Abstract
Bakgrunn
multiresistens (MDR) er en av de viktigste grunnene kjemoterapi-baserte behandlinger mislykkes. Hypoksi er vanligvis forbundet med svulst chemoresistance. Imidlertid korrelasjonen mellom heterodimer hypoksi-induserbar faktor-1 (HIF-1) og multimedikamentresistens (MDR1) gen /transportøren P-glykoprotein (P-gp) er fortsatt uklar. Denne studien tar sikte på å utforske de molekylære mekanismene for reversering av tykktarmskreft MDR ved å fokusere på målet genet HIF-1α.
Metoder
En kjemoterapeutisk sensitivitetsanalyse ble brukt til å observere effektiviteten av MDR reversering i LoVo flercellede kuler (MCS). Den apoptotiske nivået indusert av forskjellige medikamenter ble undersøkt ved hjelp av strømningscytometri (FCM). Binding av HIF-1α til MDR1 genpromotoren ble evaluert ved Chromatin immunoutfelling (chip). Forholdet mellom HIF-1α /P-gp uttrykk og følsomhet for kjemoterapi ble analysert.
Resultater
følsomhet LoVo MCS til alle fire kjemoterapi narkotika ble redusert i varierende grad i henhold hypoksiske forhold. Etter stanse den HIF-1α genet, ble følsomheten LoVo MCS til alle fire kjemoterapi narkotika restaurert. Den apoptotiske nivåer som alle stoffene induserte alle var redusert i varierende grad i hypoksisk gruppe. Etter stanse HIF-1α, apoptose nivået indusert av alle fire kjemoterapi narkotika økt. Ekspresjonen av HIF-1α og P-gp ble betydelig forbedret i LoVo MCS etter behandling med hypoksi. Inhibering av HIF-1α betydelig redusert ekspresjon av MDR1 /P-gp mRNA eller protein i både LoVo LoVo monolagene og MCS. Brikken analysen viste at HIF-1α ble bundet til MDR1 genet promoter. Avanserte tykktarmskreft pasienter med uttrykk av både HIF-1α og P-gp var mer motstandsdyktig mot kjemoterapi enn med ikke uttrykk.
Konklusjoner
HIF-1α hemming reverserer multiresistens i tykktarm kreft celler via nedregulering av MDR1 /P-gp. Uttrykket av HIF-1α og MDR1 /P-gp kan brukes som en prediktiv markør for kjemoterapi motstand i tykktarmskreft
Citation. Chen J, Ding Z, Peng Y, Pan F, Li J, Zou L, et al. (2014) HIF-1α Hemming Reverserer multiresistens i tykktarm kreft celler via nedregulering av MDR1 /P-glykoprotein. PLoS ONE 9 (6): e98882. doi: 10,1371 /journal.pone.0098882
Redaktør: Michal Zmijewski, Medical University of Gdansk, Polen
mottatt: 07.12.2013; Godkjent: 08.05.2014; Publisert: 05.06.2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No.30973430 og No.81101629). (https://isisn.nsfc.gov.cn/egrantweb/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de mest vanlige ondartede svulster over hele verden, og kjemoterapi spiller en viktig rolle i dets behandling. Men den følsomhet for forskjellige kjemoterapeutiske regimer varierer sterkt fra individ til individ. Mange kreftpasienter utvikler resistens, noe som fører til dårlige behandlingsresultatene. Videre resistens forekommer for det meste i solide tumorer in vivo, men ikke i monolag in vitro [1]. Svulsten mikromiljøet spiller en sentral rolle i kjemoterapi svikt og resistens [2] – [4].
Hypoksi er et felles trekk ved mange ondartede svulster, inkludert tykktarmskreft. En hypoksisk tumor mikromiljø er i økende grad betraktet som en viktig komponent i å bestemme medikamentresistens [5], [6]. Hypoksi-induserbar faktor-1 (HIF-1) er en nøkkelfaktor for å endre de biologiske egenskapene til svulster. HIF-1α protein er overuttrykt i mange typer av kreft hos mennesker, og er forbundet med dårligere prognose i mange kreftformer. Selv om mange studier har indikert at hypoksi forsterker svulst motstand mot kjemoterapi og strålebehandling [7], [8], hvordan hypoksisk mikromiljøet bidrar til kreft narkotika motstand er ennå ikke fastslått.
