Abstract
lamellipodium, en viktig struktur for cellemigrasjon, spiller en viktig rolle i invasjonen og metastase av kreftceller. Selv Rac1 anerkjent som en sentral aktør i dannelsen av lamellipodia, er de molekylære mekanismene bak lamellipodial motilitet ikke fullt ut forstått. Optogenetic teknologi gjort oss i stand til å spatiotemporally kontrollere aktiviteten til photoactivatable Rac1 (PA-Rac1) i levende celler. Ved hjelp av dette systemet, avslørte vi rollen som phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) i Rac1 avhengig lamellipodial motilitet i PC-3 prostatakreftceller. Gjennom lokale blå laser bestråling av PA-Rac1-uttrykke celler, ble lamellipodial motilitet reversibelt indusert. Først ble det observert ytre forlengelse av en lamellipodium parallell med underlaget. Den utvidede lamellipodium deretter viste rusket aktivitet i periferien. Spesielt, ble PI (3,4,5) p
3 og WAVE2 lokalisert i den strekker seg lamellipodium i et PI3K-avhengig måte. Vi har bekreftet at inhiberingen av PI3K-aktivitet i stor grad undertrykkes lamellipodial forlengelse, mens den rufser aktiviteten var mindre påvirket. Disse resultatene tyder på at Rac1-indusert lamellipodial motilitet består av to forskjellige aktiviteter, PI3K avhengig utover forlengelse og PI3K uavhengig rusket
Citation. Kato T, Kawai K, Egami Y, Kakehi Y, Araki N (2014 ) Rac1-Dependent Lamellipodial Bevegeligheten i prostatakreft PC-3 celler avslørt av optogenetic Kontroll av Rac1 aktivitet. PLoS ONE 9 (5): e97749. doi: 10,1371 /journal.pone.0097749
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 08.01.2014; Godkjent: 24 april 2014; Publisert: 21 mai 2014
Copyright: © 2014 Kato et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Japan Society for Promotion of Science (JSP) KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) 25861427 til TK; 24659087 og 23390039 til NA; 26860136 og 24890154 til KK; 25860142 til YE; 24390369 til YK. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cell migrasjon spiller en viktig rolle i embryonale organogenesen; sårheling og immunresponser; og patogenesen av en rekke sykdommer, inkludert kreft invasjon og metastase [1], [2]. Derfor er viktig for utvikling av nye terapeutiske strategier for å forebygge tumorinvasjon og metastase en forståelse av den molekylære mekanismene bak cellemigrering. Cellemigrering involverer prosesser for polarisert cellulær adhesjon fremspring og i bevegelsesretningen, celle sammentrekning, demontering av klebebrennpunkter, og tilbaketrekkingen ved periferien av cellens bakre kant [1]. I løpet av tumorcellemigrering som er forbundet med cancer metastase og invasjon, metastatiske celler utviser drastiske endringer i form. Denne deformasjonen er forårsaket av aktin cytoskeletal ombygging, som er regulert av Rho familien GTPases som Cdc42 og Rac1. Rho familie GTPases oppføre seg som molekylære brytere, sykling mellom aktive GTP-bundet skjemaer og inaktive BNP-bundet former. Rho familie GTPases aktiveres av guanin nukleotid utvekslings faktorer (GEFs) og inaktivert av GTPase aktiverende proteiner (hull) [3]. Rac1, et medlem av Rho familien GTPases, fører til produksjon av platelignende fremspring kalt lamellipodia eller membran ruffles, mens Cdc42, et annet medlem av Rho familien, skaper spike-lignende fremspring kalt filopodia [3]. Rac1 er hyperactivated med metastatisk prostata kreft celler [4]. I tillegg er inhibering av Rac1 aktivitet blokker migrering og invasjon av prostatakreftceller [5]. Disse studiene tyder på at Rac1-mediert lamellipodial formasjon spiller en viktig rolle i prostata kreft metastasering.
