Abstract
hode og hals plateepitelkreft (HNSCC) er den 7
th vanligste kreftformen i verden. Til tross for utviklingen av nye terapeutiske midler som for eksempel monoklonale antistoffer, ble prognosen ikke endres for de siste tiår. Cold atmosfærisk plasma (CAP) presenterer den mest lovende ny teknologi i kreftbehandling. I denne studien ble effekten av en overflate mikro lossing (SMD) plasma enhet mot to hode- og nakkekreftcellelinjer ble bevist. Effekter på celle levedyktighet, DNA-fragmentering og apoptoseinduksjon ble evaluert med MTT analysen, alkalisk mikrogelstørrelse elektroforese (kometmetoden) og Annexin-V /PI farging. MTT-analysen viste at den CAP behandling markert reduserer cellenes levedyktighet for alle testede behandlingstider (30, 60, 90, 120 og 180 s). IC 50 ble nådd i løpet maksimale 120 sekunder av CAP behandling. Comet assay analyse viste en doseavhengig høy DNA-fragmentering å være en av de viktigste aktørene i anti-kreft aktivitet av CAP. Annexin-V /PI farging viste induksjon av apoptose i CAP behandlet HNSCC-cellelinjer, men ikke i noe signifikant doseavhengigheten ble sett. Dermed fikk vi bekreftet at SMD Plasma teknologien er definitivt en lovende ny tilnærming på kreftbehandling
Citation. Welz C, Emmert S, Canis M, Becker S, Baumeister P, Shimizu T, et al. (2015) Cold Atmosfærisk Plasma: En lovende Complementary Therapy for Squamous hode og nakke kreft. PLoS ONE 10 (11): e0141827. doi: 10,1371 /journal.pone.0141827
Redaktør: Michael Hamblin, Massachusetts General Hospital, UNITED STATES
mottatt: 21 april 2015; Godkjent: 13 oktober 2015; Publisert: 20.11.2015
Copyright: © 2015 Welz et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. arbeidet ble støttet av Friedrich-Baur-Stiftung München (GrandNumber 40/13) [https://www.baur-stiftung.de/front_content Php? idcat = 76]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Selv om forfatterne J. Zimmermann T. Shimizu og G. Morfill ikke var tilknyttet terraplasma GmbH på den tiden at studiene ble gjennomført, representerer nåværende jobb en opplevd økonomisk konkurrerende interesse som selskapet og dets ansatte vil trolig stå å dra nytte av suksessen til den kalde atmosfærisk plasmateknologi. Selvfølgelig det samme gjelder for en rekke plasma selskaper, der publisering av resultatene gir en fri forskning inngang samt frihet til å operere.
Innledning
hode og hals plateepitelkreft (HNSCC), inkludert malignitet i munnhulen, svelget og strupehodet, er det 7
th vanligste kreftformen i verden bidrar over 4% av det totale antall nye krefttilfeller i 2012. Dette betyr, nesten 600.000 nye sykdommer er diagnostisert per år på verdensbasis [1]. For 2014 er 55.070 nye tilfeller og 12.000 dødsfall anslått i USA. Den gjennomsnittlige 5 års overlevelse er omtrent 50%, som er hovedsakelig på grunn av den høye frekvensen av metastasering, andre maligniteter og spesielt lokalt tilbakefall av disse svulstene [2]. Til tross for nye tilnærminger i behandling av hode og nakke kreft som monoklonale antistoffer i total overlevelse ikke kunne hovedsak økt de siste tiårene, som ber for utvikling av nye antitumor tilnærminger og teknologier. På grunn av sine egenskaper, kald atmosfærisk plasma (CAP) er den mest lovende og eventuell utbygging i dette området.