multiresistens (MDR) er en av de viktigste årsakene til at kjemoterapi baserte behandlingssvikt oppstår. Av de mange mekanismer for MDR, er det høy ekspresjon av det humane MDR1 genet og P-glykoprotein (P-gp) transporter som kodes av MDR1 en viktig del av forskningen [9]. Tumorceller som overuttrykker MDR1 /P-gp vanligvis viser resistens mot forskjellige kjemoterapeutiske [10], [11]. Vår tidligere studie viste at HIF-1α protein ekspresjon er korrelert med MDR1 /P-gp ekspresjon i colon carcinoma vev og en tykktarmskreft cellelinje, og mRNA-ekspresjonsnivåene av HIF-1α og MDR1 er vesentlig høyere i den samme type celler i hypoksiske betingelser enn i normoksisk forhold [12]. Det er fortsatt uklart om og hvordan HIF-1α er involvert i MDR i tykktarmskreft via samspillet av MDR1 /P-gp.
Exploring påvirkning av hypoksi på tykktarmskreft MDR vil bidra til å forbedre effekten av kjemoterapi. I hypoksisk mikromiljøet, antar vi at HIF-1α kan direkte indusere uttrykket av MDR1 /P-gp som fører til MDR, og reversering av tykktarmskreft MDR kan oppnås når HIF-1α uttrykket er spesielt hemmet. I denne studien har vi som mål å utforske de potensielle molekylære mekanismer og muligheten for å reversere tykktarmskreft MDR ved å fokusere på målet genet HIF-1α. Vi forventer å gi et teoretisk grunnlag og eksperimentelle bevis for senere relaterte applikasjoner i klinisk behandling.
Materialer og metoder
Cell Culture
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinje LoVo ble innhentet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og dyrket i høy-glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Gibco, USA), supplert med 10% føtalt bovint serum (HyClone, USA) og antibiotika (1% penicillin og 1% streptomycin). For hypoksi eksponering ble cellene dyrket i 24 timer i en inkubator modulator kammer ved 37 ° C med 1% O
2, 5% CO
2, og 94% N
2. Flercellede kuler (MCS) ble oppnådd ved hjelp av den flytende legget teknikken [13]. I korte trekk, ble eksponensielt voksende LoVo-celler tilsatt til kulturmediumskåler som tidligere var belagt med 2% agarose. Platene ble forsiktig virvlet og horisontalt i 10-15 minutter pr 2-3 timer i de første 24 timer, og deretter i 10 minutter hver 4. time. Egnet medium ble oppdatert annenhver dag. For hypoksi eksperimenter ble riktig MCS etablert i normoxia i 48 timer og deretter dyrket i hypoksi i ytterligere 24 timer.
Kjemi
Adriamycin (ADR, Hisun Pharmaceutica, Kina), vinkristin (VCR, Hisun Pharmaceutica, Kina), 5-fluorouracil (5-FU, Sigma, MO, USA), eller irinotecan (CPT-11, Hengrui Medicine, Kina) ble alle tilberedes på dagen for bruk ved å løse opp den nødvendige konsentrasjon i DMEM med 10% føtalt bovint serum.
kjemoterapeutiske Følsomhet Assay
LoVo-celler ble trypsinert, resuspendert og tellet, og 1000 celler ble sådd på 96-brønners plater tidligere belagt med 2% agarose for å oppnå MCS i normoxia. For hypoksi eksperimenter ble passende MSC overført til hypoksi i 24 timer og deretter inkubert med graderte konsentrasjoner av legemidler for ytterligere 24 timer i hypoksi. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av 3- (4, 5-dimetyltiazol-z-yl) -3, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT, BD Biosciences, NJ, USA) assay. Plater ble inkubert med MTT ved 37 ° C i 4 timer, og absorbansen ved 490 nm ble målt ved Modell 550 Microplate Reader (Bio-Rad, CA, USA).
Kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert med TRIZOL-reagens (Invitrogen, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Primerne som ble brukt var: 5′-GTTTGATTTTACTCATCCAT-3 «og 5′-TTCATAGTTCTTCCTCGG-3′ for HIF-1α; 5»-CTTGGCAGCAATTAGAAC-3 «og 5′-TCAGCAGGAAAGCAGCAC-3′ for MDR1; 5»-CCTGGATACCGCAGCTAGGA -3 «og 5′-GCGGCGCAATACGAATGCCCC -3» for 18sRNA. Den første tråd cDNA syntese ble utført med cDNA syntese kit (Takara, Dalian, Kina). Kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn real-time PCR kit (Takara). Alle normalizations ble gjort ved hjelp av 18sRNA nivåer og fold endringer ble beregnet av delta-deltaet Ct metoden. Alle forsøkene ble utført i tre biologiske replikater.
