Abstract
Eggstokkreft (OvCa) er den femte vanligste årsaken til død av alle krefttilfeller blant kvinner i USA sates og den ledende dødsårsaken fra gynekologiske kreftformer. Mens de fleste OvCa pasientene ved svare på kirurgisk debulking og kjemoterapi, 75% av pasientene senere gi etter for sykdommen. Dermed er det et presserende behov for å teste nye terapeutiske midler for å motvirke den høye dødeligheten i forbindelse med OvCa. I denne sammenheng har vi utviklet og konstruert Nanoceria (NCE), nanopartikler av ceriumoksid, som har anti-oksiderende egenskaper, som skal anvendes som et terapeutisk middel i OvCa. Vi viser for første gang at NCE signifikant inhiberte produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) i A2780 celler, svekkede vekstfaktor (SDF1, HB-EGF, VEGF
165 og HGF) mediert cellemigrering og invasjon av SKOV3-celler, uten påvirker celleproliferasjon. NCE behandling også hemmet VEGF
165 indusert spredning, kapillarrør formasjon, aktivering av VEGFR2 og MMP2 i menneskelige umbilical vaskulære endotelceller (HUVEC). Nce (0,1 mg /kg kropps veie) behandling av A2780 eggstokkreft celler injisert intra-peritonealt i nakne mus viste signifikant reduksjon (p 0,002) i tumorvekst ledsaget av redusert tumorcelle-proliferasjon som fremgår av redusert tumorstørrelse og Ki67 farging. Akkumulering av nce ble funnet i tumorer isolert fra behandlede gruppe ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og induktivt koblet plasma-massespektroskopi (ICP-MS). Reduksjon av tumormassen ble fulgt av dempning av angiogenese, som observert ved redusert CD31-farging og spesifikk apoptose av vaskulære endotelceller. Samlet indikerer disse resultater at ceriumoksid basert NCE er en ny nanopartikkel som potensielt kan brukes som en anti-angiogen terapeutisk middel in ovarian cancer
relasjon:. Giri S, Karakoti A, Graham RP, Maguire JL, Reilly CM, Seal S, et al. (2013) Nanoceria: A Rare-Earth partikler som Novel antiangiogen Terapeutisk Agent i eggstokkreft. PLoS ONE 8 (1): e54578. doi: 10,1371 /journal.pone.0054578
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 6 juli 2011; Godkjent: 13 desember 2012; Publisert: 31 januar 2013
Copyright: © 2013 Giri et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien er i hovedsak støttet av CA123249 og støtte fra Mayo Clinic College of Medicine i VS og delvis støttet av Marsh Rivkin bosatt på SG og RR. Dette arbeidet ble delvis støttet av NSF CBET, 0708172 og 0930170 til SS (for nanopartikkel utvikling i biomedisinske applikasjoner). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i USA er 27.000 kvinner nylig diagnostisert og ca 14 000 kvinner dør av OvCa årlig [1]. Slike høye dødelighet skyldes fleste pasientene (75%) som oppviser med avansert (stadium III eller høyere) sykdom ved tidspunktet for diagnose [2]. Mer enn 90% av pasientene har bedre prognose hvis kreften er oppdaget i de tidligste stadier. Behandling av ovarialcancer innebærer generelt kirurgisk debulking etterfulgt av kjemoterapi med en kombinasjon av platina og et taksan-inneholdende middel. Men flertallet av pasientene går igjen og til slutt gi etter for deres kreft. Det er derfor et stort behov for å utvikle nye behandlingsformer som kan være mer effektive i behandling av eggstokkreft og forsinke eller hindre gjentagelse. Nye behandlingsformer som er rettet mot eggstokkreft tumorigenesis er mye blitt forsket på, men vi har ennå ikke kommet opp med en lovende medikament.
