Abstract
Tykktarmskreft (CRC) er den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i den vestlige verden og samspillet mellom genetiske og miljømessige faktorer, blant annet kosthold, er foreslått å spille en avgjørende rolle i sin etiologi. Vi gjennomførte en langsiktig fôringsforsøk på mus for å ta genekspresjon og metylering endringer som oppstår i histologisk normal tarmslimhinnen som mulige kreftfrem predisponerende aktuelle for tidlig deteksjon. Uttrykket av 94 vekstregulerende gener tidligere knyttet til menneskelig CRC ble undersøkt på to tidspunkter (5 uker og 12 måneder) i heterozygote
MLH1
+/-
mus, en dyremodell for human Lynch syndrom (LS), og villtype
MLH1
+ /+
kullsøsken, matet av enten Vest-stil (WD) eller AIN-93g kontroll diett. Hos mus ble matet med WD, proksimale colon slimhinner, den dominerende området av kreft formasjon i LS, viste en betydelig uttrykk nedgang i tumorsuppressorgener,
DKK1, Hoxd1
,
Slc5a8
, og
Socs1
, de to sistnevnte bare i
MLH1
+/-
mus. Redusert mRNA-ekspresjon ble ledsaget av økt promoter metylering av de respektive gener. Den sterkeste uttrykket nedgang (7,3 ganger) sammen med en betydelig økning i sin promoter metylering ble sett i
DKK1
, en motstander av den kanoniske Wnt signalveien. Videre inaktivering av
DKK1
synes å disponere for neoplasier i proksimale colon. Dette og det faktum at
MLH1
som viste bare beskjeden metylering var fortsatt uttrykt i både
MLH1
+/- Hotell og
MLH1
+ /+
mus tyder på at uttrykket avtar og inaktivering av
DKK1
spesielt er en fremtredende tidlig markør for tykktarms onkogenese
Citation. Pussila M, Sarantaus L, Dermadi Bebek D, Valo S, Reyhani N, Ollila S, et al. (2013) Kreft-Forutsi genekspresjon Endringer i Kolon slimhinnene i Western Diet Fed
MLH1
+/- Mus. PLoS ONE 8 (10): e76865. doi: 10,1371 /journal.pone.0076865
Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, USA
mottatt: May 22, 2013; Godkjent: 28 august 2013; Publisert: 08.10.2013
Copyright: © 2013 Pussila et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansielt støttet av tilskudd fra European Research Council (2008-PEB-232635), The Sigrid Juselius Foundation (https://www.sigridjuselius.fi/foundation), finsk Cancer Organisasjoner (https://www.cancer.fi/no /), The Academy of Finland (https://www.aka.fi/eng), og Biocentrum Helsinki (https://www.helsinki.fi/biocentrum/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) utvikler seg som en flertrinnsprosess som krever en rekke genetiske og epigenetiske forandringer. Prosessen er akselerert i personer med arvelig kreft predisposisjon, og interaksjoner mellom genetiske og miljømessige faktorer, blant annet kosthold, ser ut til å være i nøkkelposisjon i sin etiologi [1,2]. Betydningen av epigenetiske forandringer som DNA metylering endringer i igangsetting av CRC er nå anerkjent [3,4], men likevel, de tidligste hendelsene i normal tarmslimhinnen tilgjengelige for tidlig oppdagelse og forebygging av kreft utvikling gjenstår å bli belyst.
Selv arvet mutasjoner i tumor suppressor genet (TSG) APC (adenomatøs polypose coli), en viktig del av Wnt /β-catenin signalveien, og mismatch reparasjon (MMR) gener (f.eks
MLH1
, mutL homolog 1), som styrer den mutasjonshastigheten i en celle [2] kan gi en høy levetid risiko for kreft med en ung alder ved sykdomsdebut, er kolorektal kreft klart en sykdom med økende alder [3,4]. Følgelig har metylering endringer av en liten undergruppe av TSGs blitt oppdaget i den aldrende colonic slimhinnene i normalt friske individer, og dette metylering involverer gener som ofte blir mer vesentlig metylert i neoplastiske celler [5-7], noe som tyder på deres rolle i kreft initiering og progresjon. Sammen med aldring noen eksogene forbindelser fra kosten kilder er viktige modifikatorer av metylering mønstre i tykktarmen [8], trolig forklarer hvorfor vestlige befolkningen forbruker betydelige mengder rødt kjøtt, mettet fett og sukker, og bare moderate mengder kostfiber, vitaminer og mineraler (f.eks kalsium, folat og vitamin D), samt plante avledet næringsstoffer viser de høyeste CRC forekomst i verden [1] (World Cancer Research Fund, www.dietandcancerreport.org). Epigenetiske endringer gir således en potensiell kobling mellom ernæring og kreft [9] og understreker behovet for å belyse diett effekter på genregulering i tarmslimhinnen.