Western Blot analyse
Total protein (50 pg) ble separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese. Etter protein overføring til polyvinylidenfluorid mikroporøse membraner (Bio-Rad) ble membranene blokkert med 5% fettfri tørrmelk og inkubert sekvensielt med de primære antistoffer (HIF-1α 1:500; P-gp 1:200; p-actin 1 :5000), etterfulgt av inkubering med fluorescein-bundet anti-mus (anti-kanin) IgG (1:1000) og deretter inkubering med anti-fluorescein alkalisk fosfatase-konjugert antistoff (1:5000). Alle antistoffer ble kjøpt fra Santa Cruz, CA, USA. Immunkompleksene ble detektert med forbedret kjemiluminescens-reagens (Pierce, USA). For kvantifisering, signalene var densitometrically normalisert p-aktin ved Kvantum En bildeanalyse programvare (Bio-Rad).
HIF-1α siRNA Bygg og Transfeksjon
Pre-miRNA RNAi sekvenser for målet gener HIF-1α og MDR1 ble utformet og syntetisert. Etter at de to bestemte miRNA RNAi ekspresjonsvektorer med reportergenet EmGFP målretting av den humane HIF-1α og MDR1 gener, respektivt, ble konstruert og identifisert ved restriksjonsenzymkutting og sekvensering ble de RNAi plasmidene HIF-1α og MDR1 transfektert inn LoVo-celler bruker liposomer Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA). Stabile positive kloner ble valgt ved hjelp blasticidin. Grader av knockdown av HIF-1α og MDR1 ble identifisert ved PCR. RNAi plasmider med bedre undertrykkelse effekter ble valgt for videre bygging av miRNA lentivirus uttrykk kloner. To miRNA lentivirus uttrykk kloner, pLenti6 /V5-GW /EmGFP-MIR-HIF-1α og pLenti6 /V5-GW /EmGFP-MIR-MDR1, ble bygget ved hjelp av Gateway rekombinasjonsteknikker (Invitrogen) og co-transfektert inn 293ft celler med ViraPower emballasje mix (Invitrogen). Den titer ble undersøkt etter å infisere NIH /3T3 celler med virus supernatant. Deretter ble LoVo celler infisert med de to lentiviral vektor-mediert miRNA RNAi systemer og stabilt valgt av blasticidin.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip)
Celler ble sådd ut i 100 mm diameter retter og etter 24 timer, inkubert med 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C for å kryssbinde proteiner til DNA. Tverrbindingen ble reaksjonen stanset ved tilsetning av en tiendedel volum av 1,25 mol /l glycin. Cellene ble vasket to ganger med iskald 1 x PBS; resuspendert i radioimmunopresipitasjonsanalyse analysebuffer og holdt på is i 30 minutter. Deretter ble cellelysater ultralydbehandlet på is med en Hielscher UP200S ultralyd ultralyd (Hielscher Ultrasonics GmbH, Tyskland) inntil de tverrbundne Kromatin ble skåret for å gi DNA-fragmenter mellom 200 og 1000 bp. Supernatantene ble inkubert med laksesperm DNA /protein-50% agarose oppslemming for å redusere ikke-spesifikk bakgrunn. Immunutfelling ble deretter utført over natten ved 4 ° C med 5 ug av anti-HIF-1α antistoff (Santa Cruz, CA, USA). Disse supernatanter ble tilsatt 5 mol /l NaCl og oppvarmet over natten ved 65 ° C for å reversere protein-DNA-kryssbindinger. De immunokomplekser ble ytterligere behandlet med DNase-fri RNase-fritt og proteinase K, og DNA ble renset ved fenol /kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling. PCR ble utført med primere som er spesifikke for region som inneholder hypoksi responsive enhancer område (5′-GCGTG-3 «) av MDR1 promotoren [14]. Primerne som ble brukt var som følger: 5»-GGAGCAGTCATCTGTGGTGA-3 «og 5′-CTCGAATGAGCTCAGGCTTC-3». Som rapportert tidligere [24], human vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF, en etablert HIF-1 target-genet) ble anvendt som en positiv kontroll og primere som flankerer den hypoksi som reagerer enhancer av VEGF-promoteren var 5′-GCCTCTGTCTGCCCAGCTGC-3 «og 5 «-GTGGAGCTGAGAACGGGAAGC-3». Immunoutfelling med ikke-spesifikk IgG (Santa Cruz) ble utført som negativ kontroll. En prøve som representerer lineær forsterkning av tilførte DNA ble anvendt som inngangskontroll.