Nanoteknologi baserte verktøy og teknikker er raskt voksende innen medisinsk bildebehandling og målrettet levering av legemidler. Ceriumoksid er et sjeldent jord oksyd som er funnet i lantanid-serien i det periodiske system. Nanocrystalline ceriumoksid (nanoceria) oppviser et blått skift i det ultrafiolette absorpsjonsspektrum, skiftende og utvidelse av Raman tillot moduser og gitter utvidelse i forhold til bulk ceriumoksid som indikerer dens unike egenskaper. NCE har dukket opp som en lukrativ materiale i biomedisinsk vitenskap på grunn av sin unike evne til å veksle oksidasjonstilstander mellom (III) og (IV) avhengig av miljøet. Muligheten til å veksle mellom blandede oksidasjons av nanoceria kan sammenlignes med biologiske antioksidanter. Dette formidler nanoceria med en svært viktig biologisk egenskap radikaler, dvs som kan være innstilt basert på oppbevaring av oksygen stillinger (defekter) og konsentrasjonen av CE3 + arter i nanoceria. Reversibel oksidasjonstilstanden er nøkkelen eiendommen i å gjøre nanoceria en kraftig antioksidant, og dermed redusere behovet for hyppig gjentatt dosering. Tidligere studier har vist at ceriumoksid nanopartikler har gode antioksidantegenskaper og virker som potente, regenerative fri radikal-utvaskere i biologiske systemer [3], [4], [5]. Disse regenererende antioksidantegenskaper skyldes delvis valensen strukturen av cerium atom kombinert med iboende defekter i krystallgitterstrukturen, som er forstørret på nano-skala. Det har blitt foreslått at den unike strukturen av konstruerte ceriumoksid nanopartikler, med hensyn til valens og oksygen defekter, fremmer celle lang levetid og reduserer giftige fornærmelser i kraft av sin antioksidant virkning som oppstår når nanopartiklene inn i cellene [6], hindrer akkumulering av reaktive oksygenarter (ROS) i cellen [3].
tumor angiogenese er karakterisert ved dannelsen av nye blodkar uregelmessig fra et forhåndsdefinert vaskulære nettverk. Dette unormal angiogenese er nødvendig for vekst, overlevelse, og metastasering av de fleste faste tumorer [7], [8]. Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er en av de viktigste pro-angiogene faktorer, som virker som et mitogen for vaskulære endotelceller
in vitro
og som en angiogen faktor
in vivo product: [9 ]. Det er over uttrykt i forskjellige humane cancere [10], [11], [12], [13], inkludert OvCa. Nylig har det blitt foreslått at ROS spiller en viktig rolle i regulering av tumorindusert angiogenese ved regulering av VEGF-produksjon. Forbedret produksjon av VEGF har vist seg å korrelere med et dårlig resultat for pasienter med både tidlig og avansert OvCa. Ulike anti-angiogene midler har vært og er under evaluering i eggstokkreft kliniske studier. En fase II studie av mono bevacizumab (et monoklonalt antistoff rettet mot VEGF) viste lovende resultater [14]. Derfor er VEGF signale blir fokus for anti-angiogen-rettet behandling i OvCa.
I denne studien har vi testet cerium oxide nanopartikler som et terapeutisk middel både
i
vitro Hotell og
in vivo
i OvCa celler. Våre data viser at NCE var i stand til å hemme vekstfaktor mediert, migrasjon og invasjon av SKOV3 celler, VEGF
165 indusert spredning, kapillarrør dannelse og aktivering av VEGFR2 og MMP2 i HUVEC celler. Enda viktigere NCE behandling hemmet tumorvekst
in vivo
ved å hemme angiogenese, spesielt ved å målrette vaskulære endotelceller.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
trypanblått, MTT 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl tetrazoliumbromid) og HB-EGF var fra Sigma. SDF1, VEGF
165 og HGF ble kjøpt fra R BD Biosciences). Serum-fritt cellesuspensjoner (500 ul) ble tilsatt til toppen av kammeret transwell. De nedre kammere inneholdt serumfritt medium inneholdende forskjellige vekstfaktorer, inkludert SDF1, HB-EGF, VEGF
165 og HGF i en konsentrasjon på 25 ng /ml. Celler invaderende det nedre kammer ble farget med 0,5% krystallfiolett (60% PBS, 40% EtOH) og tellet med et invertert mikroskop. Resultatene fra minst to uavhengige forsøk i tre eksemplarer presenteres
proliferasjonsanalyser
(i) MTT analyse.
2.5-5.0 × 10
4 celler sådd ut i 24 brønners plater i tre paralleller og behandlet med indikerte konsentrasjoner av NCE i 72 timer. MTT-analysen ble utført som beskrevet tidligere [19], for å fastslå antallet levende celler.