Plasma kan forenklet beskrives som en delvis eller fullstendig ionisert gass. Syntetisk generert plasmaer som argon plasma coagulator er allerede etablert verktøy i medisin [3]. Men på grunn av deres høye temperaturer (mer enn 10.000 ° C), kan de bare brukes for ablasjon eller koagulasjon formål [4]. Siden noen år plasmaer kan genereres med en ione-temperatur som er nær romtemperatur. Disse såkalte kalde atmosfæriske plasmaer har allerede bevist sin enorme antimikrobiell effekt i kliniske studier og åpnet opp et bredt spekter av medisinske anvendelser, spesielt for alle varme-sensitive og viktige overflater som menneskelig hud eller slimhinner [5-10].
i tillegg til antimicrobiotic søknaden, hevet de siste resultatene en antitumor potensialet i CAP. De biologiske effekter og mekanismer fortsatt dårlig forstått [11-15]. Enkelte forfattere beskriver induksjon av apoptose av reaktive oksygenarter (ROS) [13,14]. Andre forfattere forklare plasmaeffekter ved mekanismer som nekrose og celle avløsning [12]. Videre har enkelte studier viste seg å være en innflytelse på cellesyklusen, slik som cellesyklus-stans eller induksjon av senescence mekanismer ved CAP [15,16]. Videre vår arbeidsgruppen viste en gjenopprettelse av følsomhet i chemo-resistente glioma celler ved CAP [17]. Sammenligningen og tolkningen av resultatene av disse forskjellige CAP undersøkelsene angående «anti-kreft-evne» er meget vanskelig. Dette er også knyttet til distribusjon av ulike teknologier (overflate mikro utlading (SMD), dielektrisk utlading (DBD), plasmastråler eller nåler) og deres applikasjoner. Derfor er forskjellig kjemi, sammensetning og konsentrasjon av plasmaprodukter, reaktive oksygen- og nitrogenforbindelser, elektroner, ioner, UV-lys og temperatur ble undersøkt. Likevel, nesten alle studier kunne se en antitumor effekt på mange forskjellige ondartede celler. Videre viser effekten spesifisitet for kreftceller [13-15,18,19].
understreker denne hypotesen vår arbeidsgruppen viste at CAP behandling av sunne menneskelige mucosavev kulturer (svelg og nese) induserer bare en liten cytotoksisitet, men ingen signifikante gentoksiske effekter opp til 120 sekunder av plasma behandling [20].
Hensikten med denne studien var evalueringen av antitumor effekten av vår CAP-enheten mot to plateepitelkreft i hode- og halskreft cellelinjer ( OSC-19 og Fadu) og undersøkelse av mulige mekanismer som forårsaker denne effekten. Den metodiske fokus ble satt på akutt cytotoksisitet (MTT-analyse), DNA-fragmentering (Comet Assay) og induksjon av apoptose (AnnexinV /PI). Plasma behandlingen ble utført av en håndholdt og batteridrevet enhet som brukes til overflaten Micro Discharge (SMD) -teknologi [21].
Materiale og metode
Cell Culture
Fadu cellelinje, som stammer fra et lavt gradert tungen kreft [22], ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). OSC 19 cellelinje oppnådd 1989 fra en hypopharyngeal kreft vokser in vivo som et godt differensiert plateepitelkarsinom med en høy grad av metastasering [23] og ble kjøpt fra JCBR Cell BANK. OSC 19 celler ble dyrket i DMEM /F-12 Ham’s (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) og Fadu celler i DMEM (Biochrom). Begge cellelinjer ble også supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA) og 10 U /ml penicillin-streptomycin (Biochrom). Fadu celler ble i tillegg supplert med 1% ikke-essensielle aminosyrer (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) og hver 1% L-glutamin og natriumpyruvat (Biochrom). Cellene ble holdt ved 37 ° C med 5% CO
2 under fuktede forhold.
Plasma Behandling
Denne studien ble utført av den såkalte MiniFlatPlaSter®, en håndholdt CAP-enhet som bruker Surface Micro Discharge (SMD) -teknologi for plasma produksjon i luften [21] (figur 1). Detaljer om enheten og plasma kjemi ble publisert i Welz et al. [20] og Maisch et al. [24]. Tabell 1 viser hoved utgjør frembringes av plasma anordningen
Konsentrasjonen av reaktive arter ble målt som en funksjon av tiden.; Verdiene er gjennomsnitt over 1 min.
