Abstract
VEGF-rettet behandling øker både den progresjonsfrie (PFS) og total overlevelse (OS) av pasienter med spredning nyrecellekreft (mRCC). Identifisering av molekylære fenotyper av RCC kan forbedre risiko stratifisering og prediksjon av det kliniske sykdomsforløpet. Vi undersøkte om gen-spesifikk DNA hypermethylation kan forutsi PFS og OS blant pasienter som gjennomgår anti-VEGF-basert terapi. Primær tumorvev fra 18 pasienter som fikk målrettet terapi ble undersøkt i ettertid ved hjelp av kvantitativ metylering spesifikk PCR-analyse av
CST6
,
LAD1
, hsa-
MIR
-124 til 3, og hsa-
speil
9-1 CpG øyer. PFS og OS ble analysert for førstelinjeledere og sekvensielle antiangiogenic terapi ved hjelp av loggen rang statistikk. Sensitivitet og spesifisitet ble bestemt for å forutsi førstelinjebehandling svikt. Hypermethylation av
CST6 Hotell og
LAD1
var assosiert med både en forkortet PFS (log rank p = 0,009 og p = 0,004) og OS (p = 0,011 og p = 0,043). Median PFS observert for de høye og lave metylering grupper av
CST6 Hotell og
LAD1
var 2,0 vs.11.4 måneder.
LAD1
metylering hadde en spesifisitet på 1,0 (95% KI 0,65 til 1,0) og en sensitivitet på 0,73 (95% KI 0,43 til 0,90) for prediksjon av førstelinjebehandling.
CST6 Hotell og
LAD1
metylering er kandidat epigenetiske biomarkører viser enestående samarbeid med PFS og OS samt spesifisitet for prediksjon av respons på behandlingen. DNA metylering markører bør vurderes for den potensielle evaluering av større pasient kohorter i fremtidige studier
Citation. Peters jeg, Dubrowinskaja N, Abbas M, Seidel C, Kogosov M, Scherer R, et al. (2014) DNA-metylering Biomarkører Tippe progresjonsfri og total overlevelse av metastatisk nyrecellekreft (mRCC) Behandlet med antiangiogen terapi. PLoS ONE 9 (3): e91440. doi: 10,1371 /journal.pone.0091440
Redaktør: Zhengdong Zhang, Nanjing Medical University, Kina
mottatt: 07.10.2013; Godkjent: 11 februar 2014; Publisert: 14 mars 2014
Copyright: © 2014 Peters et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
nyrecellekreft (RCC) er en av de. topp ti årsaker til kreft dødsfall i industrilandene [1]. Selv om de siste forbedringene i målrettet behandling har resultert i forlenget overlevelse av pasienter med metastatisk RCC (mRCC), er det samlede resultatet fortsatt dårlig [2], [3].
På grunn av forskjellige tilgjengelige forbindelser og et økende antall nye agenter som påvirker molekylært målrettede strukturer, slik som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og mammalian target of rapamycin (mTOR) signal- [4] en optimal sekvens av målrettet terapi kan eksistere for pasienter, og potensielt øke overlevelsen med mRCC behandling. Selv prognostiske modeller, som for eksempel MSKCC (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) og Heng scoring systemer, har blitt rapportert å være uavhengige prediktorer for klinisk utfall, [5], [6] diskriminering mellom utfall er fortsatt begrenset. Tumor-spesifikke biologisk baserte parametre har blitt foreslått for å forbedre disse problemene [7].
De fleste RCC har klart celle (ccRCC) histologi og viser funksjonell inaktivering av von Hippel-Lindau (
VHL
) genet på grunn av mutasjoner eller epigenetisk stanse i omtrent 80% av tumorer [8], [9]. Men den progresjonsfrie (PFS) og total overlevelse (OS) av pasientene med mRCC er uavhengig av tap av
VHL
funksjon [10]. I kontrast, blodbasert analyse av enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) potensielt påvirker sunitinib målgener og ligander identifisert to polymorfismer i
VEGFR3 Hotell som er forbundet med PFS, men ikke OS, pasienter som gjennomgår målrettet terapi [11 ]. Måling av serum karboanhydrase IX (CA9) protein nivåer i metastatisk ccRCC pasienter viste signifikant redusert OS blant pasienter med høyere CA9 serumkonsentrasjoner [12]. En person fordel av vevs- eller blodbaserte målinger for pasienter som gjennomgår behandling er merkbar, men nøyaktigheten, følsomhet og spesifisitet av disse metodene har ennå ikke blitt rapportert eller validert [13].
