Abstract
Drug motstand er en utfordring i kjemoterapi og har tiltrukket forskning interesse over hele verden, og særlig oppmerksomhet har blitt gitt til naturlige forbindelser for å overvinne dette problemet. Pulchrin A, en ny forbindelse isolert fra naturlige produkter har vist ny potensiale for utvikling som et medikament. Identifiseringen av pulchrin A ble utført ved anvendelse av flere spektroskopiske teknikker slik som kjernemagnetisk resonans, væskekromatografi massespektrometer, infrarød og ultrafiolett spektroskopi. De cytotoksiske virkninger på CAOV-3-celler indikerer at pulchrin A er mer aktiv enn cisplatin, som har en IC
50 av 22.3 uM. Vesentlige endringer i cellemorfologi var til stede, for eksempel cellemembranen blebbing og dannelse av apoptotiske legemer. Involvering av fosfatidylserin (PS) i apoptose ble bekreftet av Annexin V-FITC etter en 24 timers behandling. Apoptose ble aktivert gjennom den intrinsiske reaksjonsvei ved aktivering av procaspases 3 og 9, samt spaltede caspaser 3 og 9 og endte på skarp vei, med forekomst av DNA ladde. Apoptose ble ytterligere bekreftet via gen- og protein ekspresjonsnivåer, hvori Bcl-2-protein ble nedregulert og Bax protein ble oppregulert. Videre ble det CAOV-3 cellesyklus forstyrret ved G0 /G1 fase, som fører til apoptose. Molekylær modellering av Bcl-2-protein viste en høy bindingsaffinitet, som hemmet funksjon av Bcl-2-proteiner og førte til celledød. Resultater av denne studien kan belyse utviklingen av nye terapeutiske midler, særlig, menneske eggstokkreft behandlinger
Citation. Nordin N, Fadaeinasab M, Mohan S, Mohd Hashim N, Othman R, Karimian H, et al. (2016) Pulchrin A, en New Natural Kumarin deriverte av
Enicosanthellum pulchrum
, induserer apoptose i eggstokkreft celler via indre vei. PLoS ONE 11 (5): e0154023. doi: 10,1371 /journal.pone.0154023
Redaktør: Yi-Hsien Hsieh, Institutt for biokjemi og bioteknologi, TAIWAN
mottatt: 26 desember 2015; Godkjent: 07.04.2016; Publisert: 02.05.2016
Copyright: © 2016 Nordin et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Universitetet i Malaya henhold PPP stipend (PG151-2012B) og departementet for høyere utdanning Malaysia henhold High Impact stipend (UM -MOHE UM.C /625/1 /HIR /Mohe /SC /09)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en sykdom som påvirker vesentlig den menneskelige befolkning i verden [1]. Omtrent, er halvparten av alle menn og mer enn en tredjedel av alle kvinner diagnostisert med kreft i løpet av livet. I mellomtiden, en fjerdedel av voksne dør på grunn av kreft [2]. Data utarbeidet av International Agency for Research in Cancer (IARC) på kreft registrering og dødelighet viser at nesten 12,6 millioner nye krefttilfeller ble rapportert i 2008 alene i verden [2]. Ifølge National Kreftregisteret Malaysia [3], ble totalt 8,123 (44,6%) menn og 10 096 (55,4%) kvinner beboere diagnostisert med kreft i Peninsular Malaysia i 2007.
I mellomtiden, totalt 239,000 nye tilfeller på verdensbasis ble registrert for eggstokkreft [4]. Eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreft hovedsakelig på grunn av mangel på spesifisitet og symptomer biomarkører som er tilgjengelige for påvisning under de tidlige stadier av sykdommen. I de fleste av eggstokkreft tilfeller ble sent stadium diagnose ofte oppdages hos pasienter som ikke var i stand til å effektivt svare på behandlingen. Vanligvis disse pasientene har en 5-års overlevelse, men denne prisen er redusert til 20-30% [5-7]. Behandling av pasienter med ovarialcancer er basert på standardprotokollen, hvorved kirurgi er den første behandlingen etterfølges av kjemoterapi. Tre forskjellige legemidler som vanligvis brukes til å behandle kreft i eggstokkene er doxorubicin, carboplatin og taxan. Men disse stoffene er ofte mindre effektive hvorved pasienter kan utvise resistens mot det administrerte medikamentet [8]. Disse ulemper har ført forskerne til å utforske potensielt effektive alternative forbindelser som behandling av eggstokkreft.