SMD elektroden består av en glass epoxy styret, som er klemt av en kobberfolie lag og et rustfritt stål mesh grid. Ved å anvende en høy puls-lignende spenning på 7 kV (peak-to-peak) med en repetisjonsfrekvens på 6,75 kHz plasmaet fremstilles homogent på den mesh gitter side i den omgivende luft. Således er de genererte art transporteres til cellene ved diffusjon. I motsetning til Dielektrisk Barrier Discharge (DBD) enheter-de brukte SMD enhetene produserer svært lav strøm (tabell 1), som sikrer en trygg søknad hvis brukt in vivo.
For eksperimenter 5×10
5 kreftceller var er lagt inn i 6-brønners plater og fikk feste seg i 24 timer timer under samme betingelser som beskrevet ovenfor. Før CAP behandling, ble cellekulturmediet fjernet, slik at cellene weren’t er dekket av væske. CAP elektrode var konstruert med en diameter på 28 mm, slik at den nøyaktig passer til kanten av en brønn. Dette lukket volum stand hele CAP behandling begrense de produserte arter (Fig 2) inne. Avstanden mellom elektroden og cellene var lik 17,5 ± 0,5 mm. Temperaturen ved bunnen av brønnen ikke øker med mer enn en grad Celsius etter 180 s med CAP behandling. Sammen med anvendelsen ved diffusjon, blir dehydrering effekter på cellene ansett for å være lite sannsynlig. Hetten behandlingstider på 30, 60, 90, 120 og 180 s ble anvendt. For å utelukke uspesifikke plasma effekter (for eksempel «tørking effekter») som en mulig skjevhet, ble en separat kontroll for hver behandlingstiden gjennomføres. Dette betyr at de respektive kontroller ble behandlet på samme måte som de tilsvarende plasmabehandlingsforsøk med unntagelse av at kontrollcellene ikke har mottatt en plasmabehandling. Cell medium ble tilsatt alle brønner straks etter CAP eksponering.
celleviabilitet /MTT-analyse
Cytotoksisitetsdata målingene ble utført ved hjelp av Cell Proliferation Kit jeg av Roche Diagnostics (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) i henhold til bruksanvisningen. For å overvåke cellenes levedyktighet endres etter forskjellige CAP behandlingstider, som beskrevet ovenfor, ble de behandlede celler og de respektive kontroller trypsinert og sådd med 8000 celler /brønn (100 ul) i en 96-brønners plate. Celletoksisitet ble målt 24 timer etter plasmabehandling utskifting av kulturmediet med 10 ul merking medium inneholdende 0,5 mg /ml MTT. Etter 4 timers inkubering i en fuktig atmosfære (37 ° C med 5% CO
2), ble 100 ul MTT-fargeløsning tilsatt til hver brønn etterfulgt av inkubasjon natten over. Den lilla formazanforbindelsen fargestoff ble kvantifisert ved hjelp av en VERSAmax ™ ELISA- Reader (Molecular Devices GmbH, Biberach, Tyskland) ved en bølgelengde på 550 nm. Henvisningen bølgelengde tilsvarer 690 nm. Hvert eksperiment inneholdt triplikate målinger av cellelevedyktighet reduksjon av hver plasmabehandlingstiden. Videre ble hvert eksperiment gjentatt fem ganger (målinger for hver behandling gang n = 15). De gjennomsnittlige Celleviabilitet reduksjonskurver ble standardisert til redusert prosentandel av levende celler, mens kontroll celler ble satt til 0%.
DNA-skader /Comet assay
For å kvantifisere DNA-skader etter annen CAP behandling, vurdering av alkalisk mikrogel elektroforese (Comet assay) ble utført. I utgangspunktet protokollen er i stand til å oppdage DNA-trådbrudd i enkeltceller, alkali-labile nettsteder (ALSs) og ufullstendig excision reparasjon [25].