Selv om store pasient kohorter har vært utsatt for exom-wide mutasjonsanalyser, bare et begrenset antall andre enn gener
VHL Hotell og polybromo 1 (
PBRM1
) har blitt identifisert til å ha mutasjoner i RCC, og de fleste med lav frekvens [14]. Derfor er det begrensede antall av ofte muterte gener reduserer sannsynligheten for å identifisere mutasjoner baserte prediktorene med passende sensitivitet og spesifisitet. DNA-metylering av CpG-øyer (CGIer) i et betydelig antall kontroll- eller tumorsuppressorgener er blitt identifisert som en funksjonell surrogat av mutasjoner og har blitt rapportert å være en hyppig hendelse i RCC [15]. Videre funksjonell tap av
VHL
har blitt funnet å assosiere med utvidet utseendet epigenetiske forandringer [16], og alle de andre hyppige mutasjoner er knyttet til endret kromatin /histone stabilisering eller modifikasjon, mekanismer knyttet til CGI metylering og genuttrykk [17]. Derfor er hyppig påvisning av epigenetiske forandringer i RCC skiller RCC tumorbiologi og gir kandidater for nye diagnostiske, prognostiske, eller prediktive markører [18]. CGI metylering i flere gener har blitt identifisert som kandidat kunngjør uavhengig fra clinicopathological parametre [19] – [21]. Men epigenetiske biomarkører forutsi det kliniske forløpet av MRCC pasienter utsatt for målrettet terapi, har, til det beste av vår kunnskap, ikke blitt rapportert.
Vi antok at CGI metylering er knyttet til respons på behandling, samt som overlevelse av MRCC pasienter som gjennomgår antiangiogen terapi. Vi undersøkte fire kandidatgener, tre av dem, cystatin E /M (
CST6
) og mikro RNA gener
MIR-9-1 Hotell og
MIR-124-3,
ble identifisert nylig med tumor-spesifikke CGI hypermethylation og en mulig sammenheng med prognosen for RCC pasienter [19], [21], [22]. Den Ladinin 1 (
LAD1
) genet ble nylig identifisert av vår gruppe som en ny kandidat metylering markør i RCC viser univariate forbindelse med uønskede clinicopathological parametere som svulst klasse, lymfeknutemetastase, status for tydelig metastaser og avansert sykdom (upubliserte data).
LAD1
koder for et forankringsfilament protein, en komponent av basalmembran som sannsynligvis bidrar til stabiliteten av det epiteliale-mesenkymale interaksjon [23].
Denne studien undersøkte om en DNA-metylering mark kan forutsi responsen av målrettet antiangiogen terapi av MRCC pasienter og beskriver identifisering av to DNA metylering markører i
CST6 Hotell og
LAD1
CGIer som kandidat epigenetiske prediktorer for PFS og OS av MRCC pasienter som gjennomgår målrettet terapi.
Materialer og metoder
etikk Erklæring
Informert samtykke ble innhentet fra hver pasient, og de lokale etikk komité (Ethic komiteen; Prof. HD Tröger, Hannover Medical School, Carl-Neuberg-Str. 1, Hannover, Tyskland; Study_No: 1213-2011) er spesielt godkjent denne studien. Pasienter avtalt i en skriftlig form for utnyttelse av vevsprøve for grunnforskning. En skriftlig redegjørelse for vår etikk komité for denne studien ble innhentet.
