdende en av disse sekvenser eller en kodet sekvens 5′-GGTACGGTCAGGCAGCTTCT-3 «i kombinasjon med emballasje vektorer (VSVG, RSV-REV og pMDL g /p RRE). Etter 48 timer ble supernatanter oppsamlet fra disse cellene og anvendt for å infisere LNCaP eller c4-2-celler [6]. Førti-åtte timer etter infeksjon ble cellene belagt for senere eksperimenter
proliferasjonsanalyser
Celletall ble gjort av følgende: a. 2 × 10
5 celler ble sådd ut i seks cm retter for hver forsøksgruppe. Den opprinnelige celletall var 24 timer etter at cellene hadde festet til rettene (dag 1). Ytterligere to tellinger ble foretatt i tre dager senere (dag 4), og seks dager senere (dag 7), og deretter sammenlignet med den initiale celletall. Tellinger ble gjort av trypsinizing og samle celler i media, deretter manuelt telle på en hemacytometer. MTT analyser ble gjort i henhold til instruksjonene fra kit produsenten (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) på celler belagt i 24-vel plater med varierende tettheter. Triplikate brønner ble anvendt for hvert datapunkt.
Immunhistokjemi
antistoff-farging ble utført på histologiske snitt av formalin-fikserte prostata tumor-xenografter. Antigen gjenfinning ble utført ved oppvarming av lysbilder ved 95 ° C i 10 mM natriumsitratbuffer (pH 6,0) i 60 minutter. Deretter Snittene ble behandlet likt som følger: 1) inkuberes i 2% hydrogenperoksyd for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet; 2) inkubert med blokkeringsløsning: 1% BSA, 0,1% Tween 20 i PBS (30 min, 25 ° C); 3) inkubert med primære antistoffer, Ki-67 fra Abcam Inc. (Cambridge, MA) fortynnet 1:25-1:200 i blokkeringsløsning (over natten, 4 ° C); primære antistoffer ble etterfulgt av peroksidasekonjugert anti-kanin sekundære antistoffer (10 ug /ml, i blokkeringsløsning, 30 min, 25 ° C) og viste med 3,3′-diaminobenzidin (DAB) som fremkallende kromogen. Mellom trinnene, ble prøvene vasket i PBS 3 ganger.
subkutane implantasjoner
Nude mus (BALB /cAnNCrj-nu fra Charles River) fikk fire subkutane injeksjoner av 2 × 10
6 celler med Matrigel. Injeksjoner ble gjort ved anvendelse av en insulinsprøyte og en 27 gauge nål. Alle manipulasjoner med dyr ble utført i human måte, i streng overholdelse med en protokoll godkjent av institusjonelle ACUC, som er designet for å minimere dyrs lidelser.
Luminescence Imaging
Tumorvekst ble analysert med en Xenogen IVIS® 100 optiske bildesystem (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Dyr ble immobilisert substrat for injeksjon og avbildning gjennom en tilknyttet gassanestesi system bestående av 2% isofluran /O
2. Å gjøre rede for bakgrunnen og spesifikk luminescens, ble musene fotografert før injeksjon av luciferase. Dyrene ble injisert med 100 ul av den ildflueluciferase substratet luciferin (3,5 mg /ml i PBS) og avbildes 15 minutter senere utsatt og liggende posisjoner (5 minutter hver). Hel-kroppen bilder ble oppnådd ved bruk av levende Image® programvaren som følger med imaging system. En grå-skala fotografisk bilde og bioluminescent fargebilde lagres å gi anatomisk registrering av lyssignalet. En region av interesse (ROI) ble valgt manuelt over selvlysende signal, og intensiteten ble registrert som fotoner /andre innenfor en ROI.
Statistisk analyse
For å finne ut om var forskjeller mellom datasett statistisk signifikant, t-test analyse (to-tailed distribusjon, to-utvalgs ulik varians). ble utført ved hjelp av Excel programvare
Resultater
BAD uttrykk stimulerer spredning av prostata kreft celler
Rapporter om økt uttrykk av BAD i prostatakreft ledet oss til å foreslå at prostata kreft celler kan ha nytte av å opprettholde BAD uttrykk. For å møte den mulige rollen til økt BAD uttrykk, undersøkte vi spredning av prostata kreft celler som overuttrykker BAD. For dette formål sammenlignet vi proliferasjon av cellelinjer som uttrykker ectopically dårlig og cellelinjer transfektert med tom vektor. Celler med forhøyede nivåer av BAD ble preget av økt spredning i vevskultur (Fig. 1A, B). For å utelukke muligheten for at økt spredning av celler som stabilt uttrykker BAD skyldtes klonale variasjoner, sammenlignet vi spredning i celler transient transfektert med enten dårlig eller tom vektor. Disse eksperimentene viste økt spredning i flere cellelinjer som forbigående uttrykker BAD (Fig. 1C).