Hittil uttrykk for Rac1 mutanter som konstitutivt aktiv (CA) Rac1Q61L og den dominerende negative (DN) Rac1T17N har vært mye brukt for å undersøke involvering av Rac1 i lamellipodial formasjon og rusket [6]. Imidlertid må cellefenotyp data innhentet ved hjelp Rac1 mutanter tolkes med forsiktighet. På grunn av virkningene av irreversibel, varig og global ekspresjon i cellene, er det vanskelig å si at fenotypene av celler som uttrykker Rac1 mutanter nøyaktig reflektere proteinets virkning som en molekylær bryter. For å belyse den nøyaktige rollen til tid og rom aktivering av Rac1, Wu et al. [7], [8] har nylig utviklet en fotoaktiverbar Rac1 (PA-Rac1) system ved å fusjonere en lys-oksygen-spenning (LOV) domene og et karboksy-terminalt spiralformet forlengelse (Jα) sekvens til aminoenden av et konstitutivt aktiv Rac1. LOV er et protein lys-bryteren domene av
Avena sativa
phototropin 1. I mørket, den Flavin-bindende LOV domene samhandler med Jα og blokkerer effektor bindingssetet av PA-Rac1 ved å konfigurere til lukket konformasjon. Bestråling med lys på 400-500 nm lys induserer dissosiasjon fra LOV domene og Jα helix, og fører til Rac1 aktivering. Denne foto-indusert aktivering er reversibel. Ved hjelp av dette system, var lokalisert Rac1 aktivering vist seg å være tilstrekkelig til å indusere celle motilitet og bestemme retningen av cellebevegelses [7], [8].
Forholdet mellom Rac1 og fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) i dannelsen av lamellipodia er komplisert fordi PI3K-funksjoner både oppstrøms og nedstrøms for Rac1 [9]. Fosfatidylinositol-3,4,5-trifosfat (PI (3,4,5) p
3) er kjent for å være binde Rac GEFs og deretter akselerere aktin polymerisasjon gjennom Rac1 aktiverings [10]. I tillegg har en positiv feedback loop er rapportert mellom PI (3,4,5) P
3 og Rac for celle polaritet i eukaryote kjemotaksien [11], [12]. Men i regulering av cellefremspring og polaritet, rapporter med hensyn til funksjon av PI3K nedstrøms for Rac1 blir blandet [13], [14]. Dermed forblir den nøyaktige rolle PI3K nedstrøms Rac1 en kontroversiell sak.
For å klargjøre relevansen av PI3K til Rac1 avhengig lamellipodial motilitet, søkte vi PA-Rac1 system til prostata kreft celler. Fotomanipulasjon av PA-Rac1 aktivitet ved hjelp av en blå laser mulig for oss å skille mellom to lamellipodial bevegelige prosesser i levende celler: lamellipodial forlengelse og perifer ruffling. Spesielt, har vi funnet at PI3K hemmere trykt start lamellipodial forlengelse, men hadde liten effekt på perifer ruffling. Denne studien viste at Rac1-avhengige lamellipodial bevegelige prosesser består av to dissosierbare aktiviteter. PI3K avhengig lamellipodial utover forlengelse og PI3K uavhengig perifer rusket
Materialer og metoder
Reagenser og cDNA konstruerer
Føtalt bovint serum (FBS) og RPMI-1640 ble oppnådd fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). The X-tremeGENE HP DNA Transfeksjon Reagens ble kjøpt fra Roche Diagnostic Systems (Basel, Sveits). De andre reagenser ble kjøpt fra Wako Pure Chemicals (Osaka, Japan) eller Nacalai Tesque (Kyoto, Japan), med mindre annet er angitt.
pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L (plasmid # 22027) og pTriEx /mCherry- PA-Rac1 T17N (plasmid # 22029) ble erholdt fra Addgene (Cambridge, MA). Dr. Joel A. Swanson (University of Michigan) vennlig gitt den pmCitrine-AKT-pleckstrin homologi domene (PH) og pmCitrine-Rac1Q61L. De pEGFP-N1-WAVE2 konstruksjoner var generøse gaver av Dr. Tadaomi Takenawa (Kobe universitet).
Cell Kultur og Transfeksjon
PC-tre menneskelige prostata kreft celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) og ble opprettholdt i RPMI-medium inneholdende 10% varme-inaktivert FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellene ble holdt ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator. For live-cell imaging, ble cellene sådd på 25 mm dekk i 35 mm skåler i en tetthet på 2,0 × 10
4 celler /parabol og ble inkubert over natten før transfeksjon.
