Abstract
For tiden i klinikken, folk bruker hematoxylin og eosin flekken (H E flekken) og immunhistokjemi metoder for å identifisere generasjon og sjanger av kreft for menneske patologiske prøver. Siden disse fremgangsmåter er unøyaktige og tidkrevende, å utvikle en hurtig og nøyaktig metode for å påvise kreft Det er stort kreves. I vår studie ble bindende peptider for lungekreft cellelinje A549 identifisert ved hjelp av bakterier på overflaten visningsmetoden. Med disse bindende peptider for A549-celler på overflaten, de fluorescerende bakterier (
Escherichia coli
med stabilt uttrykte grønt fluorescerende protein) ble servert som spesifikke detekterer reagenser for diagnostisering av kreft. Den bindende aktivitet av peptid-fluorescerende bakterier kompleks ble bekreftet ved frittliggende kreftceller, festet kreftceller og muse tumor xenograft prøver. En unik fiksering metode ble utviklet for peptid-bakterier kompleks for å gjøre dette mer komplekse mulig for klinikken bruk. Dette peptid-fluorescerende bakterier komplekset har stort potensial til å bli en ny diagnostisk verktøy for klinisk anvendelse
Citation. Dong B, Wang A, Yuan L, Chen L, Pu K, Duan W, et al. (2013) Peptide-Fluorescent Bakterier Komplekse som Lysende Reagenser for kreftdiagnose. PLoS ONE 8 (1): e54467. doi: 10,1371 /journal.pone.0054467
Redaktør: Shi Yu Yang, University College London, Storbritannia
mottatt: 9. oktober 2012; Akseptert: 11. desember 2012; Publisert: 18 januar 2013
Copyright: © 2013 Dong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (No.30870683 og 81171451). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
med utviklingen av nye teknikker om diagnostisering og behandling av kreft, har dødeligheten av kreftpasienter redusert de siste tiårene. Imidlertid tar man sikte på å kurere kreft fortsatt langt fra å nå. Foreløpig de viktigste punktene for å øke herdehastigheten og livskvalitet for kreftpasienter er tidligere og nøyaktig diagnose og effektiv behandling for slike ondartede sykdommer. Anvendelsen av sensitive lysende reagenser og målsøkende molekyler for kreftceller gir nyttige verktøy for nøyaktig diagnose og effektiv behandling for kreft. Nye selvlysende materialer som kvanteprikker [1], oppskalering nanomaterialer [2] og nanobubbles [3] har forsøkt å gjelde for kreft imaging-systemer. Forskjellige molekyler slik som antistoffer [4], peptider [5], [6] og aptamerer [7] har vært anvendt som rettet mot molekyler for kreftdiagnose og terapi. Selv om det er noen fremgang for utvikling av luminescerende materialer og målsøkende molekyler, effektive systemer for kreftdiagnose og terapi er ikke fullt ut etablert. Tidligere og mer nøyaktig diagnose metoder som kombinerer målsøkende molekyler med robuste bilde molekyler tiltrekke seg flere og flere forskere interesse [8]. Vår studie har til hensikt å etablere et nytt system som inkluderer rettet mot peptider og fluoriserende bakterier for nøyaktig diagnose av kreft. Målrettet mot peptider kan bli screenet og identifisert ved bakterier overflate skjerm metode utviklet i 1990-årene [9], [10]. Ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS), er forskjellige peptider med spesifikke bindingsaktiviteten blitt oppnådd i en høy gjennomstrømning måte med bakterier vise metoden [11], [12]. For tiden, med denne metoden, er målrettet mot peptidene for brystcancerceller [13] og underlaget peptider for proteinase [14] har blitt identifisert. I vår undersøkelse med identifikasjon av spesifikke bindingspeptider for lungecancer A549-celler, vil det etableres en ny teknikk for å detektere lungekreftceller ved hjelp av peptid-fluorescerende bakterier system. Videre kan peptid-fluorescerende bakterier system anvendes som diagnostisk reagens i klinisk anvendelse for kreftpasienter i fremtiden.