Kumarin og dets derivater hører til laktonet familien omfatter benzopyrone skjelett rammeverk, som kan finnes utbredt i naturen [9]. Kumarinderivater har blitt funnet å vise betydelige terapeutiske og forskjellige biologiske aktiviteter [10, 11] som er nyttig i fotokjemoterapi, antitumorterapi og anti-HIV-behandling [12, 13]. De kan anvendes som sentralnervesystem (CNS) stimulerende [14], antibakterielle midler [15, 16], antifungale midler [17, 18], anti-inflammatoriske [19], antikoagulanter [20], tuberkulostatika [21] og fargestoffer [22]. Noen av kumarin-derivater har også blitt rapportert som bindemiddel og smaksmidler. Imidlertid har USAs Food and Drug Administration (FDA) regulert bruken av kumarin som tilsetningsstoffer i mat [23-25]. Potente antibiotika avledet fra kumarin, slik som novobiocin, coumaromycin og chartesium er kommersielt tilgjengelige [26]. I denne studien ble det en ny kumarin derivat isolert for første gang fra naturlig produkt,
Enicosanthellum pulchrum
. En lang alkylgruppe var koblet til heterosykliske kumarin ring for å undersøke dens potensial som lovende antikreftmiddel mot den menneskelige eggstokkreft cellelinje CAOV-3 ved lave konsentrasjoner innen 24 timer.
Materialer og metoder
eksperimentell
H silikagel ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich, mens silikagel 60 (230˗400 mesh), dimetylsulfoxide (DMSO), metanol (MeOH), etanol (EtOH),
n
heksan og etylacetat (EtOAc) ble kjøpt fra Merck Co. (Tyskland). 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT-reagens) ble levert av Invitrogen (Carlsbad, USA). RPMI-1640-medium (pH 7,4), penicillin /streptomycin og føtalt bovint serum (FBS) ble anskaffet fra Nacalai Tesque (Japan) og Trypsin-EDTA 10X ble levert av BioWest (USA). Den ultrafiolett (UV) spektra og infrarøde (IR) spektra ble registrert på et UV-spektrofotometer (UV-1601 Shimadzu, Japan) og FT-IR-spektrometer spektrum RXI (Perkin Eimer, USA), henholdsvis. Kjernemagnetisk resonans (NMR) spektra ble registrert på et Bruker 600 MHz (Sveits) spektrometer. Optisk rotasjon ble utført i Jusco (Tokyo, Japan). Massespektra ble registrert for elektronspray ionisering (ESI) massespektrometri med IT-TOF fra Shimadzu, Japan. Væskekromatografi (HPLC) analyse ble også gjennomført.
Utarbeidelse av anlegget utvinning
Roots av
E
.
pulchrum
ble samlet i september 2011 på fjellskogen av Cameron Highlands (Pahang, Malaysia). Direktøren for Stry Department of Pahang, Malaysia ble gitt tillatelse til å gå inn og samle prøvene [27]. Anlegget ble identifisert av den avdøde professor dr Kamarudin Mat Salleh fra Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM). Prøven (SM769) ble plassert på Botany Department Herbarium, Fakultet for naturvitenskap og teknologi, UKM (Bangi, Malaysia). Røttene ble lufttørket og malt til 40-60 mesh partikkelstørrelse. Ekstraktene ble oppnådd ved maserasjon i
n
heksan løsemiddel. En roterende fordamper (Buchi, Sveits) ble anvendt for å fjerne løsningsmidlene fra prøvene.