(ii) Tymidin inkorporering:
Proliferasjon av celler, ble også bestemt ved [
3H] -tymidin inkorporering i DNA som tidligere beskrevet [20]. I korte trekk, 2,5 til 5,0 x 10
4 celler ble sådd ut i 24 brønners plater i tre paralleller og behandlet med indikerte konsentrasjoner av NCE i 72 timer. Hver gruppe ble behandlet med 1 pCi av [
3H] tymidin i det samme medium i 6 timer. De adherente celler ble fiksert med 5% trikloreddiksyre og lysert i SDS /NaOH lyseringsbuffer. Radioaktivitet ble målt ved Beckman LS3801 væskescintillasjonsteller (Canada).
Colony Forming analyse
2000 celler ble sådd ut i tre paralleller i 6-brønners plater og behandlet med angitte konsentrasjoner av NCE. Cellene ble tillatt å danne kolonier i opptil 2-4 uker (avhengig av cellelinjen) og mediet ble byttet ut hver fjerde dag. Koloniene ble farget med MTT og telles som tidligere beskrevet [19].
Måling av ROS
ROS ble bestemt ved bruk av membran-gjennomtrengelige fluorescerende fargestoff 6-karboksy- 2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFDA) i serumfritt medium, som beskrevet tidligere [21], [22]. De dyrkede celler, med eller uten behandling med NCE, ble behandlet med 5 mikrometer DCF fargestoff i PBS og endring i fluorescens ble registrert ved eksitasjon 485 nm og emisjon 530 nm for ulike tidsperioden fra 10 til 60 minutter med en myk Max Pro spektrofluorometer ( Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
immunoblotanalyse
Etter fastsatt tid av inkubering i nærvær eller fravær av angitte mengder nce, immunoblotanalyse med spesifikke antistoffer ble utført som tidligere beskrevet [19 ], [20], [21], [22]. I korte, behandlede og ubehandlede HUVEC-celler med VEGF
165 (25 ng /ml) og /eller nce ved forskjellige tidsperiode (5-30 minutter) ble lysert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF og 0,5% Nonidet P-40] inneholdende en protease inhibitor cocktail (Sigma). 40 ug av proteiner ble oppløst ved SDS-PAGE og overført på nitrocellulose-membran. membranen ble deretter blokkert i 1 time i 5% fettfri tørrmelk TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl og 0,1% Tween 20, pH 7,5) og inkubert over natten i primære antisera (pVEGFR (Y1175), pVEGFR (Y951), VEGFR2 eller β actin) som inneholdt 5% fettfri tørrmelk eller 5% BSA i tilfelle av fosfo-antistoffer. Etter inkubasjon med HRP-konjugert sekundært Ab, ble blottene utviklet med ECL-deteksjonssystem (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
i vitro Vaskulær Tube Dannelse analysen
In vitro
tube formasjons ble utført som beskrevet av Melinda
et. al.
[23]. I korthet matrigel matrise ble jevnt belagt på 8-brønners kammerobjektglass (0,15 ml) og inkubert ved 37 C i 30 minutter. 2 x 10
5 /ml HUVEC-celler ble behandlet med NCE (25-50 um) og blandet med celler i nærvær eller fravær av VEGF
165 (25 ng /ml) og overført til hver brønn (200 ul ) belagt med matrigel. Platene eller objektglass ble inkubert ved 37 ° C i 16 timer og avbildes under et fasekontrast invertert mikroskop ved 10X objektiv forstørrelse.
Zymografi Assay
For MMP2 aktivitet, HUVEC-celler ble behandlet med VEGF
165 (25 ng /ml) i nærvær eller fravær av NCE (25-50 pM). Post 18 timer celle supernatant ble oppsamlet, sentrifugert ved 12.000 g og 25 pl volum ble blandet med 5 x SDS applikasjonsbuffer uten reduksjonsmiddel og løp på 10% Tris-glysin gel inneholdende gelatin. Gelen ble vasket to ganger i 1 time med renaturating oppløsning (2,5% tritonX100 i 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM CaCl, 1 mM ZnCl2) for å fjerne SDS og renaturere MMP’er. Etter skylling gel med avionisert vann, ble gelen inkubert over natten ved 37 ° C med buffer inneholdende 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM CaCl, 1 mM ZnCl
2. Neste dag, gel ble farget med 0,5% Coomassie G250 etterfulgt av de flekker å se MMP2 aktivitet i gel.
Dyr
Etikk uttalelse.