Påvisning av apoptose ved strømningscytometri (FCM)
Celler ble fremstilt og behandlet som beskrevet ovenfor, og deretter farget med allofykocyanin (APC) -konjugert annexin V og propidiumjodid (PI) i 10 minutter ved romtemperatur, i henhold til produsentens instruksjoner (Annexin V-APC /PI Apoptose Detection Kit; Jingmei Biotech, Kina). Populasjonen av Annexin V-negative levedyktige og annexin-V-positive apoptotiske celler ble evaluert ved FCM. Data ble samlet i en FACSCalibur instrument (BD Biosciences) og analysert ved hjelp av Cellquest programvare (BD Biosciences).
Pasienter og vevsprøver
Ett hundre og tyve pasienter med histologisk bekreftet avansert tykktarmskreft og som gjennomgikk 5-FU-basert kjemoterapi ved Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, Kina, mellom 2004 og 2008 var kvalifisert for denne studien. Denne undersøkelsen ble gjennomgått og godkjent av etisk og protokoll Review Committee of the Southwest Hospital, Third Military Medical University og alle pasientene gitt skriftlig samtykke skjema. Pasientene var i alderen 30 til 79 år (gjennomsnittsalder, 54 år); 73 var menn, og 47 var kvinner. Kjemoterapi respons ble evaluert av CT scan eller andre radiografiske midler etter to runder med behandling, vedta Response evalueringskriterier i solide svulster Gruppe kriterier. Basert på deres kjemoterapi respons ble pasientene klassifisert som respondere eller non-respondere. Vevsprøver ble fiksert i 10% formalin, innstøpt i parafin, og skåret i 4-um seriesnitt. Ekspresjonen av HIF-1α og P-gp ble undersøkt ved immunhistokjemi, som tidligere beskrevet [12]. Klar, brun-gul farging begrenset til kjerner, cytoplasma, eller cellemembranen indikerte positive ekspresjon av HIF-1α eller P-gp. Positiv uttrykk ble registrert som (+) og negative uttrykk som (-).
Statistical Analysis
Alle data er gitt som gjennomsnitt ± SD. Resultatene ble analysert ved hjelp av chi-square test, Students t-test og enveis variansanalyse (ANOVA).
p
0,05 ble betraktet som signifikant. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS versjon 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
LoVo MCS er mer motstandsdyktig mot kjemoterapi enn Monolag i hypoksiske betingelser
for å etterligne den hypoksiske mikromiljøet av en tumor in vivo [15], [16], LoVo MCS ble oppnådd ved hjelp av flytende overlegg teknikk. LoVo-celler agglomerert med hverandre og proliferert raskt. Etter å ha blitt dyrket i 48 timer, ble LoVo MCS sammensatt av et antall av agglomererte celler (figur 1B). Kvantitativ real-time PCR viste at uttrykket av HIF-1α var betydelig høyere i LoVo MCS enn i LoVo monolag, ikke bare i hypoksiske forhold, men også i normoxia (
p
0,05) (figur 1C). Medikament sensitiviteter til 5-FU ble evaluert, og resultatene viste at LoVo MCS var mer resistente mot 5-FU enn det som var monolag i hypoksi (
p
0,05). Videre er både LoVo MCS og monolagene var mer resistente mot 5-FU i hypoksiske betingelser enn i normoxia (figur 1D).
(A) Morfologi av LoVo monolag. Scale bar = 50 mikrometer. (B) Den morfologi LoVo MCS. Scale bar = 50 mikrometer. (C) Kvantitativ real-time PCR oppdaget HIF-1α mRNA uttrykk i LoVo MCS og i monolag henhold normoksiske og hypoksiske forhold. De 18sRNA nivåer ble benyttet som intern kontroll og brette endringer ble beregnet ved hjelp av delta-delta Ct-metoden. Forsøkene ble utført i tre paralleller biologiske og PCR for hvert gen ble utført i duplikater (*
p
0,05). (D) Narkotika overfølsomhet (gjennomsnitt ± SD, n = 3) av LoVo MCS og LoVo monolag til 5-FU i hypoksi eller normoxia (*
p
0,05, N: normoxia, H: hypoksi).