Pasient Kjennetegn og behandlingsregimer
Clinicopathological data, tilsvarende vev, og oppfølgingsdata inkludert PFS og OS for pasienter med mRCC som ble behandlet med førstelinje VEGF-rettet behandling ble samlet mellom november 2005 og oktober 2011 i klinikk for Hematologi og Institutt for Urologi og urologic onkologi ved Hannover Medical School (tabell 1). Den MSKCC scorer eller ECOG funksjonsstatus var ikke tilgjengelig. Pasientene fikk følgende behandlingsregimer i førstelinjen: sunitinib (n = 12, 67%), sorafenib (n = 4, 22%), axitinib (n = 1, 5,5%), og bevacizumab (n = 1, 5,5%).
PFS ble definert som tiden fra begynnelsen av den første dagen av systemisk behandling til påvisning av en progressiv hendelse i henhold til RECIST 1.1 kriterier på en datamaskin tomografi (CT) skanner [ ,,,0],24]. OS ble definert som perioden fra den første dagen av systemisk behandling inntil pasienten død eller sensurert i siste oppfølging. Endestasjonen «ikke evalueres» i Tabell 1 beskriver pasienter med PFS 2 måneder på grunn av en tidlig seponering på grunn av toksisitet eller tidlig død før den første anbefalte CT scan etter behandling ble igangsatt. Den første TNM-klassifikasjon av primære svulster ble evaluert i henhold til Union for International Cancer Kontroll 2002 klassifiseringen [25]. Oppfølging av pasientene inkludert opp til tre sekvens endringer i terapiregime.
Vilkårene’prognostic` og’predictivè ble brukt i henhold til definisjonen av National Cancer Institute [26].
vevsprøver, isolasjon og Bisulfite Konvertering av tumor DNA
Uavhengig kontroll av histopatologi, tumorcelleinnholdet av rutinemessige patologiske prøver, og utvalget av vev områder for vev utvinning ble bestemt av patologen. Deretter ble sylinderne 1,5 mm i lengde og 2 mm i høyde stemplet ut fra de formalinfikserte og parafininnstøpte (FFPE) vevsblokker ved hjelp av en 18 Charrière kjerne stempel og utsatt for DNA-isolasjon. Genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av automatiserte Magna Pure LC 2.0 system og Magna Pure LC DNA kit II – vev (Roche Diagnostics Deutschland, Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). Kvaliteten av ekstraherte DNA ble vurdert ved hjelp av spektrofotometri, gelelektroforese, og kvantitativ PCR som karakteriseres utbyttet, renhet og grad av nedbrytning av isolert DNA. Bisulfitt omdannelse av DNA ble utført ved anvendelse av EZ DNA Metylering-Gold Kit (Zymo Research Corporation, Irvine, CA, USA) og 1 ug av isolert DNA. Fullt metylert og omdannes DNA, så vel som unmethylated bisulfitt-konvertert DNA kontroller, ble anvendt som tidligere rapportert [21].
Kvantitativ Metylering-spesifikk Sanntids-PCR-analyse
Kvantitativ sanntid fluorimetrisk 5 «eksonuklease PCR (qMSP) analyser ble utført for å kvantifisere CGI metylering nivåer av
CST6, LAD1, etter HSA
-miR-124-3, etter og hsa-
speil 9-1
. Metylering analyse av HSA
-miR-124-3
ble utført som beskrevet tidligere [21]. qMSP systemer ble etablert for
CST6, LAD1, etter og hsa-
MIR-9-1
hjelp Beacon Designer programvare (PREMIER Biosoft, Palo Alto CA, USA). Basen stillinger undersøkte CGI nettsteder for
CST6, LAD1, etter HSA
-miR-124-3, etter og hsa-
MIR-9-1
er presentert i tabell 2. Base stillinger refererer til USCS Genome Browser [27]. De qMSP systemer ble karakterisert som beskrevet for HSA
-miR-124-3
metylering målinger [21]. Dupliserer real-time PCR ble utført på en ABI 7900HT (Life Technologies, Foster City, USA) i 384-brønns plater som beskrevet tidligere [21]. Forskere ble blindet av histopatologiske og klinisk status av prøvene. Relative metylering nivåer ble beregnet som en analog av den ΔΔCt fremgangsmåten ved å normalisere forskjellen i CGI metylering bestemt ved sporing i sanntid og uavhengig intern kontrollmålinger til den tilsvarende forskjellen i de fullt metylerte DNA-kontrollprøvene, som beskrevet tidligere [21], [28 ].
