Abstract
perihydroxylated perylen kinon hypericin har blitt rapportert å ha potent anti-metastatisk og antiangiogenic aktiviteter, generert ved å målrette ulike veiskille kreftfremmende prosesser via unike mekanismer. Hypericin er den eneste kjente eksogene reagens som kan indusere tvinges poly-ubiquitinering og akselerert degradering av varmesjokkprotein 90 (HSP90) i kreftceller. HSP90 klient proteiner er dermed destabilisert og raskt degradert. HSP70 klient proteiner kan potensielt bli påvirket via hindre dannelsen av HSP90-hsp70 mellom komplekser. Vi viser her at hypericin induserer også forbedret nedbrytning av hypoksi-induserbar faktor 1α (HIF-1α) i to humane tumorcellelinjer, U87-MG glioblastom og RCC-C2VHL – /- nyrecellekreft og i den ikke-maligne ARPE19 retinal pigment epitelisk cellelinje. Den hypericin-akselerert omsetning av HIF-1α, regulatoriske forløperen til HIF-1 transkripsjonsfaktor som fremmer hypoksisk stress og angiogenic responser, overvinner den fysiologiske HIF-1α protein stabilisering som skjer i hypoksiske celler. Den hypericin effekt eliminerer også de høye HIF-1α nivåer uttrykt konstitutivt i von-Hippel Lindau protein (pVHL) -deficient RCC-C2VHL – /- nyrecellekarsinom cellelinje. I motsetning til den vanlige ubiquitin-proteasome sti-avhengig omsetning på HIF-α proteiner som forekommer i normoxia kan hypericin-indusert HIF-1α katabolisme skje uavhengig av mobilnettet oksygen eller pVHL-forfremmet ubiquitin ligation av HIF-1α. Det er mediert av lysosomale cathepsin-B-enzymene med cathepsin-B-aktivitet blir optimalisert i cellene gjennom hypericin-formidlet reduksjon i intracellulær pH. Våre funn tyder på at hypericin potensielt kan være nyttig for å hindre vekst av svulster som HIF-1α spiller sentrale roller, og i pVHL ablated kreftceller som nyrecellekarsinom gjennom eliminering av forhøyede HIF-1α innholdet i disse cellene, skalere ned dreven angiogenese som karakteriserer disse svulstene
Citation. Barliya T, Mandel M, Livnat T, Weinberger D, Lavie G (2011) Nedbrytning av HIF-1alpha under hypoxi Kombinert med Induksjon av HSP90 Polyubiquitination i kreftceller ved hypericin: en unik Cancer Therapy. PLoS ONE 6 (9): e22849. doi: 10,1371 /journal.pone.0022849
Redaktør: Anil Kumar Tyagi, Universitetet i Delhi, India
mottatt: 30 mars 2011; Godkjent: 30 juni 2011; Publisert: 19.09.2011
Copyright: © 2011 Barliya et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert av Israel Cancer Association, Grant 20090033 (https://ica.cancer.org.il/english/) takket være et bidrag av Rick og Rita Weinstein, og to konkurrerende tilskudd fra Tel Aviv University: den Maratier Foundation og Elsa og Leo Abramson Foundation, Tel Aviv University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. G. Lavie har økonomisk interesse i Hy Biopharma Corporation, som utvikler medikament hypericin (beskrevet her) som et middel mot kreft. Imidlertid er selskapet i avanserte kliniske studier og vil neppe få noe fra denne publikasjonen. Forskningen ble ikke finansiert av dette selskapet, og det er ingen annen godtgjørelse til noen av forfatterne. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Dannelse av tumormetastaser ved å spre kreftceller og deres eksplosive veksten er fortsatt den mest utbredte årsaken for kreftbehandling svikt og død. Tumorceller renovere den ekstracellulære matrise, modifisere celleadhesjonsprosesser egenskaper, invadere omkringliggende vev og transmigrere til distale organer for å danne metastaser. Utvikling foci generere hypoksi og et behov for neoangiogenesis å støtte vekst. Hypoksi stabiliserer stressrespons forløper HIF-1α [1], som fører til translokasjon til kjernen via en HSP90 avhengig prosess [2], [3] og heterodimerisering med HIF-1β, generering av den funksjonelle HIF-1 transkripsjonsfaktor. HIF-1 fremmer transkripsjon av ~ 100 stressrespons target proteiner inkludert VEGF. VEGF stimulerer til økt uttrykk av sin primær reseptor VEGFR2. Den VEGF-VEGFR2-komplekser som dannes krever tilknytning til HSP90 for å aktivere den nedstrøms signalisering som iverksetter neoangiogenic kaskade, [4] og aktiverer den integrin-fokal adhesjonskinase (FAK) -Src aliserte kompleks. Både FAK og Src er også HSP90 klient proteiner, noe som krever tilknytning til dette anstand for å opprettholde deres funksjonelle konformasjoner [5], [6]. Disse funksjonene omfatter dannelsen av adhesjoner fokale forbundet med en F-aktin kontraktile apparat som er koblet til cellemembranen og aktiverer overføringen maskineri via interaksjon med den ekstracellulære matrisen [7]. Dermed kan HSP90 hemming forstyrre flere steder i angiogene og celle spredning signalkaskader og forstyrre tumor progresjon.
