Abstract
Bakgrunn
ovarialcancer er den mest dødelige av alle gynekologiske kreftformer, og høy grad av serøs eggstokkreft (HGSC) er den vanligste undertype av eggstokkreft. Målet med denne studien var å bestemme hyppighet og typer punktsomatiske mutasjoner i HGSC ved hjelp av en mutasjon deteksjon protokoll kalt OncoMap som syssels massespektrometrisk-basert genotyping teknologi.
metodikk /hovedfunnene
The Center for Cancer Genome Discovery (CCGD) Program ved Dana-Farber Cancer Institute (DFCI) har tilpasset en høy gjennomstrømming genotyping plattform for å bestemme mutasjonsstatus av et stort panel av kjente kreftgener. Mutasjonen deteksjon protokollen, betegnes OncoMap har blitt utvidet til å oppdage mer enn 1000 mutasjoner i 112 onkogener i formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vevsprøver. Vi utførte OncoMap på et sett av 203 FFPE avansert iscenesatt HGSC prøver. Vi isolert genomisk DNA fra disse prøvene, og etter et batteri av kvalitetstester, løp hver av disse prøvene på OncoMap v3-plattformen. 56% (113/203) tumorprøver næret kandidat mutasjoner. Seksti-fem prøvene hadde enkelts mutasjoner (32%), mens de resterende prøvene hadde ≥2 mutasjoner (24%). 196 kandidat mutasjon samtaler ble gjort i 50 gener. De mest vanlige somatiske onkogene mutasjoner ble funnet i
EGFR
,
KRAS, PDGRFα, KIT, og PIK3CA
. Andre mutasjoner som finnes i flere gener ble funnet ved lavere frekvenser ( 3%).
Konklusjoner /Betydningen
Sequenom analyse ved hjelp av OncoMap på DNA ekstrahert fra FFPE-eggstokkkreftprøvene er mulig og fører til påvisning av potensielt druggable mutasjoner. Screening HGSC for somatiske mutasjoner i onkogener kan føre til ytterligere behandling for denne pasientgruppen
Citation. Matulonis UA, Hirsch M, Palescandolo E, Kim E, Liu J, van Hummelen P, et al. (2011) Høy gjennomstrømning Interrogation av somatiske mutasjoner i High Grade Serous Kreft i eggstokk. PLoS ONE 6 (9): e24433. doi: 10,1371 /journal.pone.0024433
Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, USA
mottatt: 02.08.2011; Godkjent: 09.08.2011; Publisert: 08.09.2011
Copyright: © 2011 Matulonis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var gitt av følgende kilder: Eggstokkreft Specialized Program for fremragende forskning (P50CA105009), Madeline Franchi Ovarian Cancer Fund, og kvinner Representantskapet i Dana-Farber Cancer Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Drs. Hahn og Drapkin både fungere som konsulenter for og har fått forskningsmidler fra Novartis Pharmaceuticals. Dette endret ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. De andre forfatterne har ingen interessekonflikter å rapportere.
Innledning
ovarialcancer er den mest dødelige av alle de gynekologiske kreftformer, og nye behandlinger er nødvendig for både nydiagnostiserte pasienter samt som pasienter med tilbakevendende kreft [1]. I løpet av ovarialcancer, er HGSC den mest vanlige undertypen og er assosiert med kjemoterapi innledende reaksjonsevne når den først diagnostiseres. Men de fleste kreftformer gjenta seg og blitt stadig kjemoterapi resistente. Suksessen til konvensjonell kjemoterapi for behandling av eggstokkreft har nådd et platå, og nye former for molekylært og genetisk karakterisering av eggstokkreft for å «tilpasse» og forbedre behandlingen er nødvendig [2], [3].
Aktivering punktmutasjoner i proto-onkogener har blitt observert i mange humane kreftformer, og slike mutasjoner kan gi «onkogen avhengighet «ved de aktuelle kreftceller [4]. Denne onkogen avhengighet gir grunnlag for målretting aktiverte onkogener i behandling som eksemplifisert av suksessen til imatinib og erlotinib i kreft som havn
BCL-ABL Hotell og henholdsvis
EGFR
endringer,. Rikelig bevis indikerer nå at disse gain-of-funksjon mutasjoner ikke forekomme tilfeldig innenfor onkogener, men i stedet, mutasjoner som påvirker et relativt lite antall kodoner står for det overveldende flertall av aktivering hendelser i kreft. For eksempel, enkeltbaseforandringer i kodon 12, 13 og 61 i
KRAS
mutasjoner omfatter flertallet av aktiverende onkogene mutasjoner [5]. Tilsvarende
BRAF
mutasjoner som påvirker kodon 600 utgjør 90% av melanom
BRAF
mutasjoner; genetiske endringer i ytterligere 10-12 kodoner står for mesteparten av de gjenværende kreftassosierte
BRAF
mutasjoner er identifisert til å [6], [7].