HIF-1α Hemming Reverserer multiresistens i LoVo MCS
Fordi LoVo MCS viste mer resistens mot kjemoterapi enn monolag gjorde i hypoksi, ønsket vi å undersøke om legemiddelresistens endret når HIF- 1α uttrykk ble spesielt hemmet. Vi opprettet en LoVo MCS modell og stabil LVV-HIF-1α og LVV-MDR1 MIR-infiserte grupper. I hypoksiske betingelser, følsomheten av LoVo MCS for kjemoterapi med hver av de fire stoffene ble redusert i varierende grad. Den 50% hemmende konsentrasjon (IC
50) verdier i hypoksisk gruppen var alle høyere enn de i normoksiske gruppen (ADR, videospiller, og 5-FU,
p
0,01; CPT- 11,
p
0,05) (figur 2). Etter stanse den HIF-1α genet, ble følsomheten LoVo MCS til alle fire kjemoterapi narkotika restaurert i forskjellig grad. Det relative forholdet mellom tilbakeførings LVV-HIF-1α MIR-infisert gruppe (hypoksi) og MCS (hypoksi) for hvert legemiddel var som følger: ADR, 82,8% (
p
0,01); VCR, 83,8% (
p
0,01); 5-FU, 70,7% (
p
0,01); og CPT-11, 48,5% (
p
0,05). Etter å stanse MDR1-genet, det relative forhold mellom reverse LVV-MDR1 MIR-infisert gruppe (hypoksi) og MCS (hypoksi) for hvert legemiddel var som følger: ADR, 74,2% (
p
0,01) ; VCR, 70,9% (
p
0,01); 5-FU, 58,1% (
p
0,05); og CPT-11, 15,2% (
p
0,05)
(A) ADR.. (B) VCR. (C) 5-FU. (D) CPT-11. (E) IC50 på forskjellige LoVo MCS-grupper til kjemoterapeutika (gjennomsnitt ± SD, n = 3, **
p
0,01, *
p
0,05, N: normoxia, H .: hypoksi)
HIF-1α Hemming Forbedrer apoptose indusert av cytostatika i LoVo MCS
Vi observerte apoptose indusert av cytostatika i LoVo MCS når HIF-1α uttrykk ble spesielt hemmet. Analysen av apoptose av FCM viste at (figur 3), sammenlignet med LoVo MCS henhold til normoksisk forhold, apoptotiske nivået indusert av de fire stoffene var lavere i varierende grad i hypoksisk gruppen (ADR, VCR, og 5-FU,
p
0,01; CPT-11,
p
0,05). Etter effektivt stanse målgenet HIF-1α, den induserte apoptose nivå ved ADR, videospiller og 5-Fu ble merkbart øket (
p
0,01) og var 9,2 ganger, 7,4 ganger, og 2.6- fold henholdsvis i motsetning til den av LoVo MCS (hypoksi gruppe). Likevel, apoptose nivået indusert av CPT-11 var bare 1,1 ganger til hypoksi gruppe, uten statistisk signifikans (
p
0,05).