X-tremeGENE HP DNA transfeksjon Reagens ble anvendt for transfeksjon plasmid i henhold til produsentens instruksjoner. pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L ble lagt til 35 mm retter. I kotransfeksjonssystemet behandlinger, ble 0,01-0,5 mikrogram av de aktuelle plasmider lagt til 35 mm skåler sammen med 0,3 mikrogram av PA-Rac1 plasmid.
medikamentelle behandlinger
For å bestemme rollen til PI3K i Rac1-indusert celle-motilitet, ble cellene behandlet med PI3K-inhibitorer under bestråling. Vi brukte 50 uM LY294002 (Sigma), 100 nM Wortmannin (Sigma) og 1 pM ZSTK474 (Aktive Biochemicals) som PI3K-inhibitorer. LY294002 og Wortmannin, som er pan-PI3K hemmere, er mye brukt som verktøy for å undersøke ulike signaltransduksjon prosesser som involverer PI3K. ZSTK474 hemmer også alle fire PI3K-isoformer, men hemmer ikke PI3K-relaterte kinaser så som mTOR og DNA-avhengig proteinkinase. Disse inhibitorer ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO), lagret ved -20 ° C, og påført cellene ved de angitte sluttkonsentrasjoner. Disse inhibitorer ble vanligvis tilsatt til cellene 30 min før fotoaktivering, men i noen eksperimenter, ble de tilsatt i løpet av fotoaktivering. For kontrollbehandlinger, ble 0,1% DMSO anvendt til cellene.
fotoaktivering og Live-celle Imaging
12-24 timer etter transfeksjon, ble kulturmediet erstattet med Ringer-buffer (RB ) bestående av 155 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl
2, 1 mM MgCl
2, 2 mM Na
2HPO
4, 10 mM glukose, 10 mM HEPES pH 7,2, og 0,5 mg /ml bovint serumalbumin. De 25 mm dekkglass ble plassert i en RB fylte kammer på en 37 ° C termostyrt trinn (Tokai Hit INU-ONI, Shizuoka, Japan). Fotoaktivering av PA-Rac1 og levende celle avbildning ble utført ved anvendelse av en Axio Observer Z1 invertert mikroskop utstyrt med en laserskanningsenhet (LSM700, Zeiss) som tidligere beskrevet [15]. Å photoactivate PA-Rac1, det angitte området av prostata kreft celler uttrykker mCherry-PA-Rac1 ble gjentatte ganger bestrålt med en 5 mW 445 nm laser på 0,2% effekt i de angitte perioder i en fotobleking modus. Levende-celle bildene ble ervervet gjennom en 63x Plan-Apochromat /N. A. 1.4 objektiv hvert 15 sekund ved hjelp av en 10 mW 555 nm laser på 0,5% -2,0% makt for å få mCherry fluorescens og lyse-feltet fase kontrast. For å visualisere PI (3,4,5) P
3 eller WAVE2, ble cellene transfektert med henholdsvis pmCherry-PA-Rac1 og pmCitrine-AKT-PH domain eller pEGFP-WAVE2,. EGFP eller mCitrine fluorescens bilder ble kjøpt bare ved første og siste tidspunkt for å unngå utilsiktet fotoaktivering ved 488 nm laser, da dette eksitasjon bølgelengde litt overlapper med fotoaktivering spekteret [8]. Vi justerte kraften av 488 nm laser så lav som mulig, slik at kjøpet av den første rammen av laser ikke ville påvirke PA-Rac1 aktivitet.
Time-lapse bilder ved hjelp av fase-kontrast og fluorescens mikros var tatt ved 15 sek mellomrom og satt sammen til QuickTime-filmer med Zen 2009 programvare (Carl Zeiss). Kymograph analysene ble utført ved hjelp av MetaMorph bildebehandlingsprogrammer (Molecular Devices). Bildedataene som presenteres her er representative for resultatene fra minst tre uavhengige eksperimenter.
kvantitativ bildeanalyse
For kvantitativ bildeanalyse av lamellipodial utvidelse på grunn av PA-Rac1 fotoaktivering i fravær eller tilstedeværelsen av PI3K-inhibitorer, tok vi målinger av celle området øker ved å subtrahere de områdene av cellene før fotoaktivering fra de etter fotoaktivering ved hjelp av MetaMorph bildebehandling.
for kvantitativ analyse av mCitrine-AKT-PH og EGFP-WAVW2 rekruttering til photoactivated områder, ble fluorescensstyrkene til områdene av interesse målt ved anvendelse av MetaMorph bildebehandling. Fluorescensstyrkene til mCitrine og EGFP etter 5 min av fotoaktivering ble sammenlignet med fluorescensstyrkene i det aktuelle området før fotoaktivering ved hjelp av minst 16 celler.