For målinger, trypsinering ble utført rett etter CAP behandling ved inkubasjon med en ml trypsin /EDTA løsning for 8-10 min. Etter nøytralisering og sentrifugering (10 min, 900 U /min), celletelling og celleviabilitet skjerm ved trypan blå eksklusjon-testen ble utført. På hvert lysbilde 200.000 celler ble påført og dekket med 0,5% normalt smeltende agarose (Biozym) for å sikre stabilitet til agarose lagene. For cellelysering ble objekt dekket med alkali-løsning i 1 time (10% DMSO, 1% Triton-X, 2,5 M NaCl, 10 mM Trizma-Base, 100 mM Na
2 EDTA og 1% N -lauroylsarcosine natriumsalt) . Da objektglassene ble plassert i gelelektroforese kammeret (Renner, Dannstadt, Tyskland) og inkubert i 20 minutter med alkalisk bufferoppløsning inneholdende 300 mM NaOH og 1 mM Na2EDTA ved pH 13,2. Etter at denne DNA avviklings periode, ble elektroforese startet ved 0,8 V cm-1 og 300 mA og fortsatte i 20 minutter, fulgt av nøytralisering (Trisma-base, 400 mm, pH 7,5, Merck, Tyskland).
Før analyse med en DMLB mikroskop (Leica, Bensheim, Tyskland) fluorescerende DNA farging ble utført med 75 mL etidiumbromid (Sigma [51 mikrometer]). 80 cellekjerner per lysbilde (2 lysbilder per CAP behandlingstiden) ble valgt med tilfeldig mønster og digitalisert med vedlagte monokrom CCD-kamera (Cohu Inc., San Diego, CA, USA).
En høy DNA fragmentering /DNA-skade fører til en hurtigere og ytterligere migrasjon i det elektriske felt, ettersom intakt DNA ikke migrerer (figur 3). DNA-migrering ble målt ved hjelp av bildeanalyse-programvare Komet ++ (Kinetic Imaging, Liverpool, UK) ved anvendelse av% av DNA i halen. Det% hale-DNA er et mål på den relative fluorescensintensitet i hodet og halen.
A Ikke skadet OSC-19 celle med intakt DNA og ingen migrering. DNA-fragmentering fører til en hurtigere og ytterligere migrering inn i det elektriske feltet, hvilket resulterer i en figur formet som en komet med uskadet DNA i hodet og skadet DNA i halen (B + C). Den lysere og lengre halen, jo høyere nivå av DNA-fragmentering. B OSC-19 celle med en moderat CAP indusert DNA-skade. C Representant bilde av høy DNA-fragmentering.
apoptose deteksjon
Induksjon av apoptose 24 timer etter at CAP behandling ble undersøkt med fluorescens mikroskopi med Annexin V-FITC deteksjon kit (PromoKine , Heidelberg). CAP behandling og trypsinering ble utført som beskrevet ovenfor. For eksperimenter 1×10
5-celler ble resuspendert i 500 ul bindings puffer-løsning og inkubert i 5 minutter under rødt lys med 5 ul Annexin V-FITC og 5 mL propidium iodid (PI). Translokasjon av phosphatidylserin (PS) fra den indre til den ytre overflate av plasmamembranen er et tidlig trinn av apoptose. Annexin-V er et kalsiumavhengig fosfolipid bindende protein med høy affinitet for PS og kan derfor brukes som en markør følsom for de apoptotiske celler. Kombinere Annexin-V merking med en PI flekker tillater differensiering mellom levedyktige, tidlig apoptotiske og sene apoptotiske /nekrotiske celler (fig 4). 100 celler per CAP behandling ble talt opp og tidlig apoptotiske celler ble identifisert og indekser ble beregnet.
Resultatene oppnådd ved fluorescens mikroskopi viser at tidlig apoptotiske celler har bundet Annexin-FITC til phosphatidylserin på membranen overflaten (grønn celle) . Som apoptose kommet, blir plasmamembranen integritet tapt, og propidiumjodid- er i stand til å binde seg til nukleotid DNA, slik at sen apoptotiske eller nekrotiske celler vises i rødt.