For å identifisere disse onkogene mutasjoner i arkiv vev, har vi tilpasset en high-throughput genotyping plattform for å bestemme status mutasjon av et stort panel av kjente kreft onkogener [8], [9]. Konkret har vi utviklet en mutasjon deteksjon protokoll, kalt OncoMap, som syssels massespektrometrisk-basert genotyping teknologi (Sequenom) for å identifisere onkogene mutasjoner. Den gjeldende versjonen av denne protokollen er i stand til å oppdage mer enn 1000 mutasjoner i 112 ofte muterte gener i både fersk frosne og parafininnstøpte vevsprøver. Denne rapporten beskriver vår vellykket bruk av OncoMap til en kohort av pasienter med avansert HGSC for å identifisere onkogene mutasjoner.
Resultater
I den innledende OncoMap analyse, 56% (113/203) svulst prøvene næret kandidat onkogene mutasjoner. Seksti-fem prøver hadde enkle mutasjoner (32%), mens de resterende hadde ≥2 mutasjoner (24%). I alt ble 196 kandidat mutasjon samtaler gjort i 50 gener.
De hyppigst muterte onkogener var
EGFR plakater (9,4%),
KRAS plakater (4,5%),
PDGFRα plakater (4,5%),
KIT plakater (3,0%), og
PIK3CA plakater (3%); andre som var mindre vanlig muterte inkludert:
BRAF product: (1%),
CUBN plakater (0,5%),
og NRAS plakater (2,5%). Vi har også identifisert mutasjoner i mange andre gener ved lavere frekvenser inkludert:
ABL1 plakater (2,5%),
STK11 plakater (2,5%),
EPHA1 plakater (2%),
RET plakater (1,5%),
SMARCB1 plakater (1,5%),
ATM product: (1%),
FLT3 product: (1%),
MLL3 product: (1%),
MYC product: (1%),
NF2 product: (1%),
NOTCH1 product: (1%),
NTRK1
(1%),
PIK3R1 product: (1%),
ROBO2 product: (1%),
APC plakater (0,5%),
FES
(0,5%),
FYN plakater (0,5%),
GATA1 plakater (0,5%),
NF1 plakater (0,5%),
NTRK3 plakater (0,5 %),
PALB2 plakater (0,5%),
PKHD1 plakater (0,5%),
PTEN plakater (0,5%),
RUNX1 plakater (0,5%)
SMO plakater (0,5%),
SPTAN1 plakater (0,5%), og
TSHR plakater (0,5%).
Den vanligste somatisk mutasjon identifisert involverte tumorsuppressorgen
TP53
, som ble påvist i 24,8% av prøvene. Siden OncoMap interrogates bare en undergruppe av
TP53
mutasjoner og oppdager ikke sletting hendelser, den observerte hyppigheten av
TP53
endringer enig med nyere arbeider fra Kreft Genome Atlas Project (TCGA) [10] som har bekreftet funnet at
TP53
mutasjoner er den vanligste somatisk mutasjon i HGSC kreft. I tillegg har vi identifisert mutasjoner i andre tumorsuppressorgener inkludert
RB1 plakater (3%) og
VHL plakater (3,5%).
Somatiske mutasjoner ble deretter godkjent av HME, og de følgende ble validert:
EGFR
,
HRAS
,
KRAS
,
NRAS
,
PIK3CA
,
BRAF
,
RB1
,
TP53
,
ATM
,
CUBN
, og
FLNB
. Tabell S1 viser validerte mutasjonene som finnes i vår kohort av HGSC.
Diskusjoner
Vår gruppe har vist at somatiske onkogene mutasjoner kan påvises i HGSC bruker en Sequenom baserte analysen heter OncoMap som bruker DNA avledet fra FFPE vev. Selv HGSC er preget av genkopitallet endringer [11], lavfrekvente mutasjoner i et antall onkogene gener ble funnet i 56% av kreft i vår 203 sample årsklasse, og mange av disse mutasjonene er potensielt druggable bruker nye biologiske legemidler. De fleste mutasjoner ble funnet i lav frekvens, og de spesifikke mutasjoner ble funnet i mindre enn 5% av prøvene. Godkjenning ved HME ble utført på gener som er av interesse, og flere viktige gener ble funnet å være mutert; alle mutasjoner ble ikke validert på grunn av kostnader og grad av interesse. I klinisk praksis, forventer vi at alle identifiserte mutasjoner av OncoMap profilering vil bli validert i CLIA-godkjente laboratorier.