Statistical Analysis of Survival
Kaplan-Meier plott ble brukt til å presentere relativ overlevelse i PFS og OS analyser etter dikotomisering av svulster i høye og lave metylering fenotyper. Median overlevelse og tilsvarende 95% konfidensintervall (CIS) ble rapportert. Forskjeller i PFS og OS ble testet ved hjelp av log-rang statistikk og median overlevelse forholdstall beregnet.
P
-verdier 0,05 ble betraktet som signifikant. Å tillate en sammenligning med litteratur, ble univariate Cox regresjonsanalyser utført for å estimere hazard ratio (HRS). For å beregne sensitivitet og spesifisitet for behandling fiasko, ble en grenseverdi på 6 måneder PFS brukes for dikotomisering [29] inn terapi respondere og non-respondere.
Varmen kart og mottaker opererer karakteristiske kurver ble konstruert ved hjelp av heatmap2 og ROCR funksjon i R-pakken (versjon 2.11.0.1) med en standard clustering algoritmen og gplot pakke [30].
Resultater
bimodal fordeling av Relative metylering Nivåer i CGIer av kandidat gener
Kvantitativ metylering analyser av CGIer av
CST6
,
LAD1
, hsa-
MIR-124-3, etter og hsa-
MIR -9 til 1
avslørte tilstedeværelsen av en bimodal fordeling av relative metylering verdier (Figur 1A og D; data ikke vist for hsa-
MIR-124-3 Hotell og hsa-
MIR-9 -1
). Bruk av en enkelt verdi cutoff på 0,02% (svarende til -8,75 i LN-skala som brukes for tetthets plott Kjerne i figur 1A og D) for relativ metylering av høy og lav metylerte epigenotypes var jevnt utmerker for alle de analyserte genene og anvendt for konsekvent dikotomisering i overlevelse analyser.
A og D. istribution av de relative metylering verdier av
CST6 product: (A) og
LAD1 product: (D) i MRCC-pasienter. En grenseverdi er presentert for dikotomisering. B og E. Kaplan-Meier plott av progresjonsfri overlevelse av MRCC opplevde dikotomisert ved høy og lav metylering av
CST6 product: (B) og
LAD1 product: (E). C og F Kaplan-Meier plott av total overlevelse av MRCC opplevde dikotomisert ved høy og lav metylering av
CST6 product: (C) og
LAD1 product: (F).
analyse av PFS
Kaplan-Meier og log rank analyse av PFS i høye og lave denaturert svulster viser en signifikant forskjell både for
CST6 Hotell og
LAD1
. Høy metylering var forbundet med en median overlevelse på 2,0 måneder, sammenlignet med 11,4 måneder hos pasienter med lav metylering (p = 0,009 og p = 0,004, tabell 3A). I kontrast, verken
MIR-124-3
eller
MIR-9-1
viste en statistisk sammenheng med PFS (p = 0,339 og p = 0,319).
analyse av OS
Kaplan-Meier analyse og logge rang statistikk viste at høy metylering av
CST6 Hotell og
LAD1
var assosiert med redusert OS. En median OS på 22,9 og 3,4 måneder (p = 0,011, Tabell 3B) ble oppnådd for lav og høy
CST6
metylering, henholdsvis. En median OS på 16,4 og 3,4 måneder (p = 0,043, Tabell 3B) ble oppnådd for lav og høy
LAD1
metylering.