Utvinning og isolering av pulchrin A
For rensing av pulchrin A, heksan ekstrakt ble separert ved kolonnekromatografi (CC) ved anvendelse av silikagel typen 60 (230-400 mesh). Den løsningsmiddelsystem ble anvendt for å separere forbindelsene i gradienten kolonne fra mindre polar for de fleste polare (heksan-EtOAc-MeOH). Totalt 157 fraksjoner ble oppsamlet under anvendelse av et 20 mL hetteglass. I alt 12 fraksjoner ble oppnådd, basert på retensjonsfaktor av hver forbindelse ved hjelp av tynnsjikt-kromatografi (TLC) analyse. Fraksjon 3 (A9-A12) ble ytterligere renset ved anvendelse av prep-TLC. En ny forbindelse ble vellykket skilt med
n
heksan-EtOAc (8: 2) løsemiddelsystem. Forbindelsen referert til som pulchrin A ble undersøkt ved NMR, mens renheten av pulchrin A ble bestemt ved hjelp av HPLC ved anvendelse av 10% til 100% acetonitril (v /v) gradienteluering i løpet av 15 minutter ved en strømningshastighet på 0,5 ml /min.
strukturoppklaring Analyser
Nuclear Magnetic Resonance spektroskopi (NMR).
i korte trekk, pulchrin A ble analysert ved NMR å undersøke tilstedeværelsen av proton og karbonatomer gjennom 1D (
1 H og
13C) og 2D (COSY-45, HSQC og HMBC) eksperimenter. Forbindelsen ble fremstilt ved oppløsning med deuterert kloroform (CDCh
3) i NMR-røret. Før analyse ble NMR-rør plassert i NMR-spektrometeret for videre behandling.
massespektroskopi (MS).
Massespektroskopi er i hovedsak for å bestemme molekylvekten av pulchrin A. Analysen ble foretatt anvendelse av LCMS-IT-TOF instrument. Pulchrin A ble oppløst i MeOH før injisering inn i instrumentet. Massespekteret ble spilt inn på den positive og negative modus.
Fourier Transform-infrarød spektroskopi (FT-IR).
Fourier Transform-infrarød spektroskopi (FT-IR) ble utført for å påvise tilstedeværelse av funksjonell gruppe i pulchrin A. forbindelsen ble oppløst i CHCb
3 og slippes ned på natriumklorid (NaCl) pellet. Før analyse ble pelleten plassert i FT-IR-instrument. Resultatet ble spilt inn på opptaket av 500-4000 cm
1.
Ultrafiolett spektroskopi (UV) og optisk rotasjon.
Pulchrin A ble oppløst i MeOH før de blir overført til en cuvet. De wavelenghts som brukes til å påvise tilstedeværelsen av atomer, varierte fra 190 nm til 800 nm. Absorpsjonen ble deretter tatt opp med et UV-spektrofotometer. Resultatene ble uttrykt i form av en absorpsjonsspektrum. I mellomtiden ble totalt 0,05 M pulchrin A oppløst i CHC
3 og overført til en Jasco P-1020 polarimeter. Temperaturen på å måle den optiske dreining var 24 ° C.