Materialer og metoder
1. Cellekultur og materialer
human lunge-carcinoma-cellelinjer (A549 celler og H460-celler), human bryst adenocarcinoma cellelinje (MCF-7), human leverkreft cellelinje (HepG-2), human cervical carcinoma-cellelinjen (HeLa) og human laryngeal carcinoma cellelinje (Hep-2) ble anvendt i denne studien. Disse cellelinjene ble dyrket i RPMI-1640 (Hyclone Corp., USA) og humane lunge fibroblast celler (HLF) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (Hyclone Corp., USA) i en 5% CO
2 fuktet inkubator ved 37 ° C. Mediet ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Hyclone Corp., USA) og 1% penicillin /streptomycin (China National Medicine Corp., Kina). A549, H460 og HLF celler var snill gaver fra Dr Biliang Zhang [15], [16] (Guangzhou institutter for biomedisin og helse, CAS, Kina). MCF-7, HepG-2, HeLa og Hep-2 celler var snill gaver fra Dr Haiyan Liu [17], [18] (The Cyrus Tang hematologi, Suzhouuniversitetet, Kina). De andre kjemiske midler i denne studien ble kjøpt fra China National Medicine Corporation.
2. Screening av Binding Monoklonale Peptide-fluorescerende Bakterier med A549 celler
Bakterie peptid bibliotek av
E. coli
brukt i denne studien var en gave fra Patrick S. Daugherty ved Institutt for kjemisk prosessteknologi, University of California, Santa Barbara. I denne bakteriell peptid biblioteket hver
E. coli
overflate presenterte 13-mer peptid (X2CX7CX2) å smelte i den andre ekstracellulære sløyfe av den sirkulært permutert ytre membranprotein OmpX (CPX) [13], hvor uttrykte peptider og grønt fluorescerende protein (GFP) ble indusert ved tilsetning av L – (+) – arabinose (0,02% vekt /volum) til en log-fase-kultur [13], [19]
Frosne prøver med 1 x 10
9 bakterier ble tint og dyrket. over natten i super optimal buljong (SOB) ved 37 ° C og supplert med 34 ug /ml kloramfenikol (CM) og 0,2% (w /v) D – (+) – glukose. Den neste dag, bakterier ble dyrket på 1:50 i lysogeni buljong (LB) medium supplementert med 34 ug /ml CM i 2 timer ved 37 ° C og fremkalt med 0,02% (w /v) L – (+) – arabinose for 1 time ved romtemperatur for å sikre GFP og peptider uttrykt i bakterier. Etter dyrkede (48 timer etter såing) A549 og HLF-celler ble høstet ved trypsinering og resuspendert i rør. 10
7 HLF-celler ble ko-inkubert med 100-gangers overskudd av bakterieceller i 45 min på en inversjon rister ved 4 ° C. Cellesuspensjonene ble sentrifugert ved 1000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C, og supernatanten ble oppsamlet. Denne prosedyren kan bli gjentatt for annen gang på grunn av økt ikke-spesifikke bindingshendelser har oppstått for HLF celler. Supernatanten ble ko-inkubert med 10
7 A549-celler i 45 minutter på en inversjon risteapparat ved 4 ° C og cellesuspensjoner ble sentrifugert ved 1000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C og deretter vasket tre ganger med PBS. Sedimentet ble resuspendert med 5 ml kald PBS og umiddelbart analysert ved hjelp av FACS (BD FACS Aria II, BD Corp. USA). Sorterings port i FACS forsøket ble satt på grunnlag av de fluorescente signalene fra negative kontrollprøver. Når fluorescens innstillinger hadde blitt optimalisert for den negative kontrollen, ble en passende form gate trukket for sortering biblioteket basert på fluorescens. En slags gate ble trukket for å utelukke så mye av den negative kontrollen som mulig, samtidig fange positive hendelser i biblioteket [13] .Den grønne fluorescerende celler ble inngjerdet for sortering, fordi hvis peptider som var på overflaten av grønne fluorescerende bakterier kan binde med A549 celler og de grønne fluorescente signalene fra cellene ville øke. Minst 10