Andelen annexin V-positive apoptotiske celler (nedre høyre kvadrant) ble evaluert ved flow cytometri ved hjelp av annexin V allofykocyanin (APC) og propidiumjodid (PI) farging av LoVo MCS etter behandling med (B) ADR (25 ug /ml), (C) VCR (25 ug /ml), (D) 5-FU (200 ug /ml) og (E) CPT-11 (200 ug /ml). Ubehandlede celler ble anvendt som negativ kontroll. Data for hvert statistisk graf av Annexin V-APC /PI farging er uttrykt i% av cellene i den nedre høyre kvadrant og representerer gjennomsnittet ± SD for tre uavhengige eksperimenter. Baren listene på bunnen av flowcytometri scatterplots representerer% av cellene gjennomgår apoptose i nedre høyre kvadrant. (**
p
0,01, N: normoxia, H: hypoksi)
MDR1 /P-gp Protein Expression er redusert i LoVo MCS etter LVV-HIF-1α MIR Transfeksjon i Hypoksi
å utforske mulige molekylære mekanismer for reversering av MDR ved å fokusere på målet genet HIF- 1α, vi har oppdaget uttrykket av MDR-relaterte gener i LoVo MCS når HIF-1α uttrykk ble spesielt hemmet. Western blot viste at ekspresjon av HIF-1α og P-gp i LoVo MCS ble signifikant forbedret etter behandling i 24 timer i hypoksi (
p
0,01). Når HIF-1α ble slått ned i LVV-HIF-1α MIR smittet MCS, både HIF-1α og P-gp protein uttrykk ble nedregulert i forhold til den negative kontrollgruppen (
p
0,01). Og, i det LVV-MDR1 MIR infisert MCS, protein ekspresjonsnivået av HIF-1α viste ingen forskjell, mens P-gp ble redusert vesentlig sammenlignet med den negative kontrollgruppen (figur 4). Resultatene indikerte at MDR1 var den nedstrøms genet fra HIF-1α og MDR1 /P-gp uttrykk vil bli redusert i LoVo MCS mens HIF-1α ble inhibert.
(A) Western blot analyser ble utført. β-aktin ble benyttet som intern kontroll. (B) Relative protein nivåer (gjennomsnitt ± SD, n = 3) av HIF-1α og P-gp ble bestemt i hver grupper (**
p
0,01, N: normoxia, H: hypoksi) .
MDR1 /P-gp mRNA og protein uttrykk er redusert i LoVo Monolag etter LVV-HIF-1α MIR Transfeksjon i Hypoksi
Fordi MDR1 /P-gp protein uttrykk ble redusert i LoVo MCS etter LVV-HIF-1α MIR transfeksjon, vi videre oppdaget uttrykket av MDR-relaterte gener i lovo monolagene i hypoksi. Etter stabilt infisere LoVo monolagene med LVV-HIF-1α MIR og LVV-MDR1 Mir, kvantitativ real-time PCR og Western blot (figur 5) viste at i hypoksi, mRNA og protein uttrykk nivåer av HIF-1α og MDR1 i LVV -HIF-1α MIR gruppen var betydelig lavere enn for de ikke-behandlede og negative kontroll Mir gruppene (
p
0,01). Men i LVV-MDR1 MIR gruppe, bare de mRNA og protein uttrykk nivåer av MDR1 genet var statistisk lavere enn for de ikke-behandlede og negative kontroll Mir grupper i hypoksi (
p
0,01) , mens ingen forskjeller i HIF-1α mRNA og protein ble notert (
p
0,05).
(A, B) Kvantitativ real-time PCR oppdaget HIF-1αor MDR1 mRNA uttrykk i LoVo monolag (hypoksi) med LVV-HIF-1α MIR (A) eller LVV-MDR1 MIR (B) stabilt transduced. Ubehandlet monolag i normoxia ble brukt som normoksiske kontroll. De 18sRNA nivåer ble benyttet som intern kontroll og brette endringer ble beregnet ved hjelp av delta-delta Ct-metoden. Forsøkene ble utført i tre paralleller biologiske og PCR for hvert gen ble utført i duplikater (**
p
0,01). (C-F) Western blot oppdaget HIF-1α og P-gp protein uttrykk i LoVo monolag (hypoksi) med LVV-HIF-1α MIR (C) eller LVV-MDR1 MIR (E) stabilt transduced. Ubehandlet monolag i normoxia ble brukt som normoksiske kontroll. (D, F) Sammenligning av ekspresjonsnivåene (gjennomsnitt ± SD, n = 3) av HIF-1α og MDR1 protein i hver gruppe (**
p
0,01).
Binding av HIF-1α til MDR1 Gene Arrangøren
Vi benyttet en chip analyse for å vurdere i LoVo MCS (både i normoxia og hypoksi) om HIF-1α bundet til arrangøren regionen av MDR1 genet. Etter utfelling av cellelysater med et spesifikt anti-HIF-1α antistoff ble MDR1 genpromoteren og VEGF-genpromoteren (en etablert HIF-1 target-genet) amplifisert ved PCR med spesifikke primere. Resultatene (figur 6) viser at HIF-1α ble bundet til MDR1 genpromoteren i LoVo MCS ikke bare i hypoksiske betingelser, men også i normoksisk forhold.