Dermed OncoMap som bruker Sequenom teknologien er i stand til billig skjerm for flere mutasjoner ved hjelp av DNA ekstrahert fra FFPE prøver i cancertyper slik som HGSC som har flere mutasjoner som er tilstede i lav frekvens. Andre fordeler OncoMap inkluderer muligheten til raskt å utvide «hotspot» mutasjon bibliotek som ekstra mutasjoner blir oppdaget og nye nye biologiske legemidler er testet. Begrensninger av OncoMap inkluderer at bare «hotspot» mutasjoner er plassert, og at validering av mutasjoner er nødvendig; andre mutasjoner ikke inngår i OncoMap panelet vil bli savnet. Selv om hele exome eller hele genomsekvensering er nå mulig i forskningslaboratorier, er rutinemessig bruk av disse teknologiene i parafin innebygd prøver ikke mulig. Dermed gir OncoMap en rask, rimelig pris metode for å identifisere onkogene mutasjoner i humane kreftprøver.
De kliniske konsekvensene av somatiske mutasjoner i HGSC er ukjent og må undersøkes nærmere. Somatiske mutasjoner i kreft kan føre til konstitutiv aktivering av signalveier som normalt aktiveres av aktiverte vekstfaktorreseptorer, og disse mutasjonene kan føre til en total genomisk instabilitet [12]. Endringer i genkopitallet og genekspresjon har begge vist seg å være viktig i eggstokkreft, mens mutasjoner er blitt ansett å være mindre viktig [11].
Flere muterte onkogener av interesse ble funnet i vår kohort av HGSC prøvene testet og analysert med OncoMap.
EGFR
ble funnet til båtplass mutasjoner i nær 10% av tilfellene, og EGFR-hemmere som erlotinib kunne testes i denne undergruppen av kreft. I lungekreft, er disse inhibitorer anvendes for å behandle kreft som havn exon 20 varianter, kodon 719 varianter, og L858R substitusjoner i tillegg til andre typer
EGFR
mutasjoner [13], [14]. Vi identifiserte HGSC med et kodon 719 variant som ble validert av HME. Således testing av EGFR-inhibitorer vises forsiktighet når EGFR-mutasjoner blir detektert. EGFR-hemmere har blitt testet i eggstokkreft med responsrate på 10% eller mindre [15] – [17]; Imidlertid har ingen av disse undersøkelsene prospektivt testet eggstokkreft for EGFR mutasjoner, en praksis som nå rutinemessig utført for ikke-småcellet lungekreft som har resultert i den molekylært målrettet bruk av EGFR-inhibitorer.
EGFR
mutasjoner og uttrykk ble testet for retrospektivt i Schilder et al, og en delvis respons ble observert i en pasient som hadde en EGFR mutasjon [17].
Vår rente på
PIK3CA
mutasjoner av 3% som finnes i HGSC paralleller at funnet av den Sanger Senter [18]. Andre grupper har rapportert lave priser av både
AKT Hotell og
PIK3CA
mutasjoner men høyere frekvens av genet forsterkning for
PIK3CA product: [19]. Inhibitorer av PI3kinase reaksjonsveien er for tiden blir studert i eggstokk-kreft, og aktivitet av disse midler er blitt rapportert i eggstokk-kreft [20], [21]. For eksempel, MK2206, en AKT inhibitor, ble testet i en fase 1 studie med pasienter med langtkomne solide tumorer. Alle 3 eggstokkreft pasienter som ble rekruttert i denne studien viser en nedgang i sine CA125 nivåer, noe som tyder på anti-tumor aktivitet av MK-2206 i eggstokkreft. GDC0941, en PI3kinase inhibitor, har også vist aktivitet i eggstokkreft spesielt i situasjoner med
PIK3CA
forsterkning. Med utviklingen av ytterligere inhibitorer av PI3kinase reaksjonsveien og på grunn av anti-kreft-aktivitet av disse midler i eggstokk-kreft, vil identifisering av avvik av denne reaksjonsveien bli stadig viktigere i HGSC.
Andre validerte gener som er av interesse finnes i vår studie har
BRAF
,
KRAS
,
HRAS
, og
NRAS
, og alle disse genene har ledige biologiske legemidler som kan målrette effekten av disse onkogene mutasjoner.