De markante økningen i HIF-1α innhold som forekommer i mange tumortyper implisere HIF-1 i å fremme onkogenese. Tumorprogresjon akselereres via heterogene mekanismer, inkludert dysfunksjonell /slettet VHL genet i nyrecellekarsinom og hemangioblastom [8], inaktivert IDH1 genet i glioblastom [9], mutasjoner i mitokondrie ravsyre-dehydrogenaser i paragangliom og andre [10]. Faktisk er forhøyet intratumoral HIF-1α (eller HIF-2α) forbundet med akselerert pasient dødelighet, fremgår av retrospektive immunhistokjemiske analyser av parafin innleiret biopsiseksjoner fra forskjellige tumorer [11]. Det er i dag akseptert at avtagende tumor HIF-1α nivåer kan omfatte viktige kliniske fordeler, anspore intensive søk for lite molekyl hemmere av HIF-1α.
reagenser med ulike aktiviteter som kan forstyrre tumor celleproliferasjon, migrasjon og neoangiogenic signalering er sannsynligvis mer effektivt å inhibere dannelsen av metastaser og nytte kreftpasienter. Et slikt potensielt lovende reagens er perihydroxylated perylen kinon – hypericin. Vi fant ut at hypericin hemmer effektivt dannelsen av metastaser av murine bryst og plateepitelkarsinom svulster
in vivo product: [12], tilsynelatende ved å forstyrre signalveier som fremmer angiogenese [13] og tumor celleproliferasjon [14]. Fellesnevneren knytte disse ulike aktivitetene er en unik evne til hypericin å fungere som eksogene induserer tvunget poly-ubiquitinering av heat shock protein 90 (HSP90), destabiliserende og raskt nedverdigende en mengde HSP90-klient proteiner [14].
Her er vi rapportere at hypericin kan degradere HIF-1α i celler via en unik hypoksi og proteasome uavhengig mekanisme. Selv om HIF-1α er en HSP90-klient-protein [15] degradert av andre HSP90-inhibitorer [16], vises hypericin-indusert HIF-1α katabolisme å innebære en unik lysosomal cathepsin-B avhengig mekanisme, aktiveres i en redusert intracellulær pH-miljø. Vi viser også at angiogene signalkaskade kan påvirkes av hypericin på flere steder, noe som gjør dette molekylet potensielt lovende i anti kreftbehandling.
Resultater
Tvungen HIF-1α degradering etter hypoksi av cellen behandling med hypericin
Sikte for å dechiffrere mekanismen for den anti-angiogene aktivitet av hypericin [13], undersøkte vi hvorvidt hypericin påvirker HIF-1α adaptiv stabilisering, som forekommer under hypoxi i fravær av prolin og asparagin hydroksylering [1 ] i tre humane cellelinjer: U87-MG glioblastom celler, RCC-C2
VHL – /- (C2
VHL – /-) nyrekreft celler som mangler pVHL, og ARPE-19 retinal pigment epitelceller. Cellene ble først utsatt for hypericin i 72 timer, den tid som er nødvendig for optimale hypericin effekter for å utvikle og hypoksi generert kjemisk med CoCl
2 og med et lavt oksygenatmosfære (0,5% O
2, 5% CO
2 og 94,5% N
2) for de siste 6 timene av behandlingen for å forhindre hypoksisk cytotoksisitet. HIF-1a nivåene ble analysert i cytosoliske og kjernefysiske fraksjoner av Western blot. Resultatene, fig. 1 viser at eksponering av 10 uM og 30 uM av hypericin effektivt reduserte hypoksi-induserte økninger i HIF-1α nivåer i en hypericin doseavhengig måte i ARPE-19-celler (fig. 1A) og i U87-MG-celler (Fig. 1B ). Reduksjoner i HIF-1α var mer uttalt hos de kjernefysiske fraksjoner av begge cellelinjer, spesielt når hypoksi ble indusert kjemisk med CoCl
2.