Dyremodeller, særlig gnagere, gir en verdifull ressurs innenfor miljø epigenetikk inkludert studier på endringer formidlet gjennom kosten [10]. Resultatene tyder på at Vest-stil diett (WD) induserer gastrointestinale svulster i musemodeller for familiær tarmkreft og selv i villtype (WT) mus uten kreftfremkallende behandling [11-14] bedt oss å studere effekter av WD eksponeringer på genet regulering og metylering i normal tykktarm slimhinnene med og uten arvelig tykktarmskreft mottakelighet. Vi valgte 94 vekstregulerende gener tidligere knyttet til menneskelig CRC og studert deres uttrykk i heterozygote
MLH1
+/-
mus analog til menneskets Lynch syndrom (LS), og WT
MLH1
+ /+
kullsøsken. Under en langsiktig fôringsforsøk vi brukte vår egen modifisering av Vest-stil diett (WD *) som svært ligner New Western Diet (NWD) vist å indusere godartede og ondartede svulster i tykktarmen av normale C57BL /6 mus etter en 18 måned foringsforsøket [12]. Den største forskjellen mellom NWD og WD * er fettkilde som i WD * var i stor grad endret fra olje til dyr (melk) fett og dermed ligner mer fett forbrukes av vestlige populasjoner. Her proksimale colon, den dominerende området av kreft formasjon i LS [15], avdekket flere signifikante aldersrelaterte endringer i genekspresjon. Noen endringer ble forsterket av WD * og noen ble funnet bare i mus med genetisk kreft predisposisjon. Vi videre viste at uttrykket endringer funnet fra histologisk normal slimhinne var bemerkelsesverdig tidlig forekommende før
APC
inaktivering og andre hit i
MLH1
.
Metoder
mus
heterozygote B6.129-
MLH1
tm1Rak
mus (MLH1
+/-) (stamme 01XA2) ble oppnådd fra NCI -MMHCC; National Institutes of Health, Mouse Repository, NCI-Frederick, MD. I B6.129-
MLH1
tm1Rak
mus, er ekson 2 mangler i ett av de to
MLH1
alleler fører til ikke-fungerende MLH1 protein [16 ]. MLH1
+/- mus har en økt sykelighet i forhold til sine WT kullsøsken og omtrent en tredjedel utvikle tumorer slik som lymfomer, så vel som svulster i tynn- og tykktarmen og en rekke andre organer i løpet av sin levetid [17]. Den MLH1
+/- og MLH1
+ /+ mus ble genotypet ved hjelp av genomisk DNA ekstrahert fra øremerker i henhold til protokollen publisert på Mouse Repository nettsted (https://mouse.ncifcrf.gov/protocols.asp? ID = 01XA2 p_allele = MLH1% 3Ctm1Rak% 3E prot_no = 1) (se Materialer og metoder S1)
Etikk uttalelse
Mus ble avlet og behandlet i henhold til studieprotokollen er godkjent av. den nasjonale Animal Experiment Board i Finland (ESLH-2008-06502 /Ym-23). Musene ble humant avlivet med CO2 innånding.
Dietter
I en alder av 5 uker (tidspunkt 0, tp0),
MLH1
+ /- Hotell og
MLH1
+ /+
mus ble tilfeldig delt inn i to kosttilskudd grupper (n = 8 /gruppe, inkludert begge kjønn) som ble matet med AIN-93g ( AIN) kontroll kosthold [18] eller vestlig stil (WD *) diett (Harlan Teklad, Madison, WI) (tabell 1, detaljert beskrivelse av dietter og deres ernæringsmessige komposisjoner er i tabell S1).
