Abstract
Selv om endotelceller apoptose deltar i svulsten krymping etter enkelt høydose strålebehandling, er lite kjent om vaskulær respons etter konvensjonelt fraksjonert strålebehandling. Derfor evaluert vi hypoksi, perfusjon og vaskulære mikro endringer i en orthotopic prostatakreft modell av konvensjonelt fraksjonert strålebehandling ved klinisk relevante doser (2 Gy fraksjoner, 5 fraksjoner /uke). Første, redusert konvensjonelt fraksjonert strålebehandling tumorcelle-proliferasjon og øket celledød med kinetikk kan sammenlignes med human prostatakreft radioterapi. For det andre, injeksjon av Hoechst 33342 eller fluorescerende-dekstraner viste en økt tumor perfusjon i løpet av 14 dager i bestrålte tumorer, som ble korrelert med en tydelig reduksjon av hypoksi. Forbedret perfusjon og redusert hypoksi ble ikke forklares med økt blodkar tetthet, størrelse eller nettverks morfologi. Imidlertid er en svulst vaskulær modning definert ved perivaskulær desmin + /SMA + -celler dekningen ble klart observert sammen med en økning i endotel, zonula okkludens (ZO) -1 positive, intercellulære overganger. Våre resultater viser at i tillegg til tumor celledreping, spiller vaskulær modning et udekket rolle i tumor Reoksygeneringen under fraksjonert strålebehandling
Citation. Potiron VA, Abderrahmani R, Clément-Colmou K, Marionneau-Lambot S, Oullier T, Paris F, et al. (2013) Forbedret funksjonalitet av blodkar under Konvensjonelt Fraksjonert strålebehandling av prostatakreft. PLoS ONE 8 (12): e84076. doi: 10,1371 /journal.pone.0084076
Redaktør: Zhaozhong Han, Alexion Pharmaceuticals, USA
mottatt: 17 juni 2013; Godkjent: 20 november 2013; Publisert: 31.12.2013
Copyright: © 2013 Potiron et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Institut National du Cancer (INCA PAIR-prostata 2010), Association pour la Recherche sur le Cancer, Ligue Nationale Contre le Cancer og regionen Pays de Loire. Finansieringskilde var ikke involvert i innsamling, analyse og tolkning av data, utarbeidelse av manuskriptet og beslutningen om å publisere
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Selv om følsomheten av tumorer til strålebehandling (RT) er i stor grad avhengig av den iboende radioresistance av kreft stamceller [1], andre data tyder på at følsomheten av endotelet spiller også en viktig rolle [2] . Som et resultat av overdreven produksjon av angiogene molekyler, blodårer i faste tumorer vise karakteristiske trekk som dilaterte mikrokar, ufullstendig endoteliale foring, kompresjon av tumorceller, overdreven forgrening og meget uregelmessig arkitektur. På cellenivå, er en ufullstendig modning av kapillærene bemerket med fraværende eller frittliggende perivaskulær celler, fraværende eller for tykk basalmembran og mangel på endotelceller veikryss. Denne unormale blodkar bevirker hypoksi som ytterligere påvirker effekten av bestråling, fordi 1) mangel på oksygen reduserer mengden av reaktive oksygenarter som induseres ved bestråling og 2) hypoksi velger radioresistant mutante celler [3]. Under fraksjonert strålebehandling, øker andelen av hypoksiske celler raskt etter behandlingen fraksjonen siden normoksisk celler er fortrinnsvis og hurtig drept ved bestråling. I løpet av de neste timer, på grunn av redusert oksygenforbruk av ødelagte celler, forbedret perfusjon, og redusert celletetthet, kan hypoksiske tumorceller få en lettere tilgang til oksygenering, og derfor blir mer følsom for den påfølgende fraksjon av bestråling. Denne prosessen med reoksygenering antas å gi en terapeutisk fordel for å CFRT gjennom en progressiv reduksjon av normoksisk tumorceller og lettere tilgang av hypoksiske celler til oksygen [3].