[A] ARPE19, [B] U87-MG, [C ] RCC-C2
VHL – /- og [D]. RCC-C2
VHL + (VHL gen rekonstituerte) cellelinjer ble eksponert for 10 og 30 uM hypericin i 72 timer. Kulturene ble utsatt for hypoksiske betingelser med 150 mM CoCl
2 (A og B, øvre panel dubletter), og med en lav oksygenatmosfære (0,5% O
2, 94,5% N
2 og 5% CO
2) (A og B, nedre panel dubletter) for de siste 6 timene av behandlingen. Hypericin forårsaket nedbrytning av HIF-1α. Mekleren av HIF-1α proteolytisk spaltning ble karakterisert ved inhibering av HIF-1α nedbrytning med CA-074 cathepsin B-inhibitor, med MG-132 og med ALLN proteasomal calpain-inhibitorer, administrert til kulturene for de siste 6 timene av inkubasjonen med celler. Cytosoliske ekstrakter og nukleære ekstrakter ble fremstilt, separert på SDS-PAGE og Western blot utviklet med anti-HIF-1α. Lik lasting ble bekreftet med β-Actin. [E]. Effekter av hypericin på intracellulær pH i U87-MG og C2
VHL – /- celler. Kvantitativ BCECF, pH-avhengig fluorescens ble målt spektrofluorimetrisk (FRU betegner Fluorescens relative enheter). [F]. Analyse av rollen hypericin-mediert intracellulær pH reduksjon i å fremme HIF-1α omsetning i henhold CoCl
2 hypoksi, fastsatt følgende cytoplasma alkalisering med 20 mM NH
4Cl brukt i løpet av de siste 6 timer inkubasjon. Cytoplasmatiske alkalisering svekket hypericin-indusert HIF-1α omsetning i henhold CoCl
2 hypoksi.
For å finne ut hvordan hypericin forbedrer HIF-1α degradering vi brukte VHL genet-slettet C2
VHL- /- cellelinjen. pVHL, underlaget anerkjennelse og bindende modul av en E-3 ubiquitin ligase kompleks binder HIF-1α følgende prolyl hydroksylering på HIF-1α Prolyl- hydroksylase domene protein-2 [17], og dermed ubiquitinating HIF-1α og mediere proteasomal nedbrytning av dette stress-respons transkripsjonsfaktor forløper [18]. pVHL mangel forstyrrer dette oksygenavhengig nedbrytning reaksjon, som fører til konstitutiv opphopning av HIF-1α. Vi undersøkte HIF-1α innhold i K2
VHL – /- celler etter 72 timers behandling med hypericin. Konstitutivt høy HIF-1α innhold i K2
VHL – /- celler ble redusert etter eksponering for hypericin (Fig. 1C utstillinger) på en måte som ligner på reduksjoner i HIF-1α observert hos U87-MG og ARPE-19 celler behandlet med hypericin etter hypoksi. HIF-1α eliminering av hypericin i C2
VHL – /- celler som oppsto uavhengig av pVHL og ble funnet å være ufølsomt overfor hemming med MG132 eller ALLN proteasomal calpain-inhibitorer (figur 1C.), Noe som utelukker involvering av ubiquitin-proteasom-reaksjonsveien i denne prosessen. HIF-1α nedbrytning av hypericin ble imidlertid effektivt hemmet av cathepsin-B-hemmer CA-074 i C2
VHL – /- celler (figur 1C.) Og upåvirket av CLI-III, et cathepsin-L-hemmer (data ikke vist). Disse observasjonene tyder på at hypericin forbedret HIF-1α omsetning er formidlet gjennom katabolisme av en cathepsin-B type enzym uavhengig av ubiquitin-proteasome veien
Stabil transfeksjon av VHL til C2
VHL -. /- celler restaurert E3 ubiquitin ligase kompleks funksjonalitet [19], inkludert HIF-1α proteasomal degradering etter normoxia og HIF-1α stabilisering etter hypoksiske betingelser (fig. 1 D). I denne innstillingen hypericin også akselerert HIF-1α degradering under hypoxi, lertid den hypoksi-indusert HIF-1α stabilisering i VHL-rekonstituert RCC-C2
VHL + -celler (C2
VHL + celler) (fig. 1 D). HIF-1α nedbrytning av hypericin i C2
VHL + celler, ble også hemmet av CA-074 (fig. 1D). Dermed forblir cathepsin-B veien hovedveien for HIF-1α nedbrytning av hypericin etter hypoksi følgende pVHL tilberedning.