Cytotoksisitet assay
to humane eggstokkreft celler (CAOV-3 og SKOV-3) opprinnelig ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC , Manassas, USA). Udødeliggjort menneskelige eggstokkene epitelceller (T1074) ble oppnådd fra Applied biologisk materiale (ABM
® Crestwood Place Richmond, Canada). Disse cellelinjene ble dyrket i vårt laboratorium institusjon. Alle celler ble dyrket og dyrket i 25 ml kolbe inneholdende RPMI-1640 medium (CAOV-3 og SKOV-3) og Prigrow en medium (T1074) [28], supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin. Konfluente celler ble deretter vasket med PBS før de ble høstet med trypsin-EDTA-oppløsning 10X. De høstede celler ble sentrifugert ved 1800 rpm i 5 minutter og fortynnet til 1 x 10
6 celler /ml celler. Assayet ble utført i en 96-brønners plate inneholdende 1 x 10
4 celler /brønn. Før behandling, totalt 1 x 10
4 ug /ml pulchrin A ble fremstilt ved tilsetning av 1,0 mg av forbindelsen i 100 ul DMSO. De CAOV-3-celler ble behandlet med pulchrin A ved en konsentrasjon på 50 ug /ml til 0,78 pg /ml ved to-ganger seriefortynning. Cellene ble deretter inkubert ved 24, 48 og 72 timer. Før måling, MTT-løsning (20
μ
L) ble tilsatt i hver brønn og inkubert i 3 timer. Platen ble tatt opp ved en absorbans på 570 nm ved anvendelse av en mikroplateleser. Resultatet ble angitt som IC
50 verdi, der cisplatin (IC
50: 30,6 mm). Ble brukt som positiv kontroll i studien
Acridine oransje /propidiumjodid (AO /PI) dobbel farging analysen
AO /PI dobbel farging analysen ble utført i henhold til standard prosedyre som brukes for fluorescens mikroskopi (Lieca med Q-Floro programvare). Analysen ble utført i en 25 ml kultur kolbe (Nunc), hvorved CAOV-3 og T1074-celler ble eksponert med pulchrin A (22 pM) ved 24, 48 og 72 timer. Før farging ble de høstede cellene ble vasket med PBS. Totalt 10
μ
L av AO og PI (10
μ
g /ml) ble tilsatt til cellepelleten. Cellene ble observert i løpet av 30 minutter under en UV-fluorescerende mikroskop (Olympus BX51) for å evaluere de morfologiske endringer før fluorescensen fading.
Annexin V-FITC-assay
Virkningen av pulchrin A i løpet den innledende fasen av apoptose ble analysert ved hjelp av fluoresceinisotiocyanat (FITC) Annexin V apoptose Detection Kit i (BD Pharmingen
™). De CAOV-3-celler ble dyrket i en 6-brønns plate og behandlet med pulchrin A (22 uM) i 24, 48 og 72 timer. Cellene (5 x 10
4 celler /ml) ble deretter oppsamlet ved sentrifugering ved 1600 rpm i 5 min. En samlet mengde av 100 ul av hver prøve ble overført til et rør inneholdende 5 ul av FITC Annexin V og 10 ul av PI. Suspensjonen ble forsiktig blandet og tilsatt med 100 ul av 1 x assaybuffer. Deteksjon ble utført ved hjelp av en flowcytometer (BD FACSCanto
™ II, San Jose, CA, USA)
Kolorimetriske caspases analyse
cysteinyl asparaginsyre-protease (Kaspaser) -3,. – 8 og -9 analysene ble utført ved bruk av et kommersielt sett (kaspaser 3, 8 og 9 kolorimetrisk analyse: R hver syklus besto av 2 min av revers transkriptase ved 50 ° C, 20 sek av polymerase-aktivering ved 95 ° C, en sec av denaturering ved 95 ° C og 20 sek av hybridisering ved 60 ° C. Prosessen ble avsluttet etter 40 sykluser av lesing. Data ble deretter beregnet basert på komparative Ct (2-ΔΔCt) standard metode beskrevet i studien av Wong og Medrano (2005) [29].
Western blot analyse
CAOV-3 cellene ble sådd i en 75 ml kultur kolbe og behandlet med pulchrin A (22 pM) ved 24, 48 og 72 timer. De høstede celler ble sentrifugert ved 13.000 opm i 10 s og 400 ul av PRO-PREP
™ oppløsning ble tilsatt for å resuspendere cellene. Cellene ble indusert for lysering av inkubasjon ved -20 ° C i 20 min. Før separasjon ved 10% SDS-PAGE, 100 ug protein ble porsjonert ut og blandet med lasting fargestoff. Gelen ble tillatt å løpe i 90 minutter før den ble overført til en polyvinylidenedifluoride (PVDF) membran (Bio-Rad). PVDF-membranen ble blokkert i 3 timer med 5% BSA. Det primære antistoff til
β
p-aktin (1: 1000), Bax (1: 1000), Bcl-2 (1: 1000), Survivin (1: 1000), caspaser 3 og 9 (1: 1000 ) og spaltes caspases 3 og 9 (1: 1000) ble konjugert med et sekundært antistoff (geit pAb til RB IgG). Prosessen fortsettes i en time inkubering ved romtemperatur. Den bundet antistoff ble påvist ved hjelp av en kolo deteksjon kit og utsatt i flere minutter for å la utseendet av bandene. PVDF membran ble sett og fotografert ved hjelp av en UV-lys transilluminator.