5 hendelsene ble registrert og tumorceller med økt grønne fluorescerende signaler og falt inn i den oransje gate ble samlet med FACS. De oppsamlede celler ble dyrket over natten i SOB inneholdende 0,2% D – (+) – glukose og 34 ug /ml CM. Bakterier bindende med kreftceller spesifikt ble forsterket for neste runde av screening. Fra neste runde, 10
6 celler var nok for FACS analyse og sortering. Inntil det fluorescente signalet av tumorceller stopper øker i rekkefølge to omganger, ble fremgangsmåten i screening for bindende peptider avsluttet. Utvalgte bakterier med bindende peptider ble dyrket på LB-medium plate inneholdende 1% agar og 34 ug /ml CM. Etter å ha dyrket i 24 timer ved 37 ° C, ble monoklonale peptid-fluorescerende bakterier plukket og dyrket i 5 ml SOB inneholdende 0,2% (m /v) D – (+) – glukose og 34 ug /ml cm ved 37 ° C over natten. Den neste dag, bindingsaktiviteten av individuelle kloner ble undersøkt ved måling av GFP fluorescente signalene fra cellene etter A549-celler inkubert med de monoklonale peptid-fluoriserende bakterier. Sekvensene av peptider på overflaten av monoklonale peptid-fluoriserende bakterier ble erholdt ved å sende ut disse bakterier til Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai, Kina for sekvensering.
3. Karakterisering av Binding spesifisitet og effektivitet mellom Peptide-fluorescerende bakterier og celler
Forsøkene ble utført på både festet og frittliggende celler. Den fluorescensmikroskopi eksperiment ble først utført for å undersøke bindingsspesifisiteten til monoklonale peptid-fluoriserende bakterier med festede celler. A549-celler, HLF celler, H460-celler, MCF-7-celler, Hep-2-celler, HepG-2-celler og HeLa-celler (3 x 10
5) ble sådd ut i 12-brønners cellekulturplater en dag før eksperimentet. Etter induksjon, 100 mL av bakteriesuspensjonen (≈8 x 10
7) i 1 ml PBS ble inkubert med alle typer celler ved romtemperatur, som har vist seg å sikre proteiner på overflaten av cellene uttrykt normalt i løpet av inkubasjonen [13] i 45 min og ble vasket tre ganger med PBS. Cellene ble fotografert med fluorescensmikroskopi (Nikon Ti, Nikon Corp. Japan) for å bekrefte bindingsaktiviteten av monoklonale peptid-fluoriserende bakterier med celler. Bindingsaktiviteten mellom monoklonale peptid-fluoriserende bakterier med frigjorte celler ble undersøkt ved hjelp av strømningscytometri. Fremgangsmåten med å undersøke bindingsaktiviteten av peptid-fluoriserende bakterier er lik den for screening av bindende peptider med celler.
4. Forsøk på å opprettholde Bakterier bindingsaktivitet med ulike fiksering
Fiksering ble gjort med forskjellige feste reagenser (etanol [20], metanol [21], aceton [22] og 4% paraformaldehyde [23]). Etter sentrifugert ved 5000 rpm i 5 minutter, supernatanten ble fjernet, og bakteriene ble fiksert i feste reagenser for 20 minutter ved romtemperatur. Det overskytende feste reagenser ble fjernet og de fikserte bakterier ble suspendert ved PBS og lagret ved 4 ° C.