For å kvantifisere effekten av PI3K hemmere om utvidet lamellipodia og rusket aktivitet i mCitrine-Rac1Q61L-uttrykkende celler, ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i 30 minutter etter tilsetningen av PI3K-inhibitorer (50 uM LY294002, 100 nM Wortmannin, eller 1 uM ZSTK474) eller kjøretøyet bare (0,1% DMSO). Ved hjelp av MetaMorph avbildningssystem, ble de maksimale diametere til de celler som uttrykker Rac1Q61L målt før og etter medikamentbehandlinger for å evaluere effekten av PI3K inhibering på den utvidede lamellipodial. På samme måte ble de perifere folder per celle telles ved hjelp av et fluorescensmikroskop for å evaluere virkningen av PI3K inhibering på rusket aktivitet. Tretti cellene i hver gruppe ble utsatt for kvantitativ bildeanalyse.
Data er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil (SE) for det antall celler som er angitt i teksten. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Wilcoxon t-test funksjon i Excel 2012. Forskjeller mellom de analyserte prøvene ble ansett som signifikant ved p. 0,05
Resultater
Lokal Aktivering av PA-Rac1 reversibelt Induserer Lamellipodial utvidelse og rusket
For å belyse forholdet mellom Rac1 aktivering og lamellipodial dynamikk, introduserte vi mCherry-smeltet PA-Rac1 i PC-3 celler. Etter å ha bekreftet uttrykk for mCherry-PA-Rac1 basert på mCherry signal, bestrålt vi et perifert område av cellene ved hjelp av en 445 nm laser under intervallene av bildeopptak og kjøpte fase kontrast bilder av levende celler hver 15 sek ved konfokal mikroskopi. Typisk, etter 1-4 min av bestråling med 445 nm laser, en tynn plate-lignende fremspring (dvs. en lamellipodium) som strekker seg parallelt til underlaget ble observert ved cellens perifere området som ble bestrålt ved 445 nm laser. Den lamellipodium nådd sin maksimale lengde etter 5-6 min av PA-Rac1 aktivering. På den tiden, som følge av ytre forlengelse, helt utdratt lamellipodium krøllet opp forkanten for å vise en perifer ruffling bevegelse. De rusket bevegelser fortsatte for varigheten av bestrålingen. Etter bestråling opphørt, rufser både lamellipodial forlengelse og det perifere raskt forsvant (Fig. 1 og Movie S1). I vår forrige undersøkelse, rygg rufser ble indusert i RAW 264 makrofager av PA-Rac1 aktivering [15], [16], men rygg rufser var ikke fremtredende i PC-3 celler.
PC-3 celler ble midlertidig transfektert med pTriEx /mCherry-PA-Rac1 og utsatt for lokale fotoaktivering av PA-Rac1 (rektangulært område skissert av blå prikker). Time-lapse bilder av en PC-tre celle uttrykker mCherry-PA-Rac1 ble kjøpt i fotoaktivering ved hjelp av 445-nm laser bestråling. De øvre og midtre panelene viser fase-kontrast og mCherry fluorescens bildene, henholdsvis. Gått tid etter initiering av fotoaktivering er vist på toppen. I bunnfeltet, er konturene av celleformen ved de angitte gått tid trekkes i blått (0 min, original), gul (3,5 min, forlengelse fase), og røde (6 min, ruffling fase). De sorte profiler indikerer membran ruffles. Scale bar, 10 mikrometer.
Når vi bestrålt et annet område av samme celle, en lamellipodial forlengelsen ble generert på den nylig bestrålt område, noe som tyder på at disse fenomenene var avhengig av lokal PA-Rac1 aktivering av lysbestråling (fig. 2). Overekspresjon av en BNP-bundet (dominant negativ) mutant av PA-Rac1 (PA-Rac1 T17N) induserte ikke enten lamellipodial forlengelse eller perifer rusket etter 445-nm laser bestråling (ikke vist). Dette funnet indikerer at de morfologiske endringer indusert av 445-nm laser bestråling er avhengig av GTP-lastet Rac1.