Binding av HIF-1α på MDR1 og VEGF genet promotorer ble målt ved chip. PCR-analyse for MDR1 genet promotorområdet ble utført på immunoutfellingsstudier prøver (IP) med anti-HIF-1α antistoff og med renset tilførte DNA fra LoVo MCS (normoxia og hypoksi). VEGF-gen-promoteren (en etablert HIF-1 target-genet) ble anvendt som en positiv kontroll. Immunoutfelling med ikke-spesifikk IgG ble utført som negativ kontroll. En prøve som representerer lineær forsterkning av tilførte DNA ble brukt som input kontroll.
Pasienter med HIF-1α (+) /P-gp (+) er mer motstandsdyktig mot kjemoterapi
Vår tidligere studie har vist at HIF-1α og MDR1 /P-gp uttrykk nivåer korrelerer i tumorvev av colon carcinoma [12]. For å bestemme hvorvidt ekspresjon av HIF-1α og MDR1 /P-gp i kolon kreftpasienter er forskjellig, så vel som den tilhørende følsomhet overfor kjemoterapi, ble immunhistokjemiske teknikker anvendt for å detektere ekspresjon av HIF-1α og P-gp i tumorvev av 120 pasienter med avansert tykktarmskreft som fikk 5-FU-basert kjemoterapi. Vi fant at 73 av 120 tilfeller (60,8%) uttrykt både HIF-1α og P-gp, og dette HIF-1α (+) /P-gp (+) pasientpopulasjonen var mer resistente overfor kjemoterapi enn det som var HIF-1α ( -) /P-gp (-.) populasjonen (
p
= 0,001, OR 5,647, 95% KI 1,920 til 16,606) (tabell 1)
Diskusjoner
Vår tidligere studie viste at HIF-1α protein uttrykk er korrelert med P-gp uttrykk i colon carcinoma vev og tykktarmskreft cellelinjer, og HIF-1α og MDR1 mRNA ble funnet å være betydelig høyere i de samme cellene i henhold hypoksiske forhold enn henhold normoksisk forhold [12]. I denne studien, viser vi at HIF-1α kan direkte påvirke uttrykket av MDR1 /P-gp i hypoksisk mikromiljø og deretter formidle kjemoterapi motstand ikke bare i dyrkede cellemono men også i flercellede kulene, og HIF-1α hemming kan reversere multidrug motstand via nedregulering av MDR1 /P-gp. Mye bevis har vist at en hypoksisk mikromiljøet er som bidrar til utvikling og vedlikehold av kreft [17]. Videre har kreftceller i hypoksiske forhold viser mer resistens mot antineoplastiske medikamenter [18], [19]. Noen studier som har forsøkt å forklare dette fenomenet har funnet ut at cellene i hypoksiske forhold generelt dele tregere enn de i normoksisk forhold, rende behandlinger som er rettet mot raskt voksende celler mindre effektive [17]. I mellomtiden, en studie viste at hypoksi kan indusere en rekke gener, inkludert MDR1 /P-gp, i flercellede spheroids [16]. I vår studie fant vi at HIF-1α bundet til MDR1 genet promoter i LoVo MCS ikke bare i hypoksiske forhold, men også i normoksisk forhold.
Vi opprettet en LoVo MCS modell for å etterligne den hypoksiske mikromiljøet av svulster in vivo. Kjemoterapi følsomhet og apoptotiske endringer av LoVo MCS til ADR, videospiller, 5-FU og CPT-11 ble undersøkt i normoxia og hypoksi. Resultatene viste at kjemoterapi sensitivitet og apoptose av LoVo MCS som reaksjon på de fire stoffene var redusert i varierende grad i hypoksiske forhold. Av de fire cytotoksiske medikamenter, 5-FU og CPT-11 er de mest brukte i tykktarmskreft, mens motstanden mot ADR og videospiller er antatt å være nært knyttet til MDR1 /P-gp [20]. Dempe den HIF-1α genet restaurert følsomheten LoVo MCS til ADR, videospiller, og 5-FU og induserte en markert økning i apoptotisk nivået av hvert tilsvarende legemiddel (
P
0,01). Disse resultater indikerer at legemiddelresistens av LoVo MCS kan reverseres med en kombinasjon av den LVV-HIF-1α MIR system og de ovennevnte narkotika. Dette funnet sammenfaller med tidligere funn som hemmer HIF-1α kan forbedre følsomheten til kjemoterapeutiske midler i kreftcellene som fibrosarkom, magekreft, og brystkreft [21] – [23]. Siden Unruh
et
al.