Statistisk analyse
Med mindre annet er angitt data ble rapportert som den aritmetiske gjennomsnitt ± SEM. Den Sigmaplot programvare for Windows versjon 12.0 (2011 av Systat Software Inc. CA, USA) ble brukt for statistiske analyser. For beregning av statistisk signifikans av resultatene de Friedman gjentatte målinger variansanalyse på Ranks og alle Parvise Flere Sammenligning Prosedyrer (Student-Newman-Keuls Metode) ble brukt. Forskjeller ble ansett signifikant ved p-verdier 0,05, før den statistiske analysen.
Resultater
doseavhengig reduksjon av cellenes levedyktighet etter CAP behandling
Fig 5 viser reduksjon av levedyktigheten til OSC-19 og Fadu kreft CAP celler etter eksponering for behandlinger av 30, 60, 90, 120 og 180 er sammenlignet med de ubehandlede kontroller. Cellelevedyktigheten ble kvantifisert ved anvendelse av MTT-analysen som beskrevet i metodedelen. Reduksjon av levedyktighet ble satt til 0%, slik at resultatene i negativ -expressed prosent av kontroll- tillate visuell sammenligning mellom de to cellelinjer. For Fadu cellelevedyktigheten celler ble signifikant redusert med 4,8% (p 0,05) for en CAP behandlingstid på 30 s sammenlignet med kontrollene. En behandlingstid på 60 s indusert en reduksjon på 23,4% (p 0,05) som var statistisk signifikant sammenlignet med kontrollene og 30-årene. Lengre behandlingstid på 90 s og 120 s droppet levedyktighet med 43,6 henholdsvis 49,2%. I forhold til kontrollene og de tidligere kortere behandlinger tider av 30 s og 60 s disse reduksjonene var svært signifikant (p 0001). En behandlingstid på 180s reduseres Fadu levedyktighet med 51,4%. I tilfellet av 90 s og 120 s dette var en signifikant reduksjon i forhold til kontrollene og behandlingstider opp til 60 sekunder (p 0,05). Sammenligningen av 90, 120 og 180 s viste ingen ytterligere betydelig celle levedyktighet reduksjon (p 0,05).
For begge HNSCC cellelinjer levedyktighet avtar for økende CAP behandlingstider. Standardfeil av gjennomsnittet, avbildet ved whisker blotter.
For OSC 19 celler levedyktighet ble redusert med 20% etter en behandlingstid på 30 s, og med henholdsvis 31,2% i 60 s. Lengre behandlingstider (90 s og 120 s) indusert ytterligere reduksjon av cellenes levedyktighet med 51,7% (90 s) og 64,1% (120 s). Alle levedyktighet reduksjoner var statistisk signifikant sammenlignet med de ubehandlede kontroller, og for de tidligere kortere behandlingstider (p 0,05). 180 s behandling føre til en ytterligere reduksjon av 73,3%, noe som var signifikant sammenlignet med kontrollene og behandlingstider opp til 90 s (p 0,05)
induksjon av DNA-skade ved. CAP
for å undersøke om tidsavhengig reduksjon i celle levedyktighet og den økende frekvensen av apoptose er forårsaket av CAP indusert DNA skade alkalisk mikrogelstørrelse elektroforese analysen ble utført. Figurene 6 og 7 viser prosentandelen av hale-DNA fra hver cellelinje i detalj.
Standard boks-plott (lavere kvartil, median, øvre kvartil) ble anvendt for å illustrere resultatene. Dots betegne milde statistiske uteliggere (mellom 1,5 og 3 ganger interkvartilt område (IQR)); stjernetegn betegne ekstreme statistiske utliggere (mer enn 3 ganger IQR).
Standard box-plott (nedre kvartil, median, øvre kvartil) ble brukt til å illustrere resultatene. Prikker betegne mild statistiske utliggere (mellom 1,5 og 3 ganger interkvartilt område (IQR)).