Time-lapse bilder av en PC-tre celle uttrykker mCherry-PA-Rac1 ble ervervet i løpet av PA-Rac1 bilde-manipulering av lokale laser bestråling av forskjellige områder. Valgt fase-kontrast og mCherry fluorescens bildene vises. For det første region 1 ble bestrålt i 10 min. Bestrålingen ble deretter flyttet til regionen 2. Ved 25 min, bestrålingen ble slått av. Valgte tid-lapse bilder av fase-kontrast og mCherry fluorescens vises. Den strekke ut og trekke lamellipodia er skissert i rødt og gult, respektivt. Scale bar, 10 mikrometer.
PA-Rac1-indusert Lamellipodial Extension er avhengig PI3K
For å undersøke effekten av å hemme PI3K aktivitet på PA-Rac1-indusert lamellipodial motilitet, vi brukt LY294002, en syntetisk hemmer av PI3K. Vi først bekreftet at cellene uttrykker PA-Rac1 utstilt lamellipodial forlengelse og rusket på grunn av fotoaktivering. Etter opphør fotoaktivering, la vi 50 mikrometer LY294002 til de samme cellene. Når vi bestråles de samme områder av cellene 30 minutter etter tilsetningen av LY294002, ble lamellipodial forlengelse i stor grad undertrykkes av PI3K inhibitor (fig. 3A og film S2). Vi utførte de samme eksperimentene som benyttet 22 PC-3-celler og kvantitativt sammen området økning på grunn av PA-Rac1 aktivering i hver celle før og etter behandling med LY294002 (Fig. 3B). Den kvantitative bildeanalyse viste at økningen av celleområdet på grunn av PA-Rac1-indusert lamellipodial forlengelsen ble betydelig undertrykt av LY294002 (p. 0,01, n = 22, figur 3B).
(A) PC- 3 celler ble transient transfektert med pTriEx /mCherry-PA-Rac1. Cellene ble utsatt for gjentatt fotoaktivering i fravær (kontroll) eller nærvær av 50 pM LY294002. Den førende kant av forløp lamellipodium er skissert i rødt. Scale bar, 10 mikrometer. (B) Den økede celleareal på grunn av lamellipodial forlengelse ble kvantifisert ved å subtrahere område av cellen før fotoaktivering fra området av cellen 7 min etter starten av PA-Rac1 aktivering. Denne økningen ble bekreftet i 22 PC-3 celler. Dataene plottet viser den økte området på grunn av lamellipodial ekspansjon som ble indusert av PA-Rac1 fotoaktivering i fravær [LY (-)] eller nærvær av LY294002 [LY (+)]. Betydningen av forskjellene mellom LY (-) og LY (+) ble bekreftet med Wilcoxon t-test (høyre). Økningen i lamellipodial område i nærvær av LY294002 var betydelig lavere enn for kontrollceller (p 0,01). (C) Kymographic analyse ble utført ved en to-hodet pil plassert over lamellipodium av et PC-3-celle som uttrykker mCherry-PA-Rac1 før og etter tilsetning av LY294002. Laseren-bestrålt område merkes med en blå firkant. Den hvite linjen skisserer forløp lamellipodium, og den stiplede linje angir den opprinnelige cellen form. Den nederste panelet viser kymograph av en lamellipodium gjennomgår endringer i lengde. Den kymograph demonstrerer forlengelse og tilbaketrekning av en lamellipodium i løpet av PA-Rac1 aktivering (blått 1) og deaktivering (svart 1), henholdsvis. Den grønne pilen angir tillegg av LY294002. Den PI3K inhibitor hadde mindre av en hemmende effekt på lamellipodial forlengelse og rusket (blå 2). Men oppstart av lamellipodial forlengelsen ble drastisk hemmet (svart 2-blå 3). Skala barer, 10 mikrometer.