Protein profil rekke
CAOV-3 celler behandlet med Pulchrin A (22 mm) ble evaluert for apoptotiske proteinmarkører ved hjelp av Proteome Profiler Array (RayBio
® Menneskelig apoptose antistoff Array Kit, Raybiotech, USA), i samsvar med produsentens protokoll. Ekstrahert protein (200 ug /ml) fra CAOV-3-celler ble tilsatt i hver brønn inneholdende membranen og fikk stå over natten ved 4 ° C for inkubasjon. De vaskeprosedyre som bruker vaskebuffere I og II ble henrettet for hver inkubasjon. Før detektering, ble membranen tilsatt med et biotinylert antistoff cocktail og deretter med HRP-streptavidin for inkubering over natten. I alt 500 pl av deteksjonsbufferen ble pipettert på membranen. De klemt membraner ble overført og utsatt for chemiluminescence imaging system og deretter fotografert (Biospectrum AC Chemi HR 410, UVP, Cambridge, UK).
Cellesyklus analysen
De behandlede celler med pulchrin A ble oppsamlet og deretter vasket to ganger med PBS ved sentrifugering 1800 rpm i 5 minutter. Cellene ble fiksert med en fikseringsløsning ved å tilsette 700 ul av 90% kald EtOH og holdt over natten ved 4 ° C for å gjenopprette celler integritet. EtOH ble deretter kastet og renset med 600 ul av PBS ved sentrifugering ved 1800 rpm i 5 min. Totalt 25 ul RNaseA (10 mg /ml) og 50 ul av propidiumjodid (PI) (1 mg /ml) ble blandet til de fikserte celler og inkubert i 1 time ved 37 ° C. Analyse av DNA-innhold for cellesyklus arrest ble utført av flowcytometri (BFACSCanto
™ II).
Protein-bindende interaksjon
Denne studien ble utført ved hjelp av anti-apoptotiske proteiner Bcl- 2 i samarbeid med the standard Bcl-2 inhibitor ABT 737 [30]. Den BCL-2 tredimensjonal krystallstruktur ble innhentet fra RCSB Protein data Bank [31, 32] med 4IEH PDB id [30]. Den automatiserte dokking programvare (Autodock 4,2)-programmet ble anvendt for å beregne dokking av små molekyler, basert på den Lamarckian genetisk algoritme [33]. Vannmolekyler ble fjernet for utarbeidelse av proteinmolekyler. Polare hydrogenatomer ble tilsatt i strukturen, mens ikke-polare hydrogenatomer ble slått sammen. I tillegg ble Gasteiger avgifter og solvatisering parametere tildelt som standard. Ved å bruke AutoGrid 4,2 programvare, ble risten parameterfilen innstilles ved hjelp av verdiene for x, y og z-akser; rutenettet avstanden var til 0.375 Å, standardverdien. Samspillet bindingsenergien ble også beregnet ved hjelp av Autodock 4,2 programmet.
Statistisk analyse
IC
50 verdier ble bestemt ved hjelp av GraphPad Prism ver. 4.0 (Graphpad Software Inc, USA). Hver test ble utført i tre paralleller, og verdiene ble rapportert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Ved å bruke SPSS ver. 17,0 (IBM Corporation, USA), en-veis ANOVA med Dunnetts test ble brukt til å analysere data for statistisk signifikans. I mellomtiden ble kvantitative analyser av proteiner perfomed hjelp ImageJ programvare.