hypericin utløser reduksjoner i intracellulær pH
Endringen i HIF-1α omsetning fra den fysiologiske pVHL-mediert proteasomal degradering til en cathepsin-B avhengig mekanisme forårsaket av hypericin bedt oss om å undersøke om endringer i intracellulære forhold bidro til dette skiftet. Siden lys-indusert fotodynamisk aktiviteter hypericin lokke fram reduksjoner i intracellulær pH (pH
i) av tumorcelle [20], hypotese vi at hypericin kan også føre til intracellulær pH reduksjon i mørket via Redox aktiviteter, optimalisere forholdene for lysosomalenzymet aktivitet. pH
i ble målt i U87-MG og C2
VHL – /- celler behandlet med 10 og 30 uM hypericin i 72 timer i mørke, overvåking av pH-avhengig esterolytiske spaltning av acetoksymetyl-ester-derivat av BCECF ( se Metoder for detaljer). Til tross for strenge vedlikehold av mørke forhold, registrerte vi hypericin konsentrasjonsavhengig reduksjon i intracellulær pH i U87-MG og C2
VHL – /- celler (Fig 1E.). Cytosoliske pH
i redusert i U87-MG-celler fra et utgangspunkt på 7,12 ± 0,08 til 6,75 ± 0,06 med 10 pM av hypericin (p≤0.05), og til 6,45 ± 0,20 med 30 uM hypericin (p≤0.03). I C2
VHL – /- celler pH
i redusert fra 7,18 ± 0,04 til 6,85 ± 0,28 (p≤0.08) med 10 mm hypericin og til 6,42 ± 0,2 med 30 mikrometer hypericin (p≤0.05). Disse studiene viser at hypericin utløser også konsentrasjonsavhengig reduksjon av mobilnettet pH
i i mørket.
For å avgjøre om redusert pH
i er avgjørende for cathepsin-B mediert HIF-1α nedbrytning av hypericin, effekten av cytoplasma alkalisering med NH
4Cl på HIF-1α cytosolic innhold ble undersøkt i hypericin-behandlede celler. U87-MG-celler ble utsatt for hypericin i 72 timer i mørke og 150 uM CoCl
2 hypoksi indusert i løpet av de siste 6 timer med inkubering i media supplert med 20 mM ammoniumklorid for å fremkalle cytoplasmatisk alkalisering. Cytosolic ekstrakter ble utarbeidet og Western blot utviklet med antistoff mot HIF-1α. Fig. 1F viser at forebygging av intracellulær pH-reduksjonen redusert HIF-1α nedbrytning av hypericin, men ved høyere 30 pM hypericin konsentrasjon noen HIF-1α nedbrytning under hypoxi fant sted. Denne forringelsen syntes å være mindre følsomme for cathepsin-B-hemmer CA-074 og kan gjenspeile involvering av en proteasome vei avhengig mekanisme.