Strømningscytometri-analyse og fluorescensmikroskopi forsøk ble utført som angitt ovenfor for å undersøke bindingsaktiviteten av faste bakterier med celler. Sammenlignet med friske monoklonale peptid-fluoriserende bakterier, forholdet mellom faste bakterier til celler varierte fra 100:1 til 500:1 for å oppnå åpenbare og detektert fluorescerende signaler i celler. Normalt etter bakterier ble løst, de grønne fluorescerende signaler bakterier redusert på viss grad. For å undersøke hvorvidt bindingsaktiviteten av faste bakterier med celler ble avhengig av tiden ble fluorescens mikroskopi og FACS-analyser utføres gjentatte ganger på dag 1, dag 7 og dag 30 etter fiksering.
5. Undersøkelse av bindingsaktivitet av Peptide-fluorescerende Bakterier System med tumorvev hos mus Xenotransplantat
Binding Forsøket ble utført på parafin-embedded tissue. A549 mus tumor xenograft prøver på parafin lysbilder var snille gaver fra Dr Laura Cerchia og Dr Vittorio De Franciscis (Istituto di Endocrinologia ed Oncologia Sperimentale, CNR, Napoli, Italia). Den relaterte papir om prøvene forberedelse har allerede blitt publisert i PLoS ONE journal [24]. Awoksing fremgangsmåte for paraffin-prøvene ble utført etter den aksepterte fremgangsmåte [25]. 1 x 10
6 (i 100 ul) ferske peptid-bakterier og 5 x 10
6 fast peptid-bakterier ble inkubert separat med parafintumorsnitt i 1 time ved romtemperatur. Etter vask med PBS tre ganger, ble tumorsnitt observert under et Nikon A1R konfokal laser scanning mikroskop (Nikon Corp Japan).
Resultater
1. Anriking av spesifikk binding Peptider Bibliotek for A549 celler
For å isolere celle spesifikke bindings ligander for en gitt svulst celle fenotype vi besluttet å sette opp et modellsystem inkludert normal (ikke-tumor) cellelinje (HLF) og carcinoma cellelinje lunge (A549). HLF celler jobbet for counterselection i screening prosessen. En 13-mer bibliotek med cystein behersket peptider ble anvendt for utvelgelse av peptider mot intakte celler (figur 1A). Ved hver runde av A549-celler seleksjonstrinnet ett eller to trinn counterselection mot HLF-celler ble utført. Under utvelgelsesprosessen, gradvis økte vi seleksjonspress ved å endre inkubasjon tilstand, vasking tilstand og areal av porten i FACS. Under rund 6 og 7, forble forholdet mellom grønne fluorescerende celler til hele celler uendret, noe som tyder på at befolkningen hadde stoppet å utvikle seg under seleksjonstrykk. Faktisk ble bassenget ved runde 6 anriket for peptider som vises på overflaten av bakterier som fortrinnsvis binder seg til A549-celler (figur 1B). Seksti individuelle kloner av bakterier fra denne pool ble valgt og dyrket i det neste trinn av analysen.
(A) Skjematisk representasjon av peptider screening og valg med bakteriell display-bibliotek. 1. Konstruert biblioteket ved å transformere plasmidene inn
E.coli
MC1061; 2. Kasserte bakterier bindende med normale celler etter pre-inkubasjon; 3. inkuberte blanding av kreftceller og gjenværende bakterier; 4. analysert bindende virkning av kreftceller med bakterier ved hjelp FACS; 5. Sortert bindende bakterier til kreftceller ved flowcytometri og dyrket bindende bakterier i medium; 6. Utført neste runde bindende bakterier screening; 7. Isolert bindings bakterier til kreftceller og sekvensert peptidene som vises på overflaten av bakteriene. (B) Fremdriften for anriking av bakterier bindende med kreftcellene ved FACS i 6 screeningrunder.