Analyse av forsøk under anvendelse av den Fadu cellelinje (figur 6) viste ingen signifikant økning av DNA-skade sammenlignet med kontrollene (4,2%; p 0,05) i 30 s av plasma behandling (4,8% av DNA i halen). For 60 s en betydelig økning av% hale-DNA (7,6%) sammenlignet med de ubehandlede kontrollene (P 0,05) og CAP varighet av 30 s (p 0,05) ble observert. Lengre varigheter økte DNA-fragmentering til henholdsvis 14,8% (90 e) til 17,9% (120 s). Sammenlignet med kontrollene, 30 s og 60 s av CAP behandling denne tilveksten var statistisk signifikant (p 0,05). Den økende DNA-skader fra 90 s til 120 s av CAP behandling viste en statistisk betydning også. CAP periode på 180 s fører til en ytterligere DNA-fragmentering av 20,5% DNA i halen. Sammenlignet med de ubehandlede kontroller og alle andre behandlingstider dette inkrement av 180 s var statistisk signifikant (p 0,05).
For OSC 19 celler 30 s plasma behandling induserte en DNA-fragmentering på 4,0%, noe som ikke var signifikant sammenlignet med de ubehandlede kontroller (3,1%; p 0,05). Lengre CAP behandling (60 s og 90 s) induserte en økning av DNA-skade til 6,5% (60s) og 9,6% (90 s). I likhet med Fadu cellelinje-forsøk denne økningen viste en signifikant (p 0,05) sammenlignet med kontroller og hver tidligere behandlingstiden. Faktisk, for 120 s og 180 s ble det observert en ytterligere vekst av DNA-fragmentering (9,8% i 120 s, 12,7% etter 180 s), men denne økning var ikke signifikant sammenlignet med den tidligere kjente varighet på 90 s (p 0,05). Figur 7 viser% hale DNA for OSC 19 celler i detalj.
CAP indusert apoptose
For å avklare om den tidsavhengige økning av DNA-skader induserer apoptose og hvis reduksjon i celle levedyktighet kan forklares av programmert celledød, ble AnnexinV /PI farging utført 24 timer etter CAP behandling. Som vist i figurene 8 og 9, plasma-behandling indusert apoptose i begge cellelinjer. 180 s plasmabehandling resulterte i en over fire-gangers økning i tidlig apoptotiske celler sammenlignet med kontrollene (p ≤ 0,002). I detalj, for Fadu cellelinje (figur 8) den ubehandlede kontroll viste et gjennomsnitt på 1,9% apoptotiske celler. Etter en CAP behandlingstid på 30 s en svak økning av apoptose (3,6%) ble detektert, som var signifikant til kontrollene (p 0,01). Etter 60 s et gjennomsnitt på 5,5% av cellene apoptotiske og en varighet av 90 s økte frekvensen av apoptotiske celler til 7,3%. Sammenlignet med kontrollene, og for hver kortere behandlingstid denne økningen var statistisk signifikant (p 0,05). Lengre behandlingstider 120 s og 180 s viste økende forekomst av apoptotiske celler av 8,5%, henholdsvis 7,5%. Sammenlignet med kontrollene og behandlingstider opp til 60 er disse prisene var statistisk signifikant (p 0,05), men ingen betydning ble sett i forhold til hverandre og til 90 s (p 0,05).
ubehandlede OSC 19-celler viste et gjennomsnitt på 2,6% av apoptotiske celler (figur 9). For CAP behandlingstider på 30 s, ble en svak økning av apoptose til 4,4% registrert, men disse dataene er ikke signifikant. Et CAP behandlingstid på 60 s viste et gjennomsnitt på 5,5% apoptotiske celler, noe som er en betydelig økning i forhold til kontrollene (p 0,05). Den 90 s behandling økte frekvensen av apoptotiske celler til 5,9% og 120 s til 6,4%. Begge varighet viste en signifikant økning av apoptotisk celle hastighet i forhold til ubehandlet celle (p 0,05), men ingen betydning ble sett når du sammenligner det til kortere behandlingstider. En behandlingstid på 180 s indusert 11,3% apoptotiske celler. Denne økningen var statistisk signifikant sammenlignet med kontrollgruppen og alle før behandlingstider (p 0,05).