[24] fant at antiproliferative effekt av karboplatin og etoposid er betydelig forbedret ved inaktivering av HIF-1α i mus embryonale fibroblaster, bidrag av HIF-1α medikamentresistens har blitt observert i forskjellige typer av neoplastiske celler i senere år [21], [25] – [29]. Men de tilgjengelige data om forholdet mellom HIF-1α og chemoresistance av kreftceller er i konflikt. For eksempel har noen studier vist at inaktivering av HIF-1α i normoxia har ingen effekt på narkotika reaksjoner i neuroblastom og lunge adenokarcinomceller [30], [31]. Nyere studier har også hevdet for en motstand formidlende virkning av HIF-1α, i det minste i noen humane cancere [4]. I tillegg fant vi at det var en trend mot mer følsomhet etter HIF-1α eller MDR1 hemming, men kjemoterapi overfølsomhet for CPT-11 var ikke signifikant forskjellig i de LoVo MCS grupper. Resultatet indikerte at mekanismen for chemoresistance til CPT-11 ikke er avhengig av P-gp, men heller gikk gjennom en annen vei, slik som CPT-11 metabolsk produkt SN-38 [32] -. [34]
Den mekanisme ved hvilken HIF-1α bidrar til MDR er komplisert og forble uklart. HIF-1α kan megle MDR ved å regulere narkotika efflux, endre celleproliferasjon og overlevelse, hemmer DNA-skade, eller omprogrammere stoffskiftet. Som en av de viktigste medlemmene av ABC-transportør-familien, reduserer MDR1 /P-gp de intracellulære konsentrasjonene av cytotoksiske medikamenter ved aktivt å pumpe stoffene ut av cellene, og dermed beskytte cancerceller fra deres antitumoreffekter [35]. MDR1 er et målgen av HIF-1. I de senere år bidraget fra HIF-1-mediert P-gp uttrykk til hypoksi-indusert medikamentresistens er blitt observert i mange tumorceller, slik som magekreft, hjernesvulst, og brystcancer [14], [21], [26 ], [36]. I denne studien viste vi at ekspresjon av HIF-1α og P-gp ble betydelig forbedret i LoVo MCS etter behandling i hypoksi. HIF-1α hemming ved å transfektere celler med en spesifikk siRNA for HIF-1α betydelig redusert ekspresjon av MDR1 /P-gp mRNA og protein i både LoVo LoVo monolag og MCS. Videre ble HIF-1α bundet til MDR1 genpromoter direkte. Vi viste at HIF-1α aktivering kan direkte indusere uttrykket av MDR1 /P-gp og deretter føre til MDR.
For å avgjøre om uttrykket av HIF-1α og MDR1 /P-gp i kolon kreftpasienter er forskjellig , så vel som den tilhørende følsomhet overfor kjemoterapi, ble immunohistokjemi anvendt for å detektere ekspresjon av HIF-1α og P-gp i tumorvev på 120 pasienter med fremskreden kolon carcinoma som mottok 5-FU-kjemoterapi. Vi fant at 73 av 120 tilfeller (60,8%) uttrykt både HIF-1α og P-gp, og dette HIF-1α (+) /P-gp (+) pasientpopulasjonen var mer resistente overfor kjemoterapi enn det som var HIF-1α ( -) /P-gp (-) befolkningen. Derfor HIF-1α /MDR1 kan være et lovende mål i kolon cancer behandling, og reverseringen av tykktarmskreft MDR kan oppnås når HIF-1α /MDR1 uttrykk er spesifikt inhibert. Vi foreslår at uttrykket av HIF-1α og MDR1 /P-gp kan brukes som en prediktiv markør for kjemoterapi motstand i tykktarmskreft.
I konklusjonen, rapporterer vi at HIF-1α hemming reverserer MDR i tykktarmskreft celler, som er assosiert med nedregulering av MDR1 /P-gp. Våre resultater kan ha brede kliniske implikasjoner for kolon pasienter med HIF-1α (+) /P-gp (+) uttrykk mønstre, og kombinasjonsterapier rettet mot moduler HIF-1α uttrykk i konsert med standard kjemoterapiregimer kan gi en strategi for å overvinne svulst motstand.