I tillegg gjennomførte vi kymographic analyse for å fastslå endringer i lengden på lamellipodia. Etter å ha bekreftet PA-Rac1-indusert lamellipodial forlengelse og rusket på grunn av PA-Rac1 fotoaktivering, la vi LY294002 til cellene i PA-Rac1 fotoaktivering. Selv om lengder av lamellipodia ble endret som følge av perifer rusket, den hemmende effekten av LY294002 på lamellipodial forlengelse var liten. Perifer rusket vedvarte for varigheten av bestrålingen. Umiddelbart etter fotoaktivering opphørt, både lamellipodial forlengelse og perifer ruffling forsvant helt. Når vi re-bestrålt samme region, cellene viste ikke lamellipodial forlengelse (fig. 3C). Disse resultatene tyder på at dannelsen av en lamellipodium er mer følsom for PI3K-inhibitorer enn er opprettholdelsen av utvidede lamellipodia og perifere rusket.
Lignende resultater ble oppnådd ved anvendelse av 100 nM Wortmannin eller 1 uM ZSTK474 som PI3K-inhibitorer (fig. S1). Som en kontroll ble den samme PA-Rac1 aktiveringsforsøk utført under anvendelse av celler behandlet med 0,1% DMSO, bilen av inhibitorene. PA-Rac1-indusert lamellipodial formasjonen ble ikke hemmet av DMSO (fig. S2).
PA-Rac1 fotoaktivering kan Lokalt Aktiver PI3K og rekrutt WAVE2
Fordi PA-Rac1-indusert lamellipodial forlengelse var hemmet av PI3K hemmere, forsøkte vi å klargjøre at PA-Rac1 aktivering førte til PI3K aktivering. For å overvåke produksjon av PI (3,4,5) P
3 av PI3K aktivitet, ble PC-3 celler transfektert med pmCitrine-AKT-PH og pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L og observert ved hjelp av en Zeiss LSM700 (Fig . 4). Fluorescensintensiteten av mCitrine-AKT-PH på lamellipodial fremre kant etter 5 min av PA-Rac1photoactivation ble målt ved anvendelse av MetaMorph bildebehandling og ble kvantitativt sammenlignet med den til det samme område før fotoaktivering. Etter 5 min av lokal aktivering av PA-Rac1, fluorescensintensiteten av mCitrine-AKT-PH viste en 125,4% ± 22,3% økning (n = 16) sammenlignet med det som ble målt før fotoaktivering, noe som tyder på at nivåene av PI (3,4 , 5) P
3 i strekker lamellipodia ble sterkt økt av den lokale fotoaktivering av PA-Rac1. I nærvær av LY294002, ingen celler viste en økning i fluorescensintensiteten til mCitrine-AKT-PH etter bestråling. Dette funn tyder på at Rac1 fotoaktivering aktiverer PI3K å frembringe PI (3,4,5) p
3 PI (4,5) P
2 ved membranen i det strekker lamellipodia.
PC -3 celler ble ko-transfektert med pTriEx /mCherry-PA-Rac1 og mCitrine-AKT-PH. Fase-kontrast, mCherry-PA-Rac1 (rød fluorescens), og mCitrine-AKT-PH (gul fluorescens) Bildene ble ervervet før og etter PA-Rac1 fotoaktivering. PA-Rac1 fotoaktivering ble gjentatt i den samme celle region i fravær (kontroll) eller nærvær av 50 pM LY294002. Nivåene av PI (3,4,5) P
3 ble økt i å utvide lamellipodium ved fotoaktivering (pilspisser). I nærvær av LY294002, PI (3,4,5) P
3 ble ikke økt i regionen der PA-Rac1 var foto-aktivert. Den blå-prikket firkanten viser fotoaktivering området. Den strekker seg lamellipodium er skissert i rødt. Skala barer, 10 mikrometer.
Videre undersøkte vi dynamikken i WAVE2 under lamellipodia genererende prosess, fordi WAVE2 spiller en stor rolle i Rac1-indusert aktin omorganisering i forbindelse med PI (3,4 , 5) p
3 [17] – [19]. Etter 5 minutters bestråling med 445 nm lys, EGFP-WAVE2 lokalisert som en stiplet linje ved den fremre kant av forløp lamellipodial (fig. 5). Fluorescensintensiteten av EGFP-WAVE2 etter fotoaktivering viste en 315,1% ± 54,4% økning (n = 17) ved den fremre kant av forløp lamellipodia. Etter tilsetning av LY294002, ble hverken EGFP-WAVE2 rekruttering eller lamellipodial forlengelse indusert av PA-Rac1photoactivation (fig. 5). Disse funnene tyder på at WAVE2 blir rekruttert av PI (3,4,5) P
3 og bidrar til Rac1 avhengig lamellipodial forlengelse gjennom aktin polymerisasjon.