Resultater
Struktur Identifikasjon av Pulchrin A
En ny naturlig kumarin derivat, pulchrin A (figur 1) ble belyst ved hjelp av komplett NMR spektra (tabell 1), samt UV, IR og ESI massespektrometri (S1-S7 figurene).
HMBC sammenheng er markert med røde og blå piler angitt som
J
2 og
J
3, henholdsvis, mens COSY sammenhenger i svart pil farge
White olje.; Utbytte: 0,005%, [α] -16 (
c
0,05; CHCI
3). TLC: (
n
heksan: EtOAc, 80:20 v /v): R
f = 0,56. UV (MeOH) λ
max (log €): 356 (3,80), 315 (4,03), 280 (4,32) nm. IR ν
max (CHC
3); 2921, 2853 (CH), 1759 (OC = O), 1463 cm
-1. HRESIMS m /z [M + Na] 465,3240 (10), 338,3380 (90), 339,3430 (60) (beregnet for C,
30H
50O
2, 442,7066).
1 H NMR (CDCh
3, 600MHz) δ ppm: 0,89 (3H,
m
, H-21), 1,25 (2H,
m
, H-18) , 1,28 (14H,
m
, H-11, H-12, H-13, H-14, H-15, H-16, H-17), 1,29 (2H,
m
, H-6′), 1,30 (2H,
m
, H-19), 1,32 (2H,
m
, H-20), 1,34 (2H,
m
, H-7 «), 1,43 (2H,
m
, H-8′), 1,51 (2H,
m
, H-2), 1,55 (2H
m
, H-10), 1,59 (2H,
m
, H-5 «), 2,02 (2H,
m
, H-9), 2,21 (2H,
m
, H-3), 2,25 (2H,
m
, H-1), 2,91 (2H,
m
, H-6), 2,93 (1H,
m
, H-4a), 4,90 (1 H,
m
, H-8a), 5,33 (1 H,
m
, H-7) , 5,35 (1H,
m
, H-8), 5,40 (2H,
m
, H-4, H-5), 6,98 (1 H,
m
, H-4 «).
13C NMR (CDCh
3, 150 MHz) δ ppm: 14,1 (C-21), 22,4 (C-20), 22,7 (C-18), 24,3 (C-3), 25,2 (C- 1), 26,6 (C-2), 27,2 (C-7 «), 27,4 (C-9), 27,9 (C-5»), 28,0 (C-10), 29,2 (C-6 «), 29,5 ( C-11, C-12, C-13, C-14), 29,6 (C-15, C-16, C-17), 29,7 (C-8»), 32,0 (C-19), 56,8 (C- 4a), 57,3 (C-6), 76,9 (C-8a), 128,3 (C-8), 129,8 (C-7), 131,0 (C-4, C5), 134,4 (C-3 «), 148,8 (C-4 «), 173,9 (C-2»).
cytotoksisk effekt av Pulchrin A
Tre cellelinjer ble testet, inkludert to eggstokkreft celler (CAOV-3 og SKOV- 3) og en immortalisert human normal ovarie epitelcellelinje (T1074) for å bestemme den cytotoksiske effekten av pulchrin A (tabell 2). I tillegg ble cisplatin også prøvet som positiv kontroll i denne studien (Fig 2). IC
50 Resultatene viste at pulchrin A inhiberte 50% av CAOV-3-celler vekst ved 22,31 uM, sammenlignet med 33,63 uM mot SKOV-3-celler etter 24 timers behandling. Den CAOV-3 og SKOV-3-celler ble ytterligere undersøkt for cytotoksiske effekter ved 48 og 72 timer, viser reduksjoner i IC
50-verdier som er vist i figur 2. I mellomtiden, de cytotoksiske effektene av pulchrin A oppviste sammenlignbare effekter sammenlignet med cisplatin i 24 timer mot CAOV-3 og SKOV-3-celler, som viste at pulchrin A som utøves høyere cytotoksisitet mot begge ovarie cancer-cellelinjer. I motsetning til dette ble en mindre cytotoksisk effekt mot T1074-celler funnet selv ved konsentrasjoner på mer enn 100 uM.