AIN93- g
WD *
fettkilder (g /kg)
a (g /kg)
bSoybean Oil70-vannfri melkefett-133Canola Olje 55Sunflower Olje 12Carbohydrate SourcesStarch397306Maltodextrin13295Sucrose100116Protein Source200 ( kasein) 232 (kasein, vitamin gratis) Totalt energiinnhold (kcal /g) 3.84.6Kcal fra fett (%) 17.239.2Kcal fra karbohydrater (%) 63.942.3Kcal fra protein (%) 18.818.5Vitamin D (IE /kg) 1000100Folic syre (mg /kg) 20.2Calcium50.5Table 1. Diet ernæringsmessige informasjon.
for detaljert sammensetningen av eksperimentelle dietter se tabell S1.
a Hvis ikke annet er oppgitt
b Hvis ikke annet er oppgitt CSV ned CSV
Prøvepreparering
Åtte mus per hver gruppe på tp0 (MLH1
+/-, MLH1
+ /+) og TP1 (12 måneders alder) (MLH1
+ /+ AIN, MLH1
+/- AIN, MLH1
+ /+ WD *, MLH1
+/- WD *) 48 mus totalt ble ofret og samplet. Histologiske studier ble utført ved Den finske Centre for Forsøksdyr patologi (FCLAP), Universitetet i Helsinki, Finland.
For genomisk DNA og total RNA utdrag, slimhinnene (6 x 4 mm) ble skilt fra underliggende submucosa og muskulatur under et dissekere mikroskop. Prøver for RNA ekstraksjon ble lagret i RNAlater (Qiagen, Valencia, CA) ved -80 ° C.
RNA ekstraksjon og revers transkripsjon
De totale RNA prøver ble utarbeidet etter den RNeasy Plus Kit ( Qiagen, Valencia, CA) med en ekstra DNase-behandling (Qiagen, Valencia, CA). RNA integritet ble analysert med Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, California) og høy kvalitet RNA (RNA integritet nummer RIN 8) ble brukt for cDNA syntesereaksjoner, som ble kjørt som duplikater og sammenslåtte for RT -qPCR reaksjoner. Revers transkripsjon fra enten 200 ng (individuelle prøver for StellARray) eller 1600 ng (bassenger av åtte prøvene, 200 ng hver, fra åtte forskjellige mus som tilhører hver TP1 gruppe for TaqMan RT-qPCR) av total RNA ble oppnådd med M-MuLV RNase H
+ (Thermo Scientific, Finland) eller Hevet III (Life-teknologi, Carlsbad, California), henholdsvis ved hjelp av tilfeldige primere i henhold til produsentens instruksjoner.
RNA uttrykk studier
RNA uttrykk for histologisk normale vevsprøver fra proksimale kolon slimhinnen ble analysert ved hjelp av en kvantitativ skreddersydde StellARray
TM plattform (Lonza Group Ltd, Bar Harbor bioteknologi). Den StellARray inkludert 94 gener (73 TSGs) tidligere i forbindelse med utvikling av tykktarmskreft og /eller dokumentert å stille CpG island (CGI) hypermethylation i CRC og andre menneskelige kreftformer (Tabell S2).
APC
ble inkludert i matrisen som en indikator på pågående kreftutvikling. Åtte mus fra hver studiegruppen ble separat analysert for uttrykket av de 94 gener av interesse (48 RT-qPCR arrays i alt).
Hver StellARray plate godt var lastet med 20 pl SYBR Grønn mester mix inneholder 8μl prøve spesifikk cDNA og modifisert
Thermus brockianus
DNA polymerase (Thermo Scientific, Finland). RT-qPCR matriser ble kjørt på en Mx3000P cycler (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ved bruk av følgende Syklusparametrene: 50 ° C i 2 min, 95 ° C i 7 minutter, 40 sykluser av 95 ° C i 15 s, og 60 ° C i 1 min. Fluorescens data ble samlet inn under 60 ° C avspenning /utvidelse trinn. Primeren spesifisitet ble overvåket gjennom en smeltekurve analyse. Uttrykket forskjeller mellom ulike musegruppene ble analysert ved hjelp av Global Pattern Recognition ™ (GPR) programvare (Bar Harbor Biotechnology, Trenton, ME)
Resultatene fra statistisk signifikante uttrykk endringer i forhold til WD * og /eller arvet kreft predisposisjon ble validert ved TP1 bruker TaqMan analyser (Tabell S3). I motsetning til StellARray RT-qPCR ble TaqMan RT-qPCR-analyse utføres fra samleprøver. Hver sammenslåtte prøve ble analysert i triplikat for de aktuelle gener, så vel som de endogene referanse gener ved hjelp av følgende Syklusparametrene: 1 syklus med 95 ° C i 10 minutter, 40 sykluser av 95 ° C i 15 s, og 60 ° C i 1 minutt. Termisk sykling og fluorescens datainnsamling ble utført med en StepOnePlus cycler (Life Technologies, Carlsbad, California) og CQ verdier ble kalt med Data-assist v2.0 programvare (Life Technologies, Carlsbad, California). De jevnt uttrykt referansegener (
Hdac1 Hotell og
Stk4
) ble valgt ved hjelp av GeNorm algoritme [19] fra blant de 94 gener som inngår i StellARray.