hypericin forstyrrer HIF-1α binding til VEGF og GLUT1 genet promoter HRE sekvenser
hypericin forbedret HIF-1α nedbrytning og påfølgende HIF-1 kjernefysiske innhold mangel, ble antatt å avta HIF-1 interaksjoner med hypoksi responselementer (hres) på stressrespons genet arrangører som VEGF og GLUT1. HIF-1 binding til human VEGF-genet promoter HRE var derfor analyseres i hypericin behandlet U87-MG, C2
VHL – /- og ARPE-19 celler med fluorescens electro Shift Analyser (F-EMSA). Celler ble utsatt for hypericin i 72 timer, nukleære ekstrakter fremstilt og ferd med VEGF promotor HRE elementinneholdende fluorescerende prober DNA-proteinkompleks ble analysert for SYPRO Ruby Fluorescens. I C2
VHL – /- celler som bærer høy baseline HIF-1 innhold, HIF-1 dannet DNA-proteinkomplekser med HRE probe (fig 2A.). Ingen gratis sonden ble oppdaget (SYBER Grønn farging, venstre panel), noe som reflekterer en stort sett bundet DNA probe. Ved behandling med 30 uM hypericin, HIF-1-HRE kompleksdannelse ble merkbart redusert ved de fleste DNA-probe resterende ubundet (kolonne 2)
Funnet på promotorer av:. [A]. VEGF genet, analysert ved fluorescens electro Shift-analyse (EMSA-F). Atom proteiner ble separert på 6% SDS-PAGE, farget med SYBER grønne merket DNA-probe og ubundet protein oppdaget med SYPRO Ruby proteinbinding fluorochrome. Geler ble skannet med FL-5000 laserbasert skanner. [B]. Den GLUT1 genet analysert av kromatin immunoprecipitation (chip). Skåret kromatin ble immunopresipitert med anti HIF-1α antistoff og DNA isolert fra denne kromatin ble amplifisert med primere som er spesifikke for den GLUT1 gen promoter-regionen. [C]. Interferens av hypericin med VEGF promoter aktivering i tumorcellelinjer. Venstre figur – C2
VHL – /- celler. Spor 1 – ubehandlede celler, spor 2-celler som ble behandlet med 30 uM hypericin i 72 timer. Høyre figur – U87-MG celler. Lane 1 – ubehandlede celler, kjørefelt 2 – celler utsatt for hypoksi (150 mikrometer CoCl
2 for siste 6 timer), spor 3 – CoCl
2-hypoksi for siste 6 timer og hypericin 30 mikrometer i 72 timer, og lane 4 -. hypericin, 30 mikrometer for 72 timer
I normoksisk U87-MG celler, HIF-1-HRE komplekse nivåer var lav og øker under hypoksi etterlot ingen påviselig gratis DNA probe. Hypoksi-indusert, ble HIF-1-HRE kompleks formasjon opphevet ved hypericin cellen behandling (Fig. 2A, midtpanelet) forlater DNA-probe stort sett ubundet. I hypoksiske ARPE-19 celler protein HRE komplekse nivåene var høyere enn normoksisk linjene og hypericin effektivt reduserte HIF-1 – sondere bindende. Tilsvarende gratis probe nivåene lave i hypoksiske celler, økt eksponering for hypericin (Fig. 2A, panel til høyre). Behandling med hypericin av cellelinjer med høy HIF-1 nivåer på grunn av hypoksi eller defekt pVHL (C2
VHL – /- celler) resulterte i reduserte interaksjoner med hypoksi responselementer
HIF-1 interaksjoner med andre. stressrespons gen-promoter hres som GLUT1 genet ble også påvirket av hypericin som vist av kromatin immunoutfellingsanalyser. Kromatin fremstilt fra kjerner av hypericin-behandlede og kontrollceller ble skåret og HIF-1 inneholdende fragmenter immunopresipitert med anti-HIF-1-antistoff. HRE-bundet HIF-1-nivåer ble bestemt fra amplifikasjon av ekstraherte DNA ved hjelp av PCR ved bruk av GLUT1 promotor spesifikke prober. I U87-MG celler eksponering for hypoksi resulterte i økte HIF-1 interaksjoner med GLUT1 promoter HRE (Fig. 2B midtre panelet), mens samtidig eksponering for hypericin reduserte mengder promoter bundet HIF-1 (spor 3). Tilsvarende reduksjoner skjedde i ARPE19 celler (Fig. 2B, venstre panel). I C2
VHL – /- celler, hypericin forårsaket dramatiske reduksjoner i GLUT1 promoter-bundet HIF-1 (figur 2B, panel høyre.). Totalt var reduksjonen i HIF-1α cytoplasmatiske innholdet i hypericin behandlet hypoksiske celler også resultert i reduserte modne HIF-1 transkripsjonsfremmende aktiviteter i cellekjerner, minkende HIF-1 interaksjoner med VEGF og GLUT1 gen arrangører.