Eksperimentet ble utført i tre eksemplarer. Data er rapportert som gjennomsnitt ± SD.
Cytomorphology Evaluering av apoptose av AO /PI Double Farging
apoptotiske effekt av pulchrin A på CAOV-3 og T1074 cellene observert via morfologiske endringer i henhold til et fluorescens mikroskop. Den cytomorphology Evalueringen ble gjennomført i CAOV-3 celler på grunn av pulchrin A viste lav IC
50 konsentrasjon mot CAOV-3 celler sammenlignet med Skov-3 celler i cytotoksisitet analysen. Etter behandling i en konsentrasjon på 22 uM til 24, 48 og 72 timer, de CAOV-3-celler oppviste apoptotiske egenskaper sammenlignet med T1074 celler. Under ubehandlede betingelser, cellene oppviste en sunn avrundet form med en intakt atomstruktur. Den celler morfologi ble endret etter 24 timer med behandling i CAOV-3-celler med tilstedeværelse av cellemembranen blebbing og DNA-fragmentering. Omfattende celleskade kan tydelig observeres etter 48 timer og framover med tilstedeværelse av apoptotiske legemer og en rød-oransje farge, noe som indikerer at celler gjennomgikk apoptose sen (figur 3a). I motsetning til dette T1074 cellene viste ingen signifikant forskjell på cellemorfologi sammenlignet med ubehandlede celler T1074 mot apoptose prosess, noe som tyder på at pulchrin A var ufarlig for de normale ovarie-celler (figur 3b).
[A] Ubehandlet og behandlet -CAOV-3-celler med pulchrin A ved 24, 48 og 72 timers behandling. De CAOV-3-celler viste membrancelle blebbing så tidlig som 24 timer etter behandling. De følgende 48 timers behandling viste mer membrancelle blebbing og tilstedeværelse av apoptotiske legemer og cromatin kondens. Tilstedeværelsen av oransje flekker celler på 72 timer med behandling, som representerer kjennetegn på slutten av apoptose. [B] Ubehandlede og behandlede T1074-celler med pulchrin A ved 24, 48 og 72 timer fra behandlingen. De T1074 celler viste ingen signifikante forskjeller i cellene morfologi etter behandling med pulchrin A opp til 72 timer med behandling. VI, levedyktige celler; BL, blebbing av cellemembranen; CC, kromatin kondens; LA, sent apoptose; AB, apoptotiske legemer. (Forstørrelse 40 × og 100 ×).
Analyse av Membran Endring
Endringer i cellemembranen ble observert av Annexin V-FITC analyse utført ved bruk av en 25 ml kolbe cointaining CAOV-3 celler behandles med pulchrin A ved 24, 48 og 72 timer. Som vist i figur 4, og resultatene viste at CAOV-3-celler behandlet med pulchrin A ved 24, 48 og 72 timer gjennomgikk tidlig fase apoptose som antydet ved 5,3, 9,4 og 14,3% økning i kvantitet i en tidsavhengig måte, henholdsvis. Cellene som gjennomgikk sen fase apoptose og nekrose også øket i løpet av de første 24 til 72 timer etter behandling, i motsetning til de levedyktige celler, som viste en 92,5% til 40,5% reduksjon i cellepopulasjonen etter behandling.