MLH1
uttrykk nivåer på tp0 ble også kvantifisert ved bruk av TaqMan analysen.
Hvis mengden av malen var for lav til å gi pålitelige resultater, ble RT-qPCR validering utføres ved hjelp av pre-forsterket cDNA. For hver TP1 gruppe, samleprøver var multiplex pre-forsterket ved hjelp av 16 ng av cDNA med TaqMan PreAmp Master Mix Kit (Life Technologies, Carlsbad, California) etter produsentens anvisninger. Syklusparametrene var som følger: a. En syklus på 95 ° C i 10 minutter og 10 pre-forsterknings sykluser med 95 ° C i 15 s, og 60 ° C i 4 min
DNA metylering analyse
for DNA-metylering analyse, bare de gener som hadde vist en signifikant mRNA-ekspresjon reduksjon (dvs. kandidat hypermethylated TSGs) i assosiasjon med arvelig predisposisjon og /eller WD * ble valgt, og metylering nivåer av deres CpG-øyer (CGIer) ble vurdert individuelt for hver tp0 og TP1 mus. Genomisk DNA for metylering analyse ble ekstrahert ved bruk av DNeasy Blood 0,05.
Korrelasjonen mellom StellARray uttrykk mønstre av fem uker gamle
MLH1
+ /+ Hotell og
MLH1
+/-
mus ble undersøkt ved hjelp av Pearson korrelasjonsanalyse (
R
verdi) av PASW Statistikk 18 system.
Chipster programvare [25] ble brukt til å visualisere og analysere metylering data. Den ikke-metriske Multi-Dimensional Scaling (NMDS) verktøyet ble brukt til å produsere to-dimensjonale kart basert på utvalgets ulikhet beregnet med Euklidsk avstand, og Dendrogrammet verktøyet ble brukt til å lage dendrogrammer av prøver ved hjelp av normaliserte data med Pearson korrelasjon og gjennomsnittlig kobling metode . For Chipster analyser, manglende metylering verdier av individuelle CpG enheter ble definert som medianverdien av CpG enhet innen spesielle muse gruppen.
Sammenligning av gjennomsnittlig metylering nivåer mellom ulike musegruppene ble utført ved hjelp av Mann-Whitney test av PASW Statistikk 18 system.
Resultater
Tykktarms neoplasier utvikle hovedsakelig WD * mus
Totalt ble det observert en proksimale adenokarsinom og fem adenomer /hyperplastiske polypper i 32 mus på TP1. Betydningen av WD * på CRC risiko i vår mus serien er markert ved at fem av seks mus med neoplasier ble matet med WD * og at WD * forårsaket kreftutvikling også i villtype mus uten arvelig disposisjon, det vil si den eneste karsinom og en adenom ble funnet i
MLH1
+ /+
WD * mus (tabell 2, figur S1). Singelen AIN matet mus utvikler neoplasi (hyperplastisk polypp) var en mutasjon bærer.
Mouse Gruppe
DKK1
uttrykt (n = 16)
DKK1
ikke uttrykt ( n = 16)
MLH1
+ /+
AIN62
MLH1
+/-
AIN3
a5
MLH1
+ /+
WD * 4
b4
c
MLH1
+/-
WD * 35
a, b, bdTable 2.