Diskusjoner
Med å være en av de mest potensielle agenter mot alle mikroorganisme og bevis på sin effekt i kliniske studier, er CAP medisin en raskt voksende forskningstema og utvikler økt betydning i helsevesenet. Kreftbehandling er den mest lovende ny medisinsk anvendelse av CAP. In vitro og in vivo studier av forskjellige typer tumorer viste sterke og spesifikke virkninger på kreftceller og hemming av kreft vekst [14-16,18,19]. Det synes at CAP kan indusere cellesyklus arrest og ved tilstrekkelig høye doser forårsake apoptose og nekrose i kreftceller. Men de eksakte mekanismene for CAP effekter fortsatt uklare.
produksjon av reaktive nitrogen og oksygen arter av CAP er tenkt å være en sentral aktør initiere de observerte direkte antitumoreffekter. Flere publikasjoner antyder en økning av intracellulære ROS /RNS nivåer ved CAP-behandling, for derved å indusere DNA-skade og apoptose i tumorceller [13,14,26]. Vandamme et al. viste en dose avhengig av induksjon av apoptose etter CAP behandling av ondartet gliom (U87MG) og kolorektal karsinom (HCT-116) celler [14]. Den apoptotiske celledød ble også forklart som et resultat av ROS effekter. I tillegg til ROS induserte DNA-skade, etterfulgt av apoptose det er data som beskriver en akutt cytotoksisk /nekrotiske virkning [12]. Per i dag finnes det ingen data som viser effekten av en SMD plasma enhet generert CAP mot hode og nakke kreft celler. Likevel, spesielt for organer med naturlig åpning som hud og slimhinner i øvre aerodigestive kanalen (munnhulen, orofarynx, deler av hypopharynx og strupehode) CAP avduker svært potente behandlingstilbud for kreft i hode og nakke. Videre vår håndholdt SMD-enhet, genererer plasma i den omgivende luft kan nå HNSCC via diffusjon og samtidig unngå en bærergass eller gass-strømmen. Således hypoteser vi at enheten kan indusere en behandlingstiden avhengig av celledød i HNSCC cellelinjer.
cellenes levedyktighet analysen viste at CAP hadde en signifikant anti-tumor-aktivitet på Fadu og OSC-19 cellelinjer med en IC
50 av 120 sek (Fadu) og 90 sek (OSC-19) eksponeringstid. I OSC-19 cellelinjene, varighet av 180s førte til 75% celledød. Disse resultatene er i tråd med flere studier som viste en anti-tumor aktivitet av CAP på ulike maligne cellelinjer inkludert melanom, gliom, hepatocellulær, og tykktarmskreft [11,13,14,27-30]. Til sammenligning våre undersøkelser på friske slimhinnecellekulturer med den samme enhet, og under de samme forsøksbetingelser viste bare en cellelevedyktighet reduksjon på 15% etter 120 s plasmabehandlings [20]. Derfor viste vi at vår SMD plasma enheten er effektiv mot HNSCC cellelinjer mens friske celler bli nesten upåvirket.
I tillegg til kirurgi, strålebehandling (RT) er den viktigste modalitet i primær HNSCC behandling og uunnværlig for adjuvant strategier [31] . Den viktigste mekanismen for kreft aktivitet henholdsvis evnen til strålebehandling er stråleinduserte DNA-skader som initierer cellesyklus endringer og signalkaskader slutt fører til celledød. For å vurdere om CAP er også i stand til å indusere DNA-skade i HNSCC celler som kan være ansvarlig for en behandling tidsavhengig levedyktighet reduksjon ble alkalisk mikrogelstørrelse elektroforese teknikk (Comet assay) utført være svært følsom for påvisning av DNA enkelttrådsbrudd (SSBs) , dobbel trådbrudd (DSB sin) og alkali-labile nettsteder (ALSs). Fordi SSB og /eller ALS oppstår mer sannsynlig enn DSB og andre DNA-forandringer som DNA tverrbindinger eller intercalations er alkalisk mircogel elektroforese svært følsom for å kvantifisere lave nivåer av DNA-skade, som gjør det bedre enn andre genotoksisitetstester [25,32] . Til tross for denne høye følsomhet må det nevnes at DNA-reparasjonsmekanismene og deres konsekvens på cellenes levedyktighet, ikke blir av denne fremgangsmåte Vår test observeres en betydelig behandlingstid, henholdsvis doseavhengig økning av DNA-skade i begge HNSCC-cellelinjer. I forhold til den eksponering av sunne slimhinne vevskulturer CAP [20], en opp til fire ganger DNA-fragmentering i kreftceller ble oppdaget. Derfor våre resultater viser at CAP eller dets produkter samhandle med DNA av HNSCC cellelinjer, og er i stand til å indusere dødelig DNA-skade, noe som kan forklare doseavhengig anticancer aktivitet av våre SMD plasma enheten.