TP53
mutasjoner finnes ofte i eggstokkreft [22], og våre data støtter og paralleller dette data
Dette arbeidet bekrefter de nylig publiserte TCGA data [10].; fremtidige studier vil det være nødvendig å korrelere tilstedeværelsen av disse mutasjonene med biologisk aktivitet og prognose av kreft, og hvorvidt disse mutasjonene forutsi anti-kreft-aktivitet av målrettede biologiske midler. I tillegg vil korrelere somatiske mutasjoner med andre faglige vurderinger av den genetiske sammensetningen av kreft som genekspresjon profilering og genkopitallet være avgjørende for å forstå en mer fullstendig genetisk bilde av HGSC.
Materialer og metoder
Pasienter og pasientprøver
patologi poster ble gjennomgått mellom 1999 og 2004 fra Seksjon for gynekologisk patologi ved Brigham and Women Hospital i Boston MA, og International Federation of gynekologi og fødselshjelp (FIGO) scenen III eller IV HGSC eggstokkreft krefttilfeller ble valgt. Dana-Farber /Harvard Cancer Center Institutional Review Board (IRB) gitt godkjenning til å samle FFPE-prøver. Fordi alle prøvene ble avidentifisert, IRB gitt oss en waiver for å samle inn prøver uten pasientens samtykke.
FFPE- prøver ble anmeldt av en gynekologisk onkologi patolog (MH) som gjennom patologi rapporter samt FFPE vevsblokker og valgt ut de områdene med høyest prosentandel av kreft som til slutt ble rørtråd for DNA-ekstraksjon. Pasienter med kjent BRCA germline mutasjoner ble ekskludert i dette settet og blir undersøkt i et annet datasett. Totalt 203 prøver ble valgt.
DNA-ekstraksjon og kvantifisering
Genomisk DNA ble ekstrahert fra de uthulte FFPE- pasient vevsprøver med QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) i henhold til produsentens protokoll. I korthet Kjerner ble deparaffinized i xylen og ytterligere lysert i lyseringsbuffer inneholdende denaturering proteinase K. Vevet Lysatet ble inkubert ved 90 ° C for å reversere formalin tverrbinding. Ved hjelp av Qiacube, ble lysatet påført på DNA-bindende kolonne og kolonnen ble vasket i serie, og deretter eluert i 30 ul destillert vann. Genomisk DNA ble kvantifisert ved hjelp Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen) per produsentens protokoll. 250 ng genomisk DNA ble anvendt for analysen.
OncoMap v3.0 ble utført på alle prøver, og genene og antall mutasjoner testet for i denne versjonen av OncoMap versjon er angitt i tabell 1. I første omgang primere ble designet som gjør at mutasjonsdeteksjon. Tumor-avledet genomisk DNA ble utsatt for hele genomet forsterkning. Deretter ble multiplex PCR utføres på tumor genomisk DNA for å forsterke regioner husing loci av interesse, eller «spørre «nukleotider. Etter denaturering, ble PCR-produktene inkubert med oligonukleotider som glødning i umiddelbar nærhet til spørre nukleotid, og en primerekstensjonsreaksjon ble utført i nærvær av kjede-terminerende di-deoksynukleotider som genererer allel-spesifikke DNA-produkter. Primerekstensjonsprodukter ble prikket inn på en spesielt utformet brikke og analysert ved hjelp av MALDI-TOF-massespektrometri for å bestemme den mutasjonstatus. Siden allel (eller mutasjon) ringer avhenger kun av massen av det resulterende primer-ekstensjonsprodukt, ikke Sequenom assay ikke krever dyre fluorescens primer merking og har en meget lav feilrate. Kostnaden for utelukkende å drive OncoMap mutasjonsanalyse er omtrent $ 200 per prøve uavhengig av antall prøver kjøres.
Når mutasjoner ble identifisert, ble validering utført på et valgt delsett av mutasjoner ved hjelp av multi-base- HME forlengelse kjemi, som beskrevet tidligere [8], [9]. Primere og prober ble utformet ved hjelp Sequenom MassARRAY analyse Design 3.0-programvaren, bruke standard multi-basen skjøte parametre, men med følgende endringer: maksimal multiplex nivå inngang justert til 6; maksimal pass køyring basen justert til 200.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Validert Mutasjoner av HME. Denne tabellen viser de validerte mutasjonene som finnes i vår kohort av HGSC. Valideringen ble utført av HME
doi:. 10,1371 /journal.pone.0024433.s001 plakater (DOC)
Takk
Forfatterne ønsker å takke Robert T. Jones, Christina K. Go, og Christine A. Roden for sitt arbeid med de tekniske aspektene ved å drive OncoMap på disse prøvene.