[A] kontroll (ubehandlet), [B] 24 timer, [C] 48 h, [D] 72 timer. Mørk rød, blå, grønn og lys rød farge indikert levedyktig, tidlig apoptose, sent apoptose og sekundær nekrose, henholdsvis. Bevegelse av cellepopulasjonen ble startet i Q3 (levedyktige celler) i Q4 (tidlig apoptose) til Q2 (sent apoptose), og til slutt til Q1 (sekundær nekrose). [E] Histogram av cellepopulasjoner av levedyktig, tidlig apoptose, sen-apoptose og sekundær-nekrose CAOV-3 celler. Resultatene ble representert som gjennomsnitt ± SD for tre replikater. *
p
. 0,05 indikerer signifikant forskjell fra kontroll
Analyse av Kaspaser
Kaspaser 3, 8 og 9 ble testet for å bestemme apoptose trasé. Resultatene i figur 5 viser at caspases 9 og 3 ble aktivert av pulchrin En eksponering gjennom den iboende og gjennomføring veier henholdsvis. I motsetning til dette, caspase 8 viste uregelmessig verdier, som vist i stolpediagram, hvilket antyder at ingen aktivering av kaspase 8 ble detektert via stimulering av pulchrin A. Aktivering av caspaser 3, 8 og 9 ble også bekreftet ved mRNA-nivåer i hvilken bare caspaser 3 og 9 oppviste over-ekspresjon i forhold til caspase 8 på en tidsavhengig måte. Tilsvarende uttrykket nivåer av kaspase 3 og caspase 9 proteinene ble signifikant oppregulert (
p
0,05) i forhold til den for de ubehandlede CAOV-3-celler. I tillegg protein ekspresjon av spaltet kaspase 3 og spaltet caspase 9 øket under de tre forskjellige behandlingsperioder, noe som indikerer at induksjon av apoptose forekom via de indre og gjennomføringsforløp.
[A og B] Kolorimetrisk og real- time PCR-analyse av kaspaser 3, 8 og 9, henholdsvis. [C] Western blot analyse preget av bilder og histogram for pro-caspases og spaltet kaspaser. Resultatene ble representert som gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige eksperimenter. Den betydelige forskjellen er uttrykt som *
p
. 0,05
Analyse av mitokondrie Endringer
Denne studien ble utført for å undersøke involvering av mitokondriene i apoptose på pulchrin En behandling. De tre parametere av total atom intensitet, celle permeabilitet og cytokrom
c
frigivelse indikerte at fluorescensintensitet ble økt, slik som vist i figur 6. De fluorescensstyrkene disse tre parametrene økes ved konsentrasjoner så lave som 22 uM og betydelig forskjeller (
p
0,05) ble bestemt ved en konsentrasjon på 33 uM. I motsetning til dette fluorescens intensiteten av mitokondriemembranpotensialet (MMP) for de pulchrin A-behandlede CAOV-3-celler ble redusert på en konsentrasjonsavhengig måte. Det ble ikke observert signifikant forskjell mellom de behandlede og ubehandlede CAOV-3 celler i konsentrasjoner høyere enn 33 mikrometer når
p
. 0,05
Cellene ble farget med Hoechst, celle permeabilitet, mitokondriemembranpotensiale (MMP) og cytokrom
c
fargestoffer. Bildene på hver rad ble tatt fra samme felt. De CAOV-3 celler viste en reduksjon i celle nummer og MMP, mens celler behandlet med pulvhrin A på 24 timer (20 × forstørrelse) viste økninger i celle permeabilitet og cytokrom
c
utgivelse. Histogram representerer gjennomsnittsintensitet observert samtidig i CAOV-3 celler i en konsentrasjonsavhengig måte for total atom intensitet, celle permeabilitet, MMP og cytokrom
c
utgivelse. Alle data ble fastsatt som gjennomsnitt ± SD hvor signifikant forskjell ble uttrykt som *
p
0,05.
DNA Fragmentering analysen
Denne analysen ble utført for å bekrefte forekomst av sen apoptose i celler behandlet med pulchrin A. Tilstedeværelsen av en DNA-stigen på CAOV-3 celler ble observert etter 24 timer fra behandlingen (figur 7); det samme ble observert for den neste 48 og 72 timer. Dannelsen av DNA-stige påviste forekomst av DNA-fragmentering i CAOV-3-celler, noe som induserte apoptose
baner A-C.: Celler behandlet med pulchrin A for 72, 48 og 24 timer henholdsvis. Lane D: ubehandlede celler.