hypericin forstyrrer VEGF promoter aktivering i tumorcellelinjer
nedgang i HIF-1 binding til VEGF og GLUT1 arrangører forårsaket av hypericin, bedt om analyser av effektene av hypericin på VEGF promoter aktivering. U87-MG og C2
VHL – /- celler ble transient transfektert med en reporter konstruksjon inneholdende den HRE element av VEGF-A-genet (pGL3P-1100). Cellene ble delt opp i 30 mM hypericin behandlede gruppe (i 72 timer) og ubehandlet kontrollgruppe. Luciferase aktivitet ble målt mot pGL3P kjøretøy kontroll vektor transfekterte celler blottet for reporteren konstruksjonen. Fig. 2C (venstre utstillings) viser uttrykk for høy luciferase aktivitet i ubehandlet kontroll C2
VHL – /- transfektant celler, som viste en trend mot trykt luciferase aktivitet i hypericin behandlet C2
VHL – /- celler med ca 40% Dette tyder på at hypericin en tendens til å forstyrre VEGF promoter aktivering i C2
VHL – /- celler, men forskjellene ikke statistisk signifikant (
P
= 0,06, Mann Whitney test). Luciferase nivåer av kjøretøy plasmid pGL3P var lav og lik i begge gruppene (ikke vist).
I U87-MG celler ble VEGF arrangøren også sterkt aktivert i respons til hypoksi (Fig. 2C), mens cellen behandling med 30 mikrometer hypericin helt avskaffet hypoksi-indusert promoter aktivering (
P
= 0,05) (3
rd kolonne). Hypericin alene uten hypoksi hadde ingen virkning på aktivering promoter (4
th kolonne). pGL3P kjøretøy styrevektor transfektanter var lav i alle grupper (ikke vist). Dermed kan hypericin hemme VEGF-arrangøren aktivering henhold hypoksiske forhold via HIF-1α nedbrytning i U87-MG celler.
hypericin modulerer VEGF gentranskripsjon i tumorcellelinjer
nedregulering av VEGF promoter aktivering på grunn av hypericin-indusert HIF-1α katabolisme i hypoksiske celler bedt undersøkelse av virkningene av hypericin-fremkalte, HIF-1α katabolisme på VEGF gentranskripsjon. U87-MG og ARPE-19 celler eksponert for hypericin (72 timer i mørket) ble utsatt for CoCl
2 hypoksi for de siste 6 behandlingsrom timer. RNA ble fremstilt og VEGF transkripsjon analysert ved semi-kvantitativ RT-PCR ved anvendelse av primere som spenner over exon1 og exon8 av VEGF-A-genet. Disse primere forsterke alle seks VEGF spleisevarianter og semikvantitative analyser aktivere differensial profilen analyser av nivåer av hver VEGF skjøte transkripsjon. Resultatene viser at i ARPE-19-celler, hypoksi-indusert modulasjoner i VEGF-spleisevariant transkripsjon profiler. Når hypoksi ble kombinert med eksponering for hypericin, transkripsjon av VEGF
189 og VEGF
165 isoformer som dramatisk økning i henhold til hypoksi ble redusert (fig. 3A), spesielt med 30 uM dose (fig. 3A, spor 4). VEGF
145 uttrykt i ubehandlede kontrollceller og undertrykkes i henhold til hypoksi ble re-uttrykkes følgende hypericin behandling (fig. 3A, spor 4).
A. I ARPE-19 celler, B. i U87-MG celler og C i C2
VHL – /-. Celler
I U87-MG celler baseline nivåer av noen VEGF isoformene henhold normoxia, hovedsakelig VEGF
189 var høy på grunn av hypoksi-uavhengige mekanismer som reaktive oksygenforbindelser [21], NO [22], fosfatidylinositol-3-kinase og MAP-kinase-aktivering gjennom virkningen av mTOR [23], eller tap av IDH1 gen funksjon i glioblastom [9]. Likevel transkripsjon av VEGF isoformer primært VEGF
206, VEGF
165 og VEGF
121 økte følgende celle eksponering for hypoksi. Deres transkripsjon ble redusert etter celle eksponert for 30 uM hypericin (fig. 3B, spor 3). I C2
VHL – /- celler konstitutivt uttrykker HIF-1α, VEGF transkripsjon var følgelig svært høy i utgangspunktet. Eksponering for hypericin (72 timer) induserte reduksjoner i VEGF
206, VEGF
189 og marginalt også VEGF
165 (fig. 3C). Interessant, da hypericin-behandlede celler ble også utsatt for CA-074 (100 ug /ml), den cathepsin-B-inhibitor, som forhindret hypericin-forbedret HIF-1α degradering, VEGF genet transkripsjon ble også stimulert i forhold til celler behandlet med hypericin bare (fig. 3C). Oppsummert hypericin stimulert endringer i VEGF spleise variant uttrykk mønstre spesielt i ARPE-19 celler (figur 3A.) Og også påvises i U87-MG og C2
VHL – /-. Celler
Forebygging av VEGFR2 /KDR uttrykk i hypericin behandlede celler
modulasjoner i VEGF gentranskripsjon mønstre indusert av hypericin-mediert akselerert HIF-1α degradering, garantert analyser av hypericin effekter på mediatorer av angiogenese på proteinnivå. Mulige sammenhenger med HSP90 aktiviteter ble også vurdert på grunn av HSP90 polyubiquitination, inaktivering og nedbrytning som også indusert av hypericin [14], og rollene HSP90 spiller i viktige områder av angiogene kaskade [2], [24].