(A) HA-BAD uttrykk i C4-2LucBAD klone. (B) C4-2LucBAD celler sprer seg raskere enn C42 celler. C4-2LucBAD celler eller C4-2Luc celler ble sådd ut i tre eksemplarer 6 cm retter. På dag 1 og 4 etter plating ble cellene trypsinert og telles. Resultater på 4 dager var signifikant forskjellig med en p-verdi på 0,001. Sammenlignbare resultater ble oppnådd ved forsøk hvor spredning ble målt ved MTT-analyse. C) Forbigående uttrykk for HA-BAD stimulerer spredning. LNCaP celler ble transfektert med 09:01 blanding av GFP og en av HA-BAD eller tomt uttrykk vektor. Syv dager etter transfeksjon, ble antallet GFP positive celler telles. Grafen viser HA-BAD /tom vektor forholdet mellom GFP positive celler. Spredning av GFP-positive celler ble bekreftet av tid lapse video-opptak. D) Knocking ned BAD uttrykk med shRNA reduserer spredning. En lentiviral vektor (pLentiLox 3.7) med en dårlig shRNA innsats ble brukt til å infisere C42cells. C4-2Luc celler ble sådd ut i tre eksemplarer 6 cm retter. På dag 1 og 4 etter plating ble cellene trypsinert og telles. Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger. E) Western blot analyse av BAD uttrykk i celler infisert med tom lentiviral vektor, egge shRNA eller BAD-spesifikk shRNA. Uttrykk av total ERK ble brukt som lasting kontroll.
Siden c4-2 celler er hentet fra metastatisk prostatakreft [15], er det mulig at de kan ha allerede etablerte optimale nivåer av BAD. Derfor undersøkte vi effekten av å slå ned BAD uttrykk på spredning av disse cellene. C4-2Luc celler ble infisert med lentiviral vektorer som koder egge shRNA eller BAD shRNA. Redusert uttrykk for BAD førte til redusert spredning av c4-2 celler (fig. 1D, E).
BAD uttrykk stimulerer prostata tumorvekst
Forsøk i vev kultur har vist at uttrykk for BAD stimulerer delingen av prostata kreftceller, så vel som andre kreftceller. For å avgjøre om økt uttrykk nivåer av BAD stimulere prostata tumorvekst
in vivo
, sammenlignet vi en vekst på C4-2Luc og C4-2LucBAD celler implantert hos immunsupprimerte mus. C4-2Luc og C4-2LucBAD celler uttrykker ildflue luciferase som tillater overvåking av xenograft vekst invasivt ved optisk avbildning. Måling av luminescens i stedet for fysisk tumorstørrelse tillater deteksjon av xenograft vekst før fremkomsten av følbar subkutane tumorer. Denne tilnærmingen reduserer den tid som kreves for å måle kinetikken av tumorvekst. Analyse av luminescens av C4-2Luc og C4-2LucBAD xenotransplantater viste økt svulst ta og raskere tumorvekst av C4-2LucBAD xenografter (Fig. 2AB). I samsvar med resultatene av luminescens analyse, C4-2LucBAD celler produsert håndgripelig svulster på høyere frekvens sammenligne med C4-2Luc celler (Fig. 2C). I samsvar med raskere vekst av C4-2LucBAD xenotransplantater, immunohistokjemisk analyse viste et økt antall celler som farget positivt for den proliferative markør Ki-67 sammenlignet med C4-2Luc xenografter (fig. 2D).
Nakne mus fikk fire subkutane injeksjoner av 2 × 10
6 C4-2Luc eller C4-2LucBAD celler. A) Representative hele kroppen bilder av dyrene som oppnås på en dag og 2 uker etter implantasjoner ved hjelp av IVIS100 og Living Image® programvare (Xenogen). B) Dot plott som viser dobling og median luminescens i mus injisert med C4-2Luc og C4-2LucBAD celler. C) Prosent av palpable tumorer (mer enn 5 mm) utviklet ved injeksjonssteder. D) Representative vevssnitt av formalinfiksert svulster farget for markør spredning Ki67.
knockdown av BAD uttrykk ved shRNA hemmer tumorvekst
Samtidig eksperimenter med C4-2LucBAD celler, eksperimenter ble utført med C4-2Luc celler i hvilke endogent BAD ekspresjon ble hemmet av den shRNA tilnærming. C4-2Luc-celler ble infisert med lentiviral vektor pLL3.7 som uttrykte BAD shRNA eller kryptert shRNA, og cellene ble deretter implantert subkutant i nakne mus. Luminescence of C4-2Luc xenotransplantater ble fulgt i en uke, som vist i fig. 3. C4-2Luc xenografter med redusert uttrykk for BAD viste redusert svulst ta og vokste langsommere enn celler med intakt BAD uttrykk.