For evaluering hvis doseavhengig DNA-skade induserer apoptose og om behandlingen tidsavhengig reduksjon av cellelevedyktigheten er et resultat av en apoptotiske prosess, utførte vi den AnnexinV /PI farging. Etter 60 s behandlingstid og lengre, vår CAP anordning indusert apoptotisk celledød i begge cellelinjer sammenlignet med ubehandlede kontroller. Ikke desto mindre sammenligning av behandlingstiden separat, var det ingen signifikant doseavhengig økning av apoptotiske celler. Bare lenge behandlingstiden tilsvarende høye plasma doser induserte en høy grad av apoptotiske celler i OSC-19 cellelinje som er i overensstemmelse med resultatene av Arndt et al. I den studien som ble gjennomført med den samme plasma-enheten vi brukte (MiniFlatPlaSter®), og derfor hadde den samme plasmafysikk og kjemiske sammensetninger, behandlingstider på 120 s induserer DNA-skade og sterk økning av apoptose i melanomcellelinjer. Ved kortere behandlingstider ble observert nesten ingen apoptotisk celle hastighet, men viste en begynnende alderdom induksjons [16].
Vi vil igjen understreke at en sammenligning av forskjellige forsøk utført med forskjellige anordninger CAP er vanskelig på grunn av forskjellig CAP parametere og utførelser dvs. DBD-teknologi, SMD teknologi, inngangseffekt, spenning, frekvens, bæregass etc. resulterer i relevante forskjeller i produksjonen av sine komponenter. Men forsøk utført med lik plasma anordningen også føre til avvikende resultater når forskjellige cellelinjer (ondartet /ikke-ondartet) er rettet. Likevel en selektiv cytotoksisk effekt på kreftceller vokser frem i sammenheng med resultatene av ulike eksperimenter av CAP på ondartede celler [14,15,18,19]. Mekanismen for denne selektivitet er fortsatt uklart. Men i våre undersøkelser på epitelceller, synes CAP å ha likheter med anticancer mekanismer for stråling, med viser en høy DNA-skade og celledød i høy prolifererende kreftceller, mens lav prolifererende friske mucosal vev synes å være mindre påvirket av den samme behandlingen . Likevel å hevde selektivitet om HNSCC celler og friskt vev, mer sammenlignbare undersøkelser på kreftceller i hode og nakke og slimhinnevevet har som skal utføres [20] .Dette er den første studien, evaluere virkningene av en SMD enhet generert CAP på HNSCC cellelinjer. En doseavhengig høy reduksjon av cellenes levedyktighet ble observert som er delvis forårsaket av apoptose-induksjon. Videre en behandlingstid avhengig høy DNA-fragmentering ble oppdaget, som sannsynligvis er den sentral aktør om kreft celledød. Med disse resultatene fikk vi bekreftet at SMD plasmateknologi er en svært lovende ny tilnærming i hode og nakke kreft behandling.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fil. Rådata
doi:. 10,1371 /journal.pone.0141827.s001 plakater (XLSX)
S2 fil. Statistisk rapport
doi:. 10,1371 /journal.pone.0141827.s002 plakater (docx)