6-8 wk gamle kvinnelige nakne mus ble kjøpt fra National Cancer Institute-Fredrik Cancer Research and Development Center (Frederick, MD). Alle mus ble plassert og holdt under spesifikke forhold i anleggene på Mayo Clinic i Rochester, MN. Fasilitetene er godkjent og kontrollert av American Association for Akkreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC Akkreditering # 000717) og i samsvar med gjeldende regelverk og standarder for det amerikanske Department of Agriculture, US Department of Health and Human Services, og NIH. Alle studier ble godkjent og overvåket av Mayo Clinic Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) under protokollen nummer A11309. Etter tumorfremkallelse, ble musene overvåket daglig for tegn på noen nød. Regelmessige helsekontroller er også utført ved Mayo veterinær ansatte. Musene ble menneskelig ofret når svulsten byrden nådd mandatet vekt i ubehandlede mus.
Mus ble opprettholdt i henhold til Institutional IACUC-godkjent protokoll. 2 x 10
6/200 ul celler suspendert i PBS ble injisert i den intra-peritoneale hulrom (dag 0) på 6-7 uker gamle nakne mus som tidligere beskrevet [24]. Mus ble randomisert i to grupper. NCE behandling ved en dose på 0,1 mg /kg kroppsvekt begynte 3 dager etter inokulering av celler og ble gitt intra-peritonealt på alle 3
rd dag til slutten av studien. Kontrollgruppen fikk PBS-injeksjoner. Musene ble avlivet etter 4 uker og svulster ble fiksert i formalin for seksjonering. Blod ble oppsamlet i heparin-belagte rør for å oppnå plasma. Lever, nyre, hjerte og milt fra alle dyrene ble formalin-fiksert og prosessert. En svulst og orgel lysbilde fra hver mus ble farget med H . E
cytotoksisitetsassayer
Blodprøve ble tatt i heparin belagt rør like før musene ble ofret.. Plasma isolert fra blod av seks mus fra hver gruppe ble utsatt for analyse av et panel av leverfunksjonsprøver (ASAT, ALAT, albumin) og nyre funksjonstester (kreatinin, urea, albumin) som beskrevet før [24]. Alle analyser ble utført ved hjelp av kits fra Bioassay Systems følge produsentens instruksjoner (CA, USA).
Fastsettelse av NCE i vev.
På slutten av studien, ulike vev inkludert svulst, lever , milt og nyre fra nce behandlede gruppe ble plassert i 70% salpetersyre over natten for å starte fordøyelsen. Prøvene ble deretter mikrobølgeovn fordøyd. Temperaturen ble trappet til 200 ° C i løpet av 20 minutter og holdt der i ytterligere 20 min. Prøvene ble så kokt ned til mindre enn 1 ml hver, og rekonstituert i vann til et nøyaktig volum på 10 ml. Cerium nivåer ble vurdert ved hjelp av induktivt koplet plasma massespektroskopi (ICP-MS) som beskrevet tidligere [25].
For transmisjonselektronmikroskopi (TEM), ovarial tumor isolert fra NCE behandlet mus ble fikset i Trump fiksativ (1 % glutaraldehyd og 4% formaldehyd i 0.1 M fosfatbuffer, pH 7,2). Tumor ble innebygd i Spurr er harpiks og tynn (90 nm) snitt ble kuttet på en Reichert ULTRACUT E ultramicrotome, plassert på 200 mesh kobbernett og farget med bly citrate. Mikrobilder ble tatt på en Tecnai 12 opererer på 120KV.
IHC.
Faste svulster skåret ut fra mus ble behandlet for immunhistokjemi for CD31, Ki-67 og TUNEL (Millipore) som tidligere beskrevet [24 ]. H E farging ble utført ved Mayo immunhistokjemisk kjernefasiliteter. Ki-67 og H E seksjoner ble undersøkt under lysmikroskop og representative piktogrammer ble tatt fra 5 forskjellige lysbilder av hver gruppe. For CD31 flekker, ble TRITC-merket sekundært antistoff brukt og visualiseres ved hjelp av fluorescerende mikroskop. For dobbel farging ble lysbildene først behandlet for CD31 farging, etterfulgt av immunfluorescens TUNEL flekker, i henhold til produsentens instruksjoner.