PC-3 celler ble ko-transfektert med pTriEx /mCherry-PA-Rac1 og pEGFP-N1-WAVE2. Fase-kontrast, mCherry-PA-Rac1 (rød fluorescens), og EGFP-WAVE2 (grønn fluorescens) Bildene ble ervervet før og etter PA-Rac1 fotoaktivering. PA-Rac1 fotoaktivering ble gjentatt i den samme celle region i fravær (kontroll) eller nærvær av 50 pM LY294002. De gule pilene indikerer at WAVE2 ble rekruttert til forkanten av å utvide lamellipodium. I nærvær av LY294002, ble WAVE2 ikke rekruttert til periferien av cellene hvor PA-Rac1 ble photoactivated. Den blå-prikket firkanten viser fotoaktivering området. Scale bar, 10 mikrometer.
PI3K hemmere påvirker ikke Utvidet lamellipodia men gjør Forbedre Peripheral rusket
For å klargjøre effekten av PI3K hemming på vedlikehold av utvidet lamellipodia søkte vi LY294002 til PC-3 celler som uttrykker mCitrine-Rac1Q61L, en konstitutivt aktiv Rac1 mutant. De mCitrine-Rac1Q61L-uttrykker cellene hadde godt spredt lamellipodia rundt hele sin omkrets. Når vi lagt 50 M LY294002 til disse cellene, den utvidede lamellipodia krympet bare litt, selv etter 30 min. Overraskende, perifer rusket aktivitet ble betydelig forbedret med PI3K-inhibering i Rac1Q61L-uttrykkende celler (fig. 6 og film S3). Kvantitativ analyse av endringer i maksimale cellediameter indikerte at denne faktor ikke var signifikant påvirket av en hvilken som helst PI3K-inhibitor, mens antall perifere folder ble sterkt øket etter 30 min PI3K inhibering (tabell 1).
PC- 3 celler ble transfektert med pmCitrine-Rac1Q61L. Time-lapse bilder av fase-kontrast og mCitrine-Rac1Q61L fluorescens ble tatt før (venstre) og etter (høyre) tilsetting av LY294002. Kymographs ble opprettet for å vise de forandringer i lengden av et lamellipodium ved posisjonen for de to hoder linje. Den mCitrine-Rac1Q61L-uttrykke celle hadde et utvidet lamellipodium hele veien rundt. Etter tilsetningen av 50 uM LY294002, hadde den utvidede lamellipodium krympet bare litt, men den perifere rusket ble erklært. De kymographs viser dynamiske endringer i lengde på grunn av forbedret rusket etter tilsetning av LY294002. Skala barer, 10 mikrometer
Diskusjoner
lamellipodia kan klassifiseres i tre typer:. Den tynne forkant av en celle som strekker membranen langs underlaget, det perifere folder som dannes av den oppadrettede bøyning av den fremre kant, og de vertikale rygg folder som vises bak den fremre kant på den dorsale overflaten av cellen [9], [20]. Imidlertid har de ulike mekanismene som regulerer disse lamellipodial bevegelige prosessene ikke avklart. PC-3 celler og andre prostatakreftceller ikke viser rygg rusket, som er observert i RAW264 makrofager etter PA-Rac1 aktivering [15]. Dette avviket er mest sannsynlig på grunn av forskjellene mellom disse celletypene. PC-3 celler viste bemerkelsesverdig lamellipodial forlengelse og perifer rusket på PA-Rac1 aktivering. Denne studien ble gjennomført for å karakterisere lamellipodial dynamikk og deres regulering i PC-3 kreftceller, som lamellipodial motilitet spiller en sentral rolle i invasjonen og metastasering av prostata kreft celler.