Effekter av hypericin behandling på VEGFR2 /KDR uttrykk ble undersøkt i de tre cellelinjer, inkludert ARPE-19 fordi VEGFR2 uttrykkes også på RPE celler [25]. Behandlingen med hypericin indusert markert undertrykkelse av VEGFR2 cellular innhold i U87-MG og ARPE-19 celler imidlertid reseptornivåer var upåvirket av nyre C2
VHL – /- celler (Fig. 4A). For å bestemme om redusert VEGFR2 ekspresjon var et resultat av redusert VEGF-produksjon vi supplert dyrkningsmedium av U87-MG og ARPE-19 celler med VEGF (10 ng /ml) med eller uten heparin (1 enhet /ml i 48 timer) en dag etter hypericin administrering og analysert VEGFR2 ekspresjon i disse cellene. Disse behandlingene endret ikke hypericin downregulated VEGFR2 uttrykk og økte ikke VEGFR2 nivåer (data ikke vist). Vi har derfor undersøkt om hypericin modulert VEGFR2 mRNA uttrykk nivåer i disse cellene. RNA ble fremstilt fra hypericin behandlede celler (72 timer i mørket) og semikvantitativ RT-PCR-analyser utført med VEGFR2-spesifikke primere, ved hjelp VEGFR1 som komparativ referanse. Disse forsøk viste at VEGFR2 gentranskripsjon ble effektivt og selektivt hemmet ved hypericin i alle tre cellelinjer, mens VEGFR1 transkripsjon var mindre påvirket (figur S1). De foreslår at hypericin utløser epigenetiske effekter selektivt downregulating uttrykk for VEGFR2 og flere andre gener. Men dette store emnet overgår omfanget av dette manuskriptet, og vil bli nærmere omtalt andre steder.
[A]. Western blot analyser av VEGFR2 proteinnivåer i cytosoliske ekstrakter fra ubehandlede kontrollceller (C), eller celler behandlet med 30 uM hypericin i 72 timer (Hyp). [B]. Farging av U87-MG celler med Phalloidin-FITC. (1) Ubehandlede celler og (2) celler behandlet med hypericin 30 uM i 72 timer. Oransje piler viser F-aktin filamenter; gule piler skildre kollapset aktin dråper etter eksponering for hypericin. [C]. VEGFR2-HSP90 kompleksdannelse etter behandling med hypericin 30 uM i 72 timer. Resultatene av immunoutfelling med anti HSP90-antistoff og utvikling av Western blot med anti-VEGFR2 antistoff. Hypericin redusert VEGFR2-HSP90 kompleks formasjon. [D]. Induksjon av tvang HSP90 poly-ubiquitinering av hypericin (30 mikrometer i 72 timer) i humane kreftcellelinjer. Topplate – immunoprecipitation med anti-HSP90 og Western blot med anti-HSP90 antistoff (kontroll); midtre panelet – immunoprecipitation med anti-HSP90 og Western blot med anti-ubiquitin, og lavere panel immunoprecipitation med anti-ubiquitin og Western blot med anti-HSP90. (I.p. – immunoprecipitation; W.B. – Western blot).
VEGFR2 nedstrøms signal etter aktivering av VEGF-VEGFR2 interaksjoner krever også samarbeid med HSP90 [24]. HSP90 engasjement er relevant for våre analyser av antiangiogenic effekter, fordi vi tidligere rapportert i murine bryst og plateepitel karsinom kreftceller som hypericin induserer HSP90 polyubiquitination og akselerert degradering, destabiliserende og nedverdigende HSP90-klient proteiner i disse cellene [14]. VEGFR2 nedstrøms signal aktiverer alphavbeta3 og fokal vedheft kinase (FAK) for å danne cytoskeletal fokale sammenvoksninger og F-aktin polymerer [24]. FAK og Src er også HSP90 klient proteiner og faktisk hypericin behandling forstyrrer F-aktin polymerisasjon (Fig. 4B). Vi undersøkte derfor hypericin effekter på VEGFR2 tilknytning til HSP90, analysere VEGFR2 trekke ned følgende immunoprecipitation med anti-HSP90 antistoff. Fig. 4C viser at VEGFR2 co-immunopresipitater med HSP90, men dette ko-immunutfelling ble opphevet etter behandling med 30 uM hypericin i alle tre cellelinjer. Denne tilsynelatende universelle funn indikerer at VEGF-VEGFR2-HSP90 kompleks formasjon avtar på grunn av handlingene til hypericin.