Levende tumormålinger.
Maksimal diameter på levedyktig svulst ble beregnet ved RPG ved å summere den største uni-dimensjonale diameteren til hvert fragment av tumor ved bruk av Olympus BX-41 mikroskop og et mikrometer. Tilsvarende ble nekrotiske områder målt og den sammensatte levende tumorstørrelse ble beregnet ut fra hvert lysbilde.
endotel tube formasjon.
For å undersøke effekten av NCE på tube formasjon i HUVEC celler, matrigel matrise var jevnt belagt på 8-brønners kammerobjektglass (0,15 ml) og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. HUVEC-celler ble tellet, og fortynnet til 2 x 10
5 /ml i medium. Celler ble behandlet med NCE (25-50 pM) ble blandet med celler i nærvær eller fravær av VEGF
165 (25 ng /ml) og overført til hver brønn (200 ul) belagt med matrigel. Platene eller objektglass ble inkubert ved 37 ° C i 16 timer og avbildes under et fasekontrast invertert mikroskop ved 10 x forstørrelse objektiv.
Statistisk analyse.
Dataene ble statistisk analysert ved anvendelse av to- tailed t-test (Prism). *** P 0,001; ** P 0,01, * P 0,05; NS. Ikke signifikant sammenlignet med ubehandlet
Resultater
Syntese og karakterisering av Cerium Oxide Nanopartikler
Cerium-oksid nanopartikler brukt i denne studien inneholder individuelle krystallene på 3-5 nm som er løst agglomerert til 15-25 nm. Ettersom synteseprosessen er fritt for enhver organisk overflateaktivt middel, er hard agglomerering av nanopartikler reguleres ved tett å regulere pH-verdien av nanopartikler under 3,5 i løpet av syntesen for å holde dem i kolloidalt område. Nanopartikler kan fortynnes i vandige eller cellemateriale etter syntesen. Figur 1 A og B viser høy oppløsning transmisjons- elektronmikros (HRTEM) i NCE nanopartikler. Det er innlysende fra bildet at nanopartiklene blir løst agglomerert til omtrent 15-25 nm aggregater som kan også bli indusert ved tørkeprosessen. Den hydrodynamiske radius (37,8 nm ± 0,8) fra multimodale størrelsesfordeling (volum%) analyse av DLS målinger er enig med den løse agglomerat størrelsen på HRTEM analyse. Høy forstørrelse bilde bekrefter gitterplanene i NCE i enkelt 3-5 nm krystallene. UV-synlig spektroskopi ble benyttet for å analysere oksidasjonstilstander ceriumoksid nanopartikler før og etter eldingsbehandling. Figur 1 viser UV-synlig spektrene fra friske og alderen cerium oxide nanopartikler tydelig indikerer overvekt av Ce
3 oksydasjonsstatus fra absorpsjon topp på 252 nm i forhold til absorpsjon topp på 298 nm for Ce
4+ . Ytterligere bekreftelse på oksidasjonstilstander av nanopartikler ble hentet fra XPS-analyse. XPS spekteret av cerium er svært kompleks som inneholder flere topper fra spinn bane koblingen av 3D-orbitaler [26]. Flere topper i Ce3d regionen som har blitt tilskrevet 3d
3/2 (899,5, 900,9, 903,5, 906,4 og 916,6) og 3d
5/2 (880,2, 882,1, 8885, 888,1 og 898) som oppstår fra flere valenstilstander av cerium. Spekteret fra NCE viser en overvekt av cerium i tre oksidasjonstilstand som vist ved de karakteristiske toppene på 880,2, 885,0, 899,5 og 903,5 eV. Tatt sammen data fra karakterisering av NCE er forenlig med tidligere rapporter, karakterisert ved at cerium kan hektes på trivalent oksydasjon ved å redusere størrelsen av nanopartikler [15], [16], [17], [26].