Tidligere rapporter har konstatert at hemming av PI3K-aktivitet hindrer all blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) -indusert lamellipodial bevegelige prosesser i fibroblaster, inkludert forlengelse, perifer rusket, og dorsal krusning formasjon [19]. Fordi PI3K er involvert i den tidlige fasen av signaloverføring fra PDGF-reseptoren i fibroblaster [21], ble alle reaksjoner på PDGF bli mottatt av PI3K inhibering. Imidlertid er PI3K aktivitet velig unødvendig for M-CSF-indusert rusket og EGF-indusert rygg rusket i A431 celler [22], [23]. Dermed signaliserer fra forskjellige reseptorer fører til buste formasjonen i ulike celletyper. I våre eksperimenter ved hjelp av optogenetic kontroll av Rac1 aktivitet, vi er direkte resultat Rac1-mediert lamellipodial aktivitet uten oppstrøms signalering fra reseptorer. På grunn involvering av PI3K i begynnelsen av signaloverføring fra forskjellige typer av reseptorer kan derfor bli ignorert, kan vi klargjøre rollen av PI3K i lamellipodial motilitet nedstrøms Rac1. Ved hjelp av levende celle bildebehandling kombinert med PA-Rac1 fotomanipulasjon, kunne vi tydelig at den lamellipodium første strekker seg utover parallelt med underlaget, og at den fullt utvidede lamellipodium viser deretter rusket aktivitet ved curling opp i forkant. Videre fant vi at lamellipodial forlengelse indusert av PA-Rac1 aktivisering var sterkt opprørt av PI3K hemmere mens perifere rusket ikke ble hemmet. Disse resultatene tyder på at to typer lamellipodial motilitet, forlengelse og rufser, er forskjellig regulert av PI3K-avhengige og PI3K uavhengig signalveier.
Wiskott-Aldrich syndrom protein (WASP) og WASP-familien verprolin-homolog protein (WAVE) familie proteiner er aktivatorer av Arp2 /3-avhengige polymerisasjon [17]. WAVE familie proteiner er forbundet med lamellipodial formasjonen gjennom Rac1 signalveien. For å hindre uordnede aktin polymerisasjon, WAVE familie proteiner eksistere som heteropentameric protein komplekser som hindrer sine egne aktive nettsteder. Selv om bølgene er funksjonelt aktiveres av GTP-bundet Rac1 når aktin polymerisasjon initieres, kan bølgene ikke binde direkte til GTP-bundet Rac1. I stedet IRSp53 (insulin-reseptor-tyrosin-kinase-substrat p53) virker som en linker molekyl å koble Rac1 og WAVE komplekset [18]. GTP-bundet Rac1 induserer en allosterisk endring i WAVE kompleks som eksponerer sin aktive nettstedet; WAVE2 aktiverer deretter den Arp2 /3-komplekset, som blir en kjerne for aktin polymeriseringen ved den fremre kant av lamellipodium [24] -. [26]
I våre PA-Rac1-aktiveringsforsøk, WAVE2 ble lokalisert til forkantene for å utvide lamellipodia. Imidlertid ble det observert verken WAVE2 rekruttering eller lamellipodial forlengelse når PI3K aktivitet ble hemmet. Disse resultatene tyder på at PI (3,4,5) p
3 kreves for WAVE2 rekruttering og for lamellipodial forlengelse. Fordi WAVE2 har en PI (3,4,5) P
3-binding sekvens [19], PI (3,4,5) P
3 kan rekruttere WAVE2 til forkanten. Suetsugu et al. [18] rapporterte at aktiviteten av WAVE2 komplekset ble optimalisert ved IRSp53 i assosiasjon med aktivert Rac1 og PI (3,4,5) p
3. Videre er de samtidige binding av GTP-bundet Rac og sure fosfolipider slik som PI (3,4,5) P
3 til WAVE2 er nødvendig for effektiv rekruttering og aktivering av WAVE2 [17]. Disse tidligere rapporter styrker vår påstand om at hemming av lamellipodial forlengelse av PI3K hemmere resultater fra endringen av WAVE2 rekruttering.
I denne studien, aktivering av PA-Rac1 indusert produksjon av PI (3,4,5 ) P
3 og rekruttering av WAVE2 når lamellipodial forlengelsen ble igangsatt. Videre PI3K hemmere hindret rekruttering av WAVE2 og PI (3,4,5) P
3 og undertrykte lamellipodial forlengelse. Disse funnene tyder på at PI3K spiller en avgjørende rolle i å initiere lamellipodial forlengelse. Videre anvendes vi konstitutivt aktive Rac1Q61L-uttrykkende celler for å observere responsen av den utvidede lamellipodia til hemming av PI3K-aktivitet. I celler som uttrykker Rac1Q61L, den utvidede lamellipodia var relativt motstandsdyktig mot PI3K hemmere.