DKK1
inaktivering og colonic neoplasier i forskjellige muse grupper
en hyperplastisk polypp.;
b adenom;
c adenokarsinom;
d ikke histologisk bekreftet CSV ned CSV
MLH1
+/- og MLH1
+ /+ mus viser lignende mRNA uttrykk mønstre på begynnelsen
I begynnelsen av den eksperimentelle fôring periode (tp0), den MLH1
+/- og MLH1
+ /+ mus viste en bemerkelsesverdig god korrelasjon (Pearsons
R
= 0,989,
P
0,01) mellom mRNA uttrykk mønstre av de 94 gener som inngår i den egendefinerte StellARray RT-qPCR array (figur S2A). Imidlertid skiller seg fra de andre gener, men i overensstemmelse med de forskjellige genotyper, et uttrykk for
MLH1
var omtrent 50% lavere i de heterozygote mus enn i WT mus (figur S2B). Overall, en isogen bakgrunn i begynnelsen gjorde det berettiget til grunn at uttrykket forskjeller som skulle vises mellom de forskjellige mus gruppene senere ble kjøpt og ikke utfallet av arvelig genetisk konstitusjon.
WD * og /eller arvelig predisposisjon er forbundet med differensiell ekspresjon av flere gener ved TP1
i en alder på 12 måneder (TP1), ble ekspresjonen av flere gener funnet å være økt eller redusert sammenlignet med tp0 (tabell 3 og 4). Alle GPR resultater (
P
-verdier og brett endringer) av uttrykk forskjeller mellom ulike mus grupper for alle de 94 genene er i tabell S5. Ni av de 94 genene viste statistisk signifikant (
P
0,05) uttrykk endringer mellom tp0 og TP1 i alle mus grupper (MLH1
+ /+ AIN, MLH1
+/- AIN, MLH1
+ /+ WD *, MLH1
+/- WD *) (tabell 3). Redusert mRNA nivåer ble sett i
Ccnd1 plakater (cyclin D1),
Cdh1 plakater (cadherin 1), og
Mal plakater (Myelin og lymfocytter protein, T-celle differensiering protein), mens økt uttrykk ble sett i
Axin2
,
Cdx1 plakater (Caudal typen homeobox 1),
Fzd10 product: [frizzled homolog 10 (
Drosophila
)]
Mbd2 plakater (metyl-CpG-bindende domene protein 2),
Mbd4 plakater (metyl-CpG-bindende domene protein 4), og
Rasgrf2 plakater (Ras protein-spesifikke guanin nukleotid slippe faktor 2). Siden disse endringene ikke er avhengig av arvelig disposisjon eller WD * de kan være forårsaket av aldring.
MLH1
+ /+
AIN
MLH1
+/-
AIN
MLH1
+ /+
WD
MLH1
+/-
WD
downregulated GenesFold Change (
P
) Brett Change (
P
) Brett Change (
P
) Brett Endre (
P
)
Ccnd1
3,3 (0,003) 3,8 (0.000) 4,3 (0.001) 3,6 (0.000)
Cdh1
5.4 (0.002) 4,9 (0.000) 5,9 (0,002 ) 8,4 (0.000)
Mal
3,4 (0,025) 3,4 (0,014) 3,2 (0.034) 2,7 (0.028) oppregulert GenesFold Change (
P
) Brett Change (
P
) Brett Change (
P
) Brett Change (
P
)
Axin2
2.6 (0.005) 3,0 (0.002) 1,8 (0,039) 1,6 (0.028)
Cdx1
4.1 (0.002) 5,6 (0.000) 3,4 (0.002) 5,4 (0.000)
Fzd10
4.8 (0.002) 7,6 (0.000) 3,4 (0.021) 5.0 (0.000)
Mbd2
3.3 (0,004) 4,7 (0.000) 3,2 (0,003) 5,7 (0.000)
Mbd4
3.0 (0.005) 6.0 (0.000) 3,0 (0,004) 3,3 (0.000)
Rasgrf2
2.3 (0.002) 1,8 (0,006) 2,3 (0,001) 1,5 (0,040) Tabell 3. Gener som viste statistisk signifikant (
P
0.05) mRNA-ekspresjon forskjeller mellom tp0 og TP1 i alle fire mus-gruppene; i kontrollgruppen (MLH1
+ /+ AIN) og de tre studiegrupper (MLH1
+/- AIN, MLH1
+ /+ WD, MLH1
+/- WD).