2. Identifisering av Monoklonale Peptide-fluorescerende Bakterier med høy Binding Efficiency
De monoklonale peptid-fluorescerende bakterier med høy binding effektivitet ble identifisert fra 60 kloner for videre eksperimenter. Før klonene ble sendt til sekvensering, brukte vi FACS å sammenligne binding effektiviteten av bakterier til HLF og A549 celler. Etter inkubasjon med induserte, monoklonale peptid-fluoriserende bakterier, prosentandelen av de fluorescerende celler til hele celler representerte bindingen frekvensen av peptider på overflaten av bakterier med klonale celler. Resultatene indikerte at bindingen frekvensen av alle bakterier fra disse 60 klonene var omkring 10% -80% for A549-celler, mens det var mindre enn 5% for HLF-celler (data ikke vist). Sammenlignet med de med 20% bindende rente, peptider-fluorescerende bakterier med 80% binding kan ha høyere affinitet til cellene. Bindingen frekvensen av de monoklonale peptid-fluorescerende bakterier (klone 4) med den høyeste bindingsutbyttet var 80% av A549 celler og 0,4% for HLF-celler (Figur 2). Sekvenseringsresultatene viste at syv unike klonede sekvenser ble oppnådd fra 60 kloner (tabell 1). Det var ingen konservert sekvens observert i alle disse kloner.
Binding brøkdel av A549 celler med bakterier (show i oransje gate) var 80%, og at av HLF celler var 0,4%.
3. Evaluering av Binding spesifisiteten av monoklonale Peptide-fluorescerende Bakterier
Identifiseringen av et lite sett med peptid-fluorescerende bakterier som kan skille de A549 celler fra HLF cellene reiser et spørsmål om hvorvidt disse peptid-fluorescerende bakterier kan bind også med andre celletyper. For dette formål bestemmes vi å undersøke den relative bindingspotensial av alle de peptid-fluorescerende bakterier til flere cellelinjer. Vi først bestemt celletype spesifisitet ved å måle bindingsaktiviteten til alle de peptid-fluorescerende bakterier på et panel av ubeslektede cellelinjer. Vi har funnet at noen av de syv peptid-fluorescerende bakterier ikke ble bundet til andre humane carcinom celletyper, inkludert leveren (HepG-2), laryngeal (Hep-2), cervical (Hela) og brystkreft (MCF-7) karsinomceller. Resultatene fra observasjon av fluorescerende mikroskop og strømningscytometer på vedlagte og frigjorte celler verifisert bindingen spesifisiteten til de peptid-fluoriserende bakterier. Figur 3 viser den typiske resultatene av peptid-fluoriserende bakterier som hadde den høyeste bindingseffektivitet til A549-celler (klon 4). Videre bakterier med bare CPX scaffoldprotein kunne ikke binde med A549-celler, noe som medførte peptider som presenterer på overflaten av bakteriene mediert binding arrangementet mellom bakterier og A549-celler. Mer oppmerksomhet må rettes mot andre lungekarsinom celler f.eks H460. Våre resultater viste at de monoklonale peptid-fluorescerende bakterier ikke kunne gjenkjenne H460 celler -En annen cellelinje også tilhører den kategorien av ikke-småcellet lungekreft, som innebar at de monoklonale peptid-fluorescerende bakterier har mulighet til å gjenkjenne ulike sjangere av lunge kreftceller.
(A) fluorescens mikroskop bilder av bakterier kloner inkubert med celler. A549
△ ble inkubert med CPX bare bakterier og andre celler ble inkubert med utvalgte monoklonale peptid-fluoriserende bakterier, målestokken var 20 um. (B) FACS resultatene av ulike celler bindende med monoklonale peptid-fluorescerende bakterier på forholdet 1:100. (C) Prosent av binding fraksjon av monoklonale peptid-fluorescerende bakterier med forskjellige celler fra FACS data. Data var gjennomsnitt ± standardavvik av minst tre uavhengige eksperimenter.