Analyse av sensitivitet og spesifisitet
For å finne ut sensitivitet og spesifisitet av
CST6 Hotell og
LAD1
metylering analyser for å forutsi førstelinjebehandling failure, ble metylering verdier dikotomisert i lave og høye metylering fenotyper bruker samme grenseverdi på 0,02% som er spesifisert over. PFS verdier ble dikotomisert ved hjelp av en cutoff på 6 måneder, en parameter som tidligere ble foreslått for å bedre skille mellom terapi respondere og non-respondere [29]. Høy metylering av
LAD1 Hotell og
CST6
var karakteristisk for mislykket behandling (Figur 2A). I tilfelle av
LAD1, etter alle åtte pasienter med høyt metylering var non-respondere. Spesifisiteten var 1,0 (95% KI 0,65 til 1,0) og følsomhet 0,73 (95% KI 0,43 til 0,90) for påvisning av terapisvikt ved hjelp av
LAD1
metylering (tabell 4), mens spesifisiteten var 0,86 (95 % KI 0,49 til 0,97) og følsomhet 0,82 (95% KI 0,52 til 0,95) for
CST6
metylering (tabell 4).
A. Heat kartet normalisert i forhold metylering verdier (naturlig logaritme) oppdaget i
LAD1
,
CST6
,
MIR-9-1, etter og
MIR-124-3
CGIer for hver pasient. Lav til høy metylering verdiene er kodet som fiolett (lav) til rødt (høy) fargetoner. De stiplede og heltrukne linjer beskrive median og individuelle metylering verdier, henholdsvis. Pasient tallene gitt på venstre side tilsvarer nummereringen presentert i tabell 1. Therapy respons (0) og terapisvikt (1) er angitt for hver enkelt pasient på høyre side. Spesielt, alle pasientene (nr. 1-8) som oppviser høy metylering av
LAD1
og 9 av 10 pasienter (nr. 1-9, 14) som oppviser høy metylering (rødfarget) på
CST6
var en del av den ikke-responder (1) gruppe. B. Mottakeren operasjonelle egenskaper (ROC) kurver illustrert diskriminering av metylering målinger og arealet under kurven (AUC) viser at selv med vår lille pasient kohort, et robust resultat for nøyaktigheten av begge metylering markører (AUC
CST6
= 0,88 og kan påvises AUC
LAD1
= 0,90). Følsomheten (sann positiv rate) er plottet mot 1-spesifisitet (falsk positiv rate).
Diskusjoner
De kliniske resultatene av pasienter med mRCC har bedret seg siden VEGF- målrettet terapi og mTOR inhibitorer ble gjort tilgjengelige [2], [3]. Imidlertid kan lagdeling av pasienter som bruker biomarkører gi en bedre forståelse av resistens og identifisere en optimalisert pasientspesifikk sekvens av anti-angiogene terapier, forbedre overlevelse individuell [7]. Videre kan bivirkningene av anti-VEGF-baserte regimer, slik som diaré, utslett, hånd-fot syndrom, hypertensjon, og asteni, som ofte alvorlig svekke livskvaliteten under behandlingen bli minimalisert.
Vi har funnet at DNA hypermethylation av
CST6 Hotell og
LAD1
i primær RCC svulstvev er signifikant assosiert med PFS av pasientene som fikk anti-VEGF-baserte medisiner som førstelinjebehandling og også av operativsystemet pasienter sekvensielt behandlet med anti-VEGF målrettet narkotika og mTOR-hemmere i andre- og tredjelinje behandling. Våre metylering markører spådd terapi svikt med høy spesifisitet og god følsomhet.
Så langt vi kjenner til, er disse funnene er enestående på flere måter, som tidligere studier ikke var vevsbasert og enten ga ingen signifikant sammenheng med terapi svar [12] eller rapportert bare begrenset statistisk styrke [11]. Mens serummålinger av CA9 nivåer viste ingen signifikante forskjeller mellom terapi respondere og non-respondere [12] analyse av genetiske varianter, muligens i samspill med sunitinib vei, identifisert to
VEGFR3
SNPs å være assosiert med terapi respons og PFS, men ikke med OS [11]. Denne studien viser at enkelte biologiske variabler kan påvirke respons på behandlingen. På den annen side, vår metylering baserte kandidat prediktorene gå utover måling av genet varianter i flere viktige aspekter. Først potensialet
LAD1 Hotell og
CST6
DNA metylering basert markører ble målt i tumorceller, som direkte utviser tumor egenskaper som kan representere førere av motstand og biologisk aggressivitet. Hypermethylation av
CST6 Hotell og
LAD1
utstilt prognostisk og prediktiv verdi i vår studie, og er en antatt biomarkør for pasientens valg. Basert på kliniske resultater i vår studie, vil ulike terapeutiske strategier for hypermethylated svulster være nødvendig. Etter nettverket av epigenetiske forandringer og biologiske atferd har vært untangled, kan ytterligere nye mål for terapeutiske intervensjoner bli identifisert.