CSV Last ned CSV
MLH1
+ /+
AIN
MLH1
+/-
AIN
MLH1
+ /+
WD
MLH1
+/-
WD
downregulate GenesFold Change (
P
) Brett Change (
P
) Brett Change (
P
) Brett Change (
P
)
DKK1
2,0 (0.110) 5,1 (0,012) 6,2 (0,003) 7,3 (0,003)
Slc5a8
1,3 (0,078) 1,7 (0,041) 1,3 (0,224) 1,5 (0,032)
Hoxd1
1,1 (0,348 ) 2,0 (0.075) 2,1 (0,019) 1,5 (0,191)
Socs1
1.6 (0.460) 2,7 (0,067) 1,0 (0,485) 3,1 (0,026) oppregulert GenesFold Change (
P
) Brett Endre (
P
) Brett Change (
P
) Brett Change (
P
)
Dkk2
2,2 (0,108) 2,2 (0,037) 1,7 (0,329) 1.0 (0,637)
Rprm
1,4 (0,442) 2,0 (0,017) 1,1 (0,725) 3,3 (0,019)
Acaa1b
2,4 (0,120) 1,8 (0,140) 3,5 (0,124) 9,4 (0.000) Tabell 4. Gener som viser statistisk signifikant (
P
0.05) mRNA uttrykk forskjeller mellom tp0 og TP1 i minst ett av de studiegruppene, men ikke i kontrollgruppen (MLH1
+ /+ AIN).
CSV ned CSV
Statistisk signifikante uttrykk endringer mellom tp0 og TP1 assosiert med arvelig kreft predisposisjon (MLH1
+/-) og /eller WD * ble observert i sju gener (Tabell 4, Tabell S5); redusert uttrykk i
DKK1 product: [Dickkopf homolog 1 (
Xenopus laevis
)]
, Slc5a8 product: [(oppløst stoff carrier familie 5 (jodid transporter), medlem 8]
, Hoxd1 product: (Homeobox D1), og
Socs1 plakater (Suppressor av cytokin signale 1), og økt uttrykk i
Dkk2 product: [Dickkopf homolog 2 (
Xenopus laevis
)],
Rprm plakater (Reprimo, TP53 avhengig G2 arrest mekler kandidat), og
Acaa1b plakater (acetyl-koenzym A acyltransferase 1B).
Det sterkeste uttrykket reduksjon (7,3 fold) ble sett i Wnt signale suppressor genet
DKK1
mellom MLH1
+/- mus fôret med WD *. i heterozygote mus matet med AIN og i WT mus ble matet med WD *, var nedgangen 5,1 og 6,2 ganger i henholdsvis. Interessant, homeobox genet
Hoxd1
viste en aldersrelatert uttrykk nedgang (2,1 ganger) bare i MLH1
+ /+ WD * gruppe, og statistisk signifikant reduksjon relatert WD * ble ytterligere observert når denne gruppen ble sammenlignet med kontrollgruppen (
MLH1
+ /+
AIN) på TP1 (1,9 ganger) (tabell S5). Uttrykket reduksjon av transporter av butyrat
Slc5a8
forbundet bare med
MLH1
heterozygositet (1,5 og 1,7 hos WD * og AIN grupper, henholdsvis), mens
Socs1
, et cytokin signale regulator, var signifikant nedregulert (3,1 ganger) bare hvis begge risikofaktorer var tilstede, dvs. i
MLH1
+/-
WD * gruppe.
uttrykk for
Dkk2
, en annen Wnt signale modulator, ble betydelig økt i MLH1
+/- AIN gruppe (tabell 4), slik at TP1,
Dkk2
uttrykk blant MLH1
+/- mus var signifikant lavere (2,2 ganger) i WD * gruppen sammenlignet med AIN gruppen (tabell S5).
Rprm
viste en statistisk signifikant aldersrelatert uttrykk økning i forbindelse med
MLH1
heterozygositet (3,3 og 2,0. Fold i WD * og AIN, henholdsvis).
Acaa1b
viste en signifikant uttrykk økning i MLH1
+/- WD * mus (9,4 ganger) og uttrykket nivåer viste en signifikant forskjell (5,0 ganger) når
MLH1
+/-
WD * mus var sammenlignet med
MLH1
+/-
AIN gruppe på TP1 (tabell S5).
det var ingen tilgjengelige vevsprøver /ekstrakter for å validere resultatene på proteinnivå. Derfor ble TaqMan RT-qPCR brukes til å validere uttrykk endringer knyttet til kreft-predisponerende
MLH1
mutasjon og /eller WD *. Den isogene bakgrunn og egne resultater som mus viste tilsvarende mRNA ekspresjonsmønstre i utgangspunktet (fig S2A, S2B) gjort det berettiget å kombinere de individuelle prøver (n = 8) fra hver gruppe i bassenger for en etterfølgende bruk i valideringsforsøk. Figur 1 illustrerer forskjellen sett mellom studiegruppene og kontrollgruppen på TP1.