4. Opprettholdelse av bindingsevnen av peptid-fluorescerende Bakterier med tumorceller for Clinical Application
En fiksering metode var nødvendig for å opprettholde den bindende spesifisitet og effektivitet av bakterier i celler for mer omfattende anvendelser. Gjennom å sammenligne den bindende virkning av bakterier med celler etter bakterier ble fiksert med etanol, metanol, aceton og 4% paraformaldehyd, valgte vi paraformaldehyd som fiksering reagens for videre studier. Selv om de faste bakteriene fremdeles holdt evnen til å binde til celler, bindingseffektivitet av faste bakterier var lavere enn for friske bakterier. For å få en sammenlignbar bindende virkning for de faste bakterier, økte vi forholdet mellom bakterier til celler fra 100:1 til 500:1. Resultatene er vist i figur 4A og S1 indikerte at faste bakterier fortsatt opprettholdes bindingen spesifisitet. Dessuten, etter sammenligning med negative kontrollceller, ikke-tumorcellelinje (HLF) med noen tumorcellelinjer (H460 og Hep-2), bindingsspesifisiteten av faste bakterier var bedre enn for friske bakterier. Deretter undersøkte vi endre på bindingen effektiviteten av faste bakterier etter tid forfalle. I dette eksperimentet, målene vi valgte var friske bakterier, fersk faste bakterier (dag 1) og faste bakterier som er lagret i 7 dager og 30 dager. Resultatene (figur 4B, 4C og 4D) viste at de faste bakteriene fremdeles holdt en høyere bindingseffektivitet med celler, selv etter å ha blitt lagret i 30 dager, noe som indikerte at faste fluorescerende bakterier kan brukes til å oppdage A549-celler, selv etter å ha vært lagret i lengre en lang tid.
(A) Prosent av binding fraksjon av frisk og fast monoklonale peptid-fluorescerende bakterier med forskjellige celler fra FACS data. Celler som bindes til friske bakterier (svart) ved forholdet 1:100 og forpliktende faste bakterier (grå) på forholdet 1:500. (B) De fluorescens mikroskop bilder av A549 celler Ruge med friske bakterier og faste bakterier på forholdet 1:500, på dag 1, dag 7 og dag 30 etter fiksering og målestokken var 20 mikrometer. (C) FACS Resultatene av A549 celler bindende med friske og faste monoklonale peptid-fluorescerende bakterier på forholdet 1:500 ved ulike tidspunkt. (D) Prosent av binding brøkdel av friske og faste monoklonale peptid-fluorescerende bakterier med A549 celler fra FACS dataceller bindende med friske bakterier og faste bakterier på forholdet 1:500 ved ulike tidspunkt. Data var gjennomsnitt ± standardavvik av minst tre uavhengige eksperimenter.
5. Påvisning av A549 svulstvev fra mus Xenotransplantat med Peptide-fluorescerende Bakterier
Etter inkuberes svulstvev i A549 mus xenograft med induserte monoklonale peptid-fluorescerende bakterier (klone 4 og CPX only), tumor delen i xenograft slippes grønn fluorescens fordi peptider på overflaten av fluorescerende bakterier kunne gjenkjenne tumorcellene. Imidlertid vev seksjon tilstøtende til tumoren del inkubert med klon 4 peptid-bakterier og tumor seksjon inkubert med CPX bare bakterier ikke avgir fluorescens-signaler (figur 5). Disse resultatene kan reproduseres med faste peptid-fluorescerende bakterier (data ikke vist).