blodkar er i stor grad påvirket av RT, avhengig av antall av fraksjoner, dose rente, totale stråledose og brøkdel størrelse [4], [5]. Enkelt høydose stråling kan forårsake hurtig apoptose av blodkar [6], [7]. I tillegg er både enkelt høy-dose og hypofractionated bestrålingen induserer endotelisk celle apoptose, og dermed redusere vaskulær tetthet [8], med overlevende fartøyer mer utvidet [9], [10]. Men betydningen av vaskulære skader i tumorer motta konvensjonelt fraksjonert strålebehandling (CFRT: 1,8 til 2 Gy per fraksjon) er mer kontroversiell [11], [12]. I normale hjerneblodårer, antyder meget nylig informasjon som omvendt til større doser induserer en 2 Gy-bestråling minimal endotel celle apoptose, etterfulgt av en senere økning i kar diameter, mikrovaskulær tetthet og fartøyet leakiness [13]. Imidlertid hvilende endotelceller som er mer motstandsdyktig mot bestråling enn prolifererende endotelceller [14], [15]. Derfor kan effekten av CFRT på tumor endotelet avviker fra det normale endotel. Videre, for å forstå effekten av klinisk strålebehandling, spesifikke studier på tumorblodårer har å bli gjennomført i ortotopiske modeller siden omfanget av hypoksi og vaskularisering er i stor grad påvirket av området av svulst engraftment [16], [17].
for å studere effektene av CFRT på svulsten blodkar og hypoksi, vi valgte en prostatakreft modell, fordi CFRT opp til en total dose på 74-80 Gy spiller en stor rolle i lokaliserte prostatakreftpasienter [18], og fordi responsen av prostatatumorer til bestråling er svært følsom for hypoksi [19], [20]. Dessuten, prostatacancere viser terminalvekststans funksjoner som den dominerende modus for strålings-indusert celledød [21], [22], og denne langsomme kinetisk i celledrap følgende RT kan i stor grad påvirke tumor reoksygenering. Vi analyserte utviklingen av svulsten og blodkar strukturelle og funksjonelle endringer og deres innvirkning på svulsten mikromiljøet ved hjelp av en klinisk relevant fraksjone ordningen (2 Gy x 5 fraksjoner /uke i 2 uker) i en orthotopic prostatakreft modell. Våre resultater tyder på at omvendt til hypofractionated strålebehandling, betyr CFRT ikke påvirke fartøyets tetthet, men remodels tumor blodkar ved å øke perivaskulær dekning, bedre fartøy perfusjon og fører til redusert oksygenmangel.
Resultater
Konvensjonelt fraksjonert stråling terapi kontroller prostata tumorvekst
for å studere endringer av svulsten og dens mikromiljøet i løpet av en klinisk relevant protokoll av strålebehandling, induserte vi orthotopic prostatakreft hos mus. To uker etter at cellene ble injisert, tumor-bærende dyr fikk en daglig dose på 2 Gy bestråling sentrert på underlivet, hver dag i uken i to uker (konvensjonelt fraksjonert strålebehandling, CFRT Fig. 1A). Denne protokollen etterligner de første to ukene av strålebehandling for pasienter med prostatakreft. Dyrene ble avlivet og analysert ved 0 ° C (ikke-bestrålt), 1 (2 Gy), 3 (6 Gy), 7 (10 Gy) og 14 dager (20 Gy) under behandlingen. Som forventet, bestråling førte til en markert nedgang i tumor vekt sammenlignet med ikke-behandlede dyr (bestrålt: 237 ± 37 mg vs ikke-bestrålt: 777 ± 135 mg, p 0,01, figur 1B.). Også bestråling hadde en gunstig effekt på prolifererende tumorceller, sammenlignet med tilstøtende friskt vev (Fig. 1C). Reduksjon av celleproliferasjon var synlig fra dag 1, og mer uttalt med tiden (-54% ved t14 vs. t0, s 0,01, figur 1D, E.). Parallelt økt celledød hurtig ved dag 3 (+ 109%, p 0,05) og forble ikke-vesentlig høyere enn grunnlinjen etter dette (figur 1D, F.). Samlet er disse resultatene er i tråd med den langsomme-kinetisk respons observert for pasienter med prostatakreft.