Relativ uttrykk i ulike studiegrupper (MLH1
+/- AIN, MLH1
+ /+ WD *, og MLH1
+/- WD *) blir sammenlignet med kontrollgruppen (MLH1
+ /+ AIN). Hver prøve er en blanding av åtte RNA prøver fra åtte forskjellige TP1 mus som hører til hver mus gruppe. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM (standardfeil av middelverdien) (n = 3), * signifikant forskjell sammenlignet med kontrollgruppen. Median permutasjon metode,
P
0,05. (A)
MLH1
viser det samme 50% ekspresjon forskjell mellom genotypene som ved startpunktet for undersøkelsen. (B)
DKK1
er betydelig ned regulert i kollokviegrupper med WD * og /eller
MLH1
heterozygositet. (C)
Slc5a8
viser ikke signifikante uttrykk forskjeller på TP1. (D)
Hoxd1
er nedregulert i forbindelse med WD * i begge genotyper; den nedregulering er spesielt sterk i MLH1
+ /+ WD gruppe. (E)
Socs1
viser ikke signifikante uttrykk forskjeller på TP1. (F)
Dkk2
er nedregulert i forbindelse med WD * i begge genotyper.
TAQMAN analyser bekreftet observasjon at
DKK1
er en av de mest prominente kandidater med uttrykk i tykktarmen slimhinner endret i forbindelse med arvelig kreft predisposisjon og WD *. På grunn av de lave nivåer av
DKK1
mRNA, RT-qPCR ble utført på pre-forsterket cDNA (forsterkning ensartethet verdi på -0,76).
DKK1
mRNA nivåer ble betydelig redusert sammenlignet med kontrollgruppen (
MLH1
+ /+
AIN) på alle studiegrupper [MLH1
+ /+ WD *, 1,5 ganger (range, 1,4-1,7); MLH1
+/- AIN, 1,4 (1,3-1,5); MLH1
+/- WD *, 1,2 (1,1-1,2)] (figur 1B). Ekspresjonen av
Hoxd1
ble signifikant redusert ikke bare i MLH1
+ /+ WD * mus [1,9 (1,7-2,2)], en som allerede observert i StellARray, men også i den MLH1 funn
+/- WD * gruppe [1,3 (1,2-1,3)] (figur 1D), fremhever effekten av WD * på
Hoxd1
uttrykk. Den TaqMan RT-qPCR også bekreftet viktigheten av WD * på uttrykk for
Dkk2
, hvor i StellARray en statistisk signifikant reduksjon ble sett i MLH1
+/- WD * mus [1,2, (1.2- 1.3)], men nå også i WT mus matet med WD * [1,2 (1,2-1,3),
P
= 0,053] (figur 1F). Uttrykket av
Acaa1b
ble også funnet å være signifikant økt både i MLH1
+/- WD * og MLH1
+ /+ WD * mus [2.6 (2.3 til 2.8) og 1.7 ( 1,7-1,8), henholdsvis] (figur S3). Uttrykket nivåer av
Slc5a8 Hotell og
Socs1
skilte seg ikke mellom kontrollgruppen og studiegruppene (figur 1C, E).
Spesielt, ingen signifikant alder eller diett beslektede uttrykk endringer ble funnet i
Apc
eller
MLH1
. Som i starten, uttrykk for
MLH1
var omtrent 50% lavere i de heterozygote mus sammenlignet med WT mus, noe som indikerer at andre inaktive rammet av
MLH1
hadde ennå ikke skjedd med TP1 ( figur 1A). Uttrykket av
Apc
var lik i begge genotyper (StellARray).
En betydelig økning av DNA-metylering nivåer står godt redusert uttrykk av gener
metylering nivåer av CGIer av gener som hadde vist statistisk signifikant reduksjon i mRNA uttrykk i forbindelse med
MLH1
heterozygositet og /eller WD * (
DKK1, Slc5a8, Hoxd1
, og
Socs1
; Tabell 4 ) ble analysert individuelt for hver tp0 og TP1 mus bruker Sequenom sin MassARRAY EPITYPER
TM system. I tillegg
MLH1
, og
Sfrp1
som hadde vist aldersrelaterte uttrykk nedgang på border betydning (1,4 ganger,
P
= 0,06) i MLH1
+ 0,05.