Målestokk var 20 mikrometer. Data var representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
I vår studie, spesifikke bindings peptider for lungekreft celler ble identifisert med bakterier på overflaten visningsmetoden. Det var ingen konserverte sekvenser for de peptider som indikerte at disse peptider kan samhandle med forskjellige proteiner på overflaten av tumorceller. Selv om disse peptidene kan brukes som mål molekyler for diagnostisering og behandling av kreft, i denne studien, prøvde vi å undersøke mulighetene for fluorescerende
E. coli
MC1061, som hadde spesifikke peptider på overflaten, direkte jobbet som diagnostiske reagenser. Resultatene fra
in vitro
eksperiment viste at de utvalgte bakterier med peptider på overflaten kunne spesifikt binde med A549 celler med høy affinitet, uavhengig av om cellene var festet eller frittliggende. Evnen til peptid-fluorescerende bakterier for å gjenkjenne visse tumorceller ble bekreftet ved mus tumor xenograft eksperimenter. Med resultatene fra de
in vitro
eksperimenter, ble en ny metode utviklet for første gang til å oppdage lungekreft celler direkte med fluoriserende bakterier. Tatt i betraktning sokkelen tid og sikkerhet av bakterier, manipulering av levende bakterier som var nødvendig for deres videre anvendelse. Gjennom å sammenligne virkningen av forskjellige fiksering reagenser (etanol, metanol, aceton og 4% paraformaldehyd), ble 4% paraformaldehyd valgt som den beste fiksering reagens. Bakteriene faste med denne reagens kunne opprettholde en høy bindingseffektivitet og spesifisitet til cellene i minst en måned.
I klinisk praksis og benk arbeid, det meste av tiden, bilde teknologi ble brukt for diagnose av lungekreft. Mange bilde molekyler allerede har klinisk og subklinisk bruk, for eksempel, funksjonelle radioaktive molekyler for PET avbildning [26], nye magnetiske materialer for MR avbildning [27], nye materialer for ultralydavbildning [28] og PET /MR avbildning [29 ]. Selv det er allerede rapporter om bakterien som en bioluminescent bildedannende reagens i diagnose [30], men dens anvendelse er begrenset på grunn av mangel på presisjon, følsomhet og luminescerende styrken av denne bildedannende reagens. Vårt nye system kan hjelpe oss til ikke bare å diskriminere lungekreft celler fra andre celler, men også for å bestemme sjangeren lungekreft celler, noe som gjør denne metoden mer nøyaktig for diagnose. I dag metoder som brukes klinisk for å bestemme genre av celler inkluderer Hematoxylin og eosin farging (H & Co. E flekk) [31] og immunhistokjemi [32], men disse to metodene er mer kompliserte, kostbare og subjektive sammenlignet med vår nye metode . Med lav investering (bare en fluorescerende mikroskop nødvendig) og kort forberedelsestid av prøver, gir vår metode en ny supplerende måte for å gjøre raske og presise avgjørelser om hvorvidt svulster er godartet eller ondartet, der er på kanten av svulsten seksjon og selv hva sjanger av svulst pasienten har under kirurgiske operasjoner [33], [34].
Vår studie presentert en ny metode for å oppdage lungekreft celler direkte med peptid-fluorescerende bakterier som selvlysende reagenser
in vitro
. Denne metoden har fordeler av lav pris, enkel innkjøp, enkel ytelse, kort tid forberedelse og objektivitet. Men tiden vi ikke kunne belyse den detaljerte molekylære mekanismen om forpliktende hendelsen mellom peptider og celler. Videre har vi fortsatt trenger flere kliniske prøver for å bekrefte gyldigheten av systemet vårt. Selv om, fra dagens eksperimentelle resultatene, mener vi at denne metoden har stort potensial som en ny kliniske diagnostiske midler. I fremtidige studier, er støtte fra masse eksperimentelle data som trengs for å fremme oversettelse av denne metoden fra benken til klinikken.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
FACS resultatene av ulike celler bindende med faste monoklonale peptid-fluorescerende bakterier på forholdet 1:500.
doi: 10,1371 /journal.pone.0054467.s001 plakater (TIF)
Takk
Vi takker Dr Vittorio De Franciscis og Laura Cerchia for å gi A549 mus svulst xenograft prøver på parafin lysbilder. Vi takker Dr Biliang Zhang og Haiyan Liu for å gi cellelinjer.