Enten forskjellen i epigenetisk vevs- og genetiske blodbaserte målinger står for både epigenetiske markører er knyttet til PFS og OS av MRCC pasienter er et interessant spørsmål. Genvarianter ble bare forbundet med PFS, et surrogat endepunkt for overlevelse målinger i mRCC som har mulige begrensninger [31]. Så langt vi kjenner til, en vev-basert molekylær markør har ikke tidligere vært forbundet med OS. Fra et statistisk synspunkt, vår epigenetisk studie levert høyere HRS i overlevelse analyser og gitt en mer balansert inndeling i respondere og non-respondere enn studiet av Garcia-Donas et al. [11], og derfor sammen bidra til en høyere makt av denne studien. Tatt i betraktning at en mye mindre pasient kohort var tilgjengelig for våre målinger, våre funn tyder på at en sterk effekt har muligens blitt identifisert. Videre, med tanke på at et økende antall agenter kan brukes til behandling av mRCC, kunne fremtidig identifisering av en optimal behandling diett forenkles ved epigenetiske markører som tillater god separasjon av pasienter i respondere og non-respondere.
Interessant, metylering nivåer av alle kandidat markører tydelig henfalt til lett skjelnes høye og lave metylering grupper, noe som eliminerer behovet for å vilkårlig definere cutoff poeng for dikotomisering. Derfor nesten ingen overlapping eksisterte mellom respondere og non-respondere i denne studien. Dermed vår
LAD1 Hotell og
CST6
metylering analyser ga høye spesifisiteten på 1,0 og 0,86 for påvisning av terapisvikt, noe som understreker den mulige relevansen av disse markørene i mRCC.
Dette studien kan også svare på om DNA metylering baserte prognosticators representerer aktuelle prediktorer for sykdom. Begge
MIR-9-1 Hotell og
MIR-124-3 product: [21], [22] sviktet som predikator fordi ingen sammenheng ble funnet med PFS eller OS for pasienter som gjennomgår behandling. Dette funnet kan forklares med det faktum at MRCC pasienter generelt står overfor en dårlig prognose, og mange svulster utviser høy metylering for
Mir
gener som forventet for kandidat prognosticators.
uavhengighet fra kliniske eller laboratorieparametre kunne ikke fastslås i denne studien fordi de lave prøvenumrene forhindret multivariat analyse. Tilsvarende kan de relevante spørsmål hvorvidt markører kombineres for å optimalisere den prediktive kraft eller om markører utvise overflødig informasjon kan bare besvares i fremtidige studier ved bruk av forstørrede studiekohorter.
Men HRS observert for kliniske parametre for pasienten utfallet var lavere med begrenset nøyaktighet /diskriminerende makt. Våre resultater kreve bekreftelse på en selvstendig valideringsstudie blant annet hensynet til kliniske scoring systemer som confoundere.
I konklusjonen, vår studie identifisert
LAD1 Hotell og
CST6
CGI metylering som to epigenetiske markører som er forbundet med PFS og OS av MRCC pasienter som gjennomgår antiangiogen terapi. Vi har også vist at potensialet for å forbedre den molekylære forutsigelse av respons overfor terapi. Våre resultater ytterligere understreke den oppfatningen at epigenetiske endrede RCC finnes, og nye konkrete strategier kan være nødvendig å behandle pasienter med slike svulster.
Takk
Vi takker Margrit Hepke og Christel Reese for teknisk assistanse.