(A) Scheme av den konvensjonelle fraksjonert strålebehandling (CFRT) protokoll som brukes for behandling av etablerte prostatakreft. (B) Vekt av dissekerte svulster etter den angitte tiden av CFRT. Verdier = gjennomsnitt på n≥6 ± sem. Statistiske sammenligning vs t14 bestrålt. (C) Eksempel på en svulst behandlet i en uke, og viser TUNEL + tumorceller ( «T») og normale tilstøtende vev ( «N») hovedsakelig TUNEL-. Tumor og normalt vev ble identifisert med DAPI basert på kjerner morfologi, størrelse, fargeintensitet og romlig organisering av celler. (D) Pseudo-confocal bilder av svulster under CFRT, farget for Ki-67 /TUNEL /CD31. (E, F) Bilde kvantifisering av celleproliferasjon (Ki-67 indeks, E) og celledød (TUNEL indeks, F). Statistiske sammenligninger vs. t0.
CFRT reduserer hypoksi og øker svulst perfusjon
Hypoksi resultater fra oksygen overforbruk av tumorceller samt tumor blodkar unormalt. For å bestemme mønsteret av hypoksi, en stor radioresistance faktor, under CFRT, brukte vi den ytre markør EF5 [23], som fremhever alvorlig. ( 0,2% O
2), radiobiologically-relevant hypoksi (Fig S1 A-C ). EF5-positive overflate var moderat øket på dag 1 (+ 45%), selv om det ikke er vesentlig, med noen hypoksiske områder i nærheten av blodkar, noe som tyder på at ikke alle skip ble perfusert (fig. 2A-B). Men redusert hypoksi i alle tidspunkter, å nå bare 11,4% av t0 på 2 uker (p. 0,05, 2A-B).
(A) Pseudo-confocal bilder av svulster under CFRT, farget for hypoksi (EF5) og endotel-celler (CD31). (B) Bilde kvantifisering av EF5 + overflate i svulster under CFRT. Verdier representerer gjennomsnittet av n≥13 per poeng ± sem. (C) Pseudo-confocal bilder av svulster perfused med Hoechst 33342 og 10 kDa /2 MDA dekstraner før (t0) eller etter 2 uker med CFRT (t14). SYBR grønn ble anvendt som en counterstain av totale cellekjerner. (D, E, F) Bilde kvantifisering av Hoechst + (D), og medium (E) og store (F) dextran + overflater i tumorer i løpet av CFRT (n = 6). (B, D, E, F). Statistiske sammenligninger vs. t0.
For å vurdere fartøyet funksjonalitet, ble fluorescerende molekyler av forskjellige størrelser intravenøst. Store (2 MDA dekstran) molekyler som forblir intra konto for perfusjon, middels (10 kDa dekstran) for interstitiell diffusjon og små (Hoechst 33342, 616 Da) for permeabilitet. Mens i ikke-bestrålte tumorer, bare adskilte områder ble positivt farget, ble fordelingen overflaten av alle molekyler i stor grad økt etter 2 uker med CFRT og var mer homogen (fig. 2C-F). Fordeling av Hoechst nådde en verdi nær den for normal prostata (t0: 0,10 vs. t14: 0,33, s 0,01, figur 2C-D; normal:. 0,41, Fig S2.). Den samlede overflate av medium (10 kd) og store (2 MDA) dekstraner ble også øket (t0: 0,011 vs. t14: 0,029, p 0,05, figur 2C, E og t0: 0,0054 vs t14:. 0.010, p 0.05, fig. 2C, F), selv om det ikke er sammenlignbare med normale vev (0.12 og 0.02, fig. S2) som microvessel tetthet (MVD) er ≈ 3 ganger lavere i tumorer (fig. S3a-C). Begge dekstraner forble punctuated, og viser ingen tegn til vesentlig diffusjon som ville representere fartøy leakiness (2 MDA) eller unormal permeabilitet (10 kDa). Den tilsvarende økning uavhengig av molekylstørrelse er i samsvar med en økning i perfusjon (for eksempel økt blodstrøm). Interessant nok ble det ikke observert noen signifikant økning i perfusjon i normal prostata acini (fig. S4A-D). Således CFRT fortrinnsvis forbedrer fartøyets perfusjon i sammenheng med svulsten mikromiljøet.