Nude mus fikk to subkutane injeksjoner av 2 × 10
6 C4 -2Luc celler infisert med lentiviral vektor med BAD shRNA (høyre side) eller en tom vektor (venstre side). Bilder og kvantifisering er som i Figur 2. A) Representative bilder av C4-2Luc og C4-2LucBAD svulster. B) Dot plottet viser forholdet mellom luminescens på en uke /dag 1. Etter åtte uker, ble håndgripelig svulster oppdages bare på steder injisert med C4-2Luc celler infisert med tom vektor.
Diskusjoner
det nye rolle BAD fremme tumorvekst
resultatene presenteres i denne artikkelen viser at dårlig, BH-3 bare BCL-2 protein, kan fungere i en dobbel kapasitet i prostatakreft. Når dephosphorylated, fremmer BAD apoptose [11], mens i en fosforylert form den stimulerer spredning og tumorvekst
in vivo
. Denne forbindelsen mellom BAD uttrykk og spredning gir en mulig forklaring på økt uttrykk av fosforylert BAD protein i prostatakreft.
Nylig har flere studier har vist at funksjonene BAD kan strekke seg utover sensibiliserende celler til apoptose. For eksempel har publikasjoner fra Peter Vogt og Elizabeth Yang laboratorier antydet at BAD protein kan være involvert i å fremme cellesyklusprogresjon [16], [17]. Således blir fibroblaster med økt ekspresjon av Bcl-2 /BclXL kjennetegnet ved redusert apoptose og også ved redusert spredning. Men når BCL-2 eller BclXL danner en heterodimere kompleks med BAD, kan cellene vinne G0 /G1 vekst arrest og inngå S-fasen [17], [18]. Disse funnene ble utvidet til T-celler ved å vise at T-celler over-uttrykker BAD var mer sannsynlig å forbli i S-fase [19].
I andre nylige rapporter, BAD i fosforylert form ble funnet å fremme montering av aktive glukokinase-komplekser, et første trinn i glykolysen [20], [21]. Selv om både økt spredning og glykolyse er kjennetegnene ved tumorvekst, har den eksperimentelle bevis som kobler BAD uttrykk med tumorvekst vært mangelfull.
Kan BAD spille en dobbel rolle i prostatakreftceller?
Flere rapporter har vist at celler som uttrykker BAD sprer raskere; Men mekanistiske detaljer om hvordan BAD fremmer spredning divergere. En mulighet er at BAD gir en motvekt til økte nivåer av BclXL og BCL-2 som er kjent for å bremse spredningen [22]. Hvis dette scenariet er korrekt, vil enhver pro-apoptotiske BCL2 /BclXL antagonist forventes å ha en dårlig-lignende effekt. Men hvis ekspresjon av en slik antagonist er konstitutivt, ville det tap hensikten med øket Bcl-2 /BclXL ekspresjon ved å øke apoptose følsomhet. Siden andelen BAD som kunne danne heterodimerer med anti-apoptotiske kolleger avhenge fosforylering status, kan BAD være unikt egnet for rollen som modulator av BCL2 /BClXL, tilgjengelighet som er fininnstilt av proteinkinaser. Det er også mulig at ved å øke frekvensen av glukose utnyttelse, gir dårlig uttrykk konkurransefortrinn til cellene i hypoksiske svulster som bytter fra oksidativ fosforylering til glykolyse [23].
Den eksakte mekanismen for hvordan BCL proteiner regulere spredning er obskur. Det gjenstår å fastslå hvorvidt en enkel mekanisme spiller en dominerende rolle eller BAD avhengig stimulering av spredning medieres via flere mekanismer samtidig, og om dårlig lokalisering til en spesifikk organelle (f.eks mitokondrier, ER, kjernefysisk konvolutt) er viktig. Også denne positive effekt på celledeling, kan ikke jevnt manifestert i alle kreftceller. Således BAD velig hemmer G1 til S overgang i MCF7 brystcancerceller [24]. Inntil effektene av dårlig på spredning dissekeres på et molekylært nivå, er vi fortsatt med forestillingen om at effekten av dårlig uttrykk på spredning er celletype avhengige.
Konklusjoner
Uansett den eksakte mekanismen som tillater BAD å stimulere svulstvekst, kan denne egenskap gir selektivt trykk for å øke BAD ekspresjon i tumorer. Aktivering av protein kinaser som fosforylerer BAD skaper en ettergivende tilstand til økt uttrykk av BAD. Det er fristende å spekulere i at det høye BAD uttrykk bør gjøre disse svulstene stadig følsomme for hemmere av signalveier som styrer BAD. Hvis så, kan høye nivåer av fosforylert BAD brukes til å identifisere pasienter som vil dra nytte av behandling med slike inhibitorer. Fremtidige studier i dyremodeller og analyser av kliniske studier data med hensyn til dårlig uttrykk /fosforylering er nødvendig for å bestemme overføringsverdi for omfattende innsats brukt studere protein kinaser som fosforylerer BAD.
Takk
er takknemlige for James Wood for FACS analyse, og til Karen Klein for redigering.