høy oppløsning transmisjonselektronmikroskopibilder viser tilstedeværelse av A-løse agglomerater av 15-20 nm ved lav forstørrelse B individuelle 3-5 nm krystallitter. D Avstanden mellom 0,31 nm viser tilstedeværelse av plan av ceria mens det valgte området elektrondiffraksjon (SAED) mønstre bekrefter tilstedeværelsen av fluoritt gitter av ceriumoksid. Utviklingen i oksydasjonstilstanden nanoceria i C viser at de syntetiserte nanopartikler har overvekt av trivalent oksydasjonstilstand som gjennomgår en langsom omforming til Ce
+3 oksidasjonstilstand i løpet av en periode på 28 dager D røntgen-fotoelektron spektrum fra en referanse ceria prøve hvor cerium er overveiende i 4 oksidasjonstilstand blir sammenlignet med spekteret fra en 4 ukers alderen prøve av nanoceria demonstrerer den høye konsentrasjonen av Ce i +3 oksidasjonstilstander. E. Basal nivåer av ROS i eggstokkreft cellelinje. A2780-celler ble behandlet med NCE (50-100 uM) i 48 timer. Cellene ble vasket med PBS og lastet med DCF-DA fargestoff (5 mm) og fluorescens ble registrert ved eksitasjon 485 nm og emisjon 530 nm for ulike tidsperioder (5-60 min). Brønner inneholdende bare celler uten DCFDA fargestoff (kryss) eller uten celler inneholdende DCFDA fargestoff (fylte diamanter) ble anvendt som en blank. F. Bar diagrammet representerer ROS-nivåer på 60 min behandling med DCF-DA fargestoff. Resultatene blir vist som gjennomsnitt ± S.D. av 4 prøver. *** P 0,001 NCE ved 100 um; * P. 0,05 NCE sammenlignet med ubehandlede celler ved hjelp av tosidige t-test (Prism)
NCE Behandling hemmer produksjon av ROS-nivåer i A2780 cellelinje
Cerium oksid nanopartikler har vist seg å virke som fri radikal-utvaskere ved å hemme produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) [3], [4], [5]. Siden er det vel etablert at ROS-akkumulering spiller en viktig rolle i initiering og progresjon av tumorigenese i human eggstokk-kreft [27], [28], [29], undersøkte vi effekten av NCE på ROS generering i eggstokk-kreft cellelinjen A2780. A2780 cellelinjen ble behandlet med NCE (50-100 mm) og legge inn 48 timer med behandling, ble ROS generasjon målt ved hjelp DCFH2-DA fargestoff etterfulgt av fluorescens lesing. Som vist i figur 1E-F, NCE behandling betydelig hemmet ROS-nivåer i A2780 cellelinje, noe som tyder på at NCE behandling hemmer basal nivåer av oksidativt stress i A2780 OvCa cellelinje.
NCE ikke effekt Cell Proliferation i Eggstokkreft celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
for å finne ut om NCE behandling hemmet celledeling, ble A2780, C200 og SKOV3 belagt i 96 brønners plater på 4 × 10
3 celler /brønn og behandlet med ulike konsentrasjoner av NCE (25-200 mikrometer). Cellelevedyktigheten ble bestemt ved 72 timer ved MTT-analyse. Som vist i figur 2A, nce behandling hadde ingen signifikant effekt på proliferasjonen eller overlevelse av ovarian cancer-cellelinjer. I samsvar med denne observasjonen, våre klonogene analysene viste heller ingen endring i proliferasjonsrate med økende NCE konsentrasjon (Fig. 2B). [3H] tymidin opptak i A2780, C200 og SKOV3 celler (fig. S1), også bekreftet at NCE behandling ikke forandre graden av spredning. Lignende resultater ble oppnådd i flere eggstokkreft cellelinjer inkludert CaOV3 og TOV21G (data ikke vist). Sammen er disse resultatene indikerer at NCE behandling ikke hemme veksten av eggstokkreft celler linjene
in vitro
.