Vi har også bekrefter her at hypericin induserer HSP90 polyubiquitination i humane cellelinjer. Immunpresipitasjon av U87-MG og C2
VHL – /- cellelysater med anti-HSP90 trukket ned ubiquitin følgende hypericin eksponering og vice versa: immunoprecipation med anti-ubiquitin trukket ned HSP90 (Fig 4D.)
. HSP90 poly-ubiquitinering forstyrrer den kjernefysiske transport av HIF-1α før nedbrytning av HIF-1α
for å finne ut om hypericin-mediert destabilisering av HIF-1α er også avhengig av hypericin-indusert poly-ubiquitinering av HSP90 vi utførte tidsavhengige evalueringer av effekten av hypericin på HSP90 poly-ubiquitinering og moderne design på HSP90-forbundet HIF-1α cellulære innholdet i U87-MG celler under hypoksi. Cellene ble eksponert for 10 og 30 uM av hypericin i 48 timer ved hvilket tidspunkt HSP90 poly-ubiquitinering ble påvisbart og etter 72 timer når den anstand er blitt degradert [14]. Hypoksi ble indusert med CoCl
2 for de siste 6 timene av forsøket ble cellene lysert, og både cytosoliske og nukleære ekstrakter ble fremstilt. HSP90 ble immunopresipitert med dets tilsvarende antistoff og Western blot utviklet med anti-HIF-1α antistoffer for å overvåke for hsp-90 bundet HIF-1α og med anti-HSP90 som kontroll (Fig. 5A). HIF-1a nivåer bundet til HSP90 ble sammenlignet med total HIF-1α analysert på Western-blots direkte fra hel cytosoliske og atomfraksjoner. Resultatene viser at etter eksponering for hypericin i 48 timer HSP90 ble poly-ubiquitinated, men anstand degradering ble hovedsakelig observert ved den høyeste dose på 30 uM hypericin (Fig. 5A, venstre bilde). Cytosol HIF-1α begynte å bli degradert til 48 timers tidspunkt, bare etter behandling med 30 mikrometer hypericin (Fig. 5B, øvre venstre panel). Men HIF-1α atomtransport ble sterkest opphevet av begge hypericin dosenivåer (Fig. 5B, 48 timers tids punkt 2
nd panel, kjernekraft fraksjon). Dette var på grunn av den høye avhengigheten av HIF-1α atomtransport på intakt HSP90 anstand aktivitet [26]. HSP90 poly-ubiquitinering av hypericin forårsaket tap av anstand aktivitet og hindret den fysiologiske HIF-1α trans-innvandring til kjernen hvor det normalt tar avstand fra HSP90 [27]. HIF-1α bundet til HSP90 og co-immunopresipitert med anti HSP90 antistoff ble også sterkere degradert på grunn av HSP90 ubiquitinering etter 48 timer (fig. 5B, nedre venstre panel). På 72 timer cytosolic HSP90 var svært degradert til under deteksjonsgrensen (fig. 5A, høyre bilde) og påvirket både co-immunopresipitert HIF-1α og HIF-1α transportert inn i kjernen (Fig. 5B, tredje og fjerde bilder). Den totale cytosolic HIF-1α innhold på 72 timer tids punktet ble også sterkt nedbrutt, men noen HIF-1α protein forble synlig. Således cytosoliske HIF-1α forbundet med HSP90 redusert som poly-ubiquitinering av HSP90 øket (figur 5A 30 mikrometer hypericin i 48 timer (venstre panel) og 72 timer (høyre panel) under hypoksiske forhold (150 mikrometer CoCl
2) og HSP90 uttrykk og anstand aktiviteter ble analysert. Cytosoliske ekstrakter ble immunopresipitert med anti-HSP90 og Western blot utviklet som følger: [A] anti-HSP90 antistoffer. [B] anti HIF-1α. Fig. Fig.