A. Prosent levedyktighet av A2780, C200 og SKOV3 celler behandlet med angitte doser av NCE (25-200 mm) som bestemmes av MTT-analyse. Dataene er representerer tre individuelle eksperimenter utført i tre paralleller. NS: ikke signifikant, sammenlignet med ubehandlede celler på respektive tidspunkt ved hjelp av to-halet t-test (Prism). B. For kolonidannelse, ble 2000 celler /brønn (A2780, C200 og SKOV3) sådd ut i 6-brønns plater og behandlet med indikerte konsentrasjoner av nce, hver tredje dag i 2 uker inntil kolonier ble dannet. Koloniene ble farget med MTT og telles. Dataene representerer tre separate eksperimenter utført i tre paralleller. NS. Ikke signifikant sammenlignet med ubehandlede celler ved hjelp av tosidige t-test (Prism)
NCE hemmet Growth Factor-mediert celle migrasjon og invasjon
in vitro
Siden gjorde NCE behandling ikke påvirke celledeling, vurderte vi effekten av NCE på vekstfaktor mediert celle migrasjon og invasjon. SKOV3-celler dyrket over natten i lavt serum (0,2%) inneholdende medium ble skrapet med en steril 200 mL pipettespissen, når de har nådd 90% konfluens. Forskjellige vekstfaktorer inkludert SDF1, HB-EGF, VEGF
165 og HGF (25 ng /ml) ble tilsatt hver for seg til det medium i nærvær eller fravær av NCE (100 uM). 24 timer senere ble satsen for sårheling beregnet. Som vist i figur 3A, nce inhiberte all vekstfaktor-mediert cellemigrering i SKOV3 cellelinje. Lignende resultater ble oppnådd for A2780 og C200 cellelinjer (data ikke vist). Neste vurdert vi effekten av NCE i inhibering av GF-mediert invasjon av SKOV3-celler ved anvendelse Boyden kammer migrasjonsanalyse (BD Bioscience) som tidligere beskrevet [18]. Figur 3B viser klart at 100 uM NCE behandling inhiberte signifikant alle vekstfaktor indusert invasjon av SKOV3-celler sammenlignet med ubehandlede celler. Disse resultater indikerer at, nce har evnen til å inhibere migrering og invasjon av eggstokkreft celler uten å påvirke celleformering.
A. Effekt av nce på forskjellige vekstfaktorer som medieres cellemigrering ble undersøkt ved bruk av sårlukking-analyse som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene blir vist som gjennomsnitt ± S.D. n = 7. B. For å undersøke effekten av NCE på invasjon, 1 × 10
5 SKOV3 celler ble sådd på de øvre brønner med 100 mikrometer NCE i FIA kammeret i 500 ul kulturmedium. Forskjellige vekstfaktorer (EGF, VEGF
165 og SDF1) (25 ng /ml) ble tilsatt til de underliggende mediet. 24 timer senere, invasjonen ble bestemt etter produsentens anvisninger. Resultatene blir vist som gjennomsnitt ± S.D. av tre paralleller. *** P 0,001 vekstfaktor behandlet i forhold til kontroll. $$$ P 0,001 NCE behandlet i forhold til vekstfaktor ved hjelp av tosidige t-test (Prism)
NCE Behandling dempes tumorvekst i Human A2780 ovarialcancer cellelinje Peiling Nude Mouse Model
for å bestemme effekten av NCE
in vivo
, nakne mus var intra-peritonealt injisert med A2780 celler. Mus ble behandlet med NCE (0,1 mg /kg kroppsvekt) gitt intra-peritonealt, hver tredje dag inntil slutten av studiet (dag 30), som beskrevet i materiale og metoder. Figur 4A (øvre panel) viser et representativt bilde av en nce behandlede og ubehandlede mus som bærer A2780 xenograft ved slutten av studiet (dag 30). Abdominal omkrets, som vitner om tumorbyrde i bukhinnen (Fig. 4B) og svulsten vekt (Fig. 4C) i NCE-behandlede mus var signifikant (p 0,002) redusert sammenlignet med ubehandlede mus. Den midlere vekt av det utskårede tumorer var omtrent 33% mindre i NCE (4,56 + 0,345 g) behandlede mus sammenlignet med vehikkel (PBS) mus (6,79 + 0,53 g) (fig. 4C). Disse dataene indikerer klart at NCE har muligheten til å begrense eggstokkreft tumorvekst
in vivo
når administrert selv på en svært lav dose (0,1 mg /kg).
A. Brutto morfologi av representative mus med svulster på dag 30 (n = 6). B. Kumulativ abdominal omkrets ved slutten av studien. C. spaltet tumorvekt fra kjøretøyet (PBS) som ble behandlet og NCE (0,1 mg /kg bd vekt; hver tredje dag). Resultatene blir vist som gjennomsnitt ± S.D. av seks individuelle dyr. ** P 0,01 NCE behandlet i forhold til ubehandlet gruppe ved hjelp av tosidige t-test (Prism). Som vist på fig. Som vist på fig.