CFRT ikke induserer forandringer i fartøyets tetthet, har størrelse eller fordeling
Forbedret perfusjon i forbindelse med tumor kjemoterapi vært forbundet med vaskulær normalisering, og potenserer strålebehandling [24]. Men endringer i tumorassosiert blodkar under CFRT er ikke undersøkt. Vi undersøkte derfor microvessel tetthet og struktur i tumorer bestrålt til forskjellige tider. MVD var stabil i løpet av tiden løpet av eksperimentet, fra 51 ± 8 microvessels /mm
2 ved t0 til 54 ± 7 ved t14 (fig. 3A), i motsetning til ubestrålte tumorer, noe som viste en signifikant økning (fra 47 ± 7 80 ± 8, s. 0,01, fig s5a, B). Av notatet, er dette godt under det som er observert i normal prostata med en MVD på 166 ± 6 (fig S3C, p. 0,01 vs. svulst på t0), noe som kan forklare den hypoksi påvist hos ubehandlede tumorer. Vedlikehold av MVD bedt oss å avgjøre om endothelial celledød oppstår under CFRT. Derfor har vi målt tunel indeksen i CD31 + celler. CFRT induserte ikke EC-død (fig. 3C, D), til tross for en tendens på dag 1 (+ 28%, p = 0,37) som var sammenhengende med den ikke-signifikant MVD minimum på dag 3 (fig. 3A). Dessuten er mengden av TUNEL + farging var ikke i overensstemmelse med massiv endotelial celleskade. Deretter på kontoen for blodkar distribusjon heterogenitet, vi bestemt avstand av celler (identifisert av DAPI) til nærmeste fartøy. Ved hjelp av denne analysen, liten og forbigående MVD reduksjon observert på dag 3 (Fig. 3A) resulterte i en mild, men ubetydelig forskyvning av celler mot en teoretisk hypoksisk miljø (mer enn 100 um fra det som ligger nærmest fartøyet, figur 3B.). Imidlertid, på det tidspunkt hvor hypoksi var fraværende og perfusjon ble øket (t14), idet avstanden profilen av celler i blodkarene var identisk til ubestrålte tumorer (t0: 21,3 vs. t14: 24,9% av cellene ved mer enn 100 um). I tillegg, var verdiene i stor grad lengre enn de som påtreffes i normal prostata (S3A, F). Dermed kan den økte leveranser av Hoechst /dekstraner observert etter bestråling skyldes fartøy kvalitet fremfor kvantitet. Derfor analyserte vi fartøyet nettverk morfologi ved å skanne vev over 100 mikrometer tykkelse. Ikke desto mindre, i forhold til ubestrålte tumorer, tumorer høstet på dag 14 under CFRT viste ingen forskjell i kar forgrening (t0: 8,9 gren /mm vs. t14: 7,6, p = 0,32, fig 3E, F.), Diameter (t0: 9,5 um vs t14: 8,6 um, p = 0,21). Samlet indikerer disse resultater at den reduserte hypoksi /forsterket perfusjon i løpet av CFRT ikke korrelerer med bedre vaskulær tetthet, topografi eller morfologi.
(A) microvessel tetthet i tumorer i løpet av CFRT. Verdier representerer gjennomsnittet av n≥13 per poeng ± sem. (B) Avstand profil mellom celler og det nærmeste blodåre, fra svulster under CFRT. Profilene er basert på n≥13. Statistiske sammenligninger vs. t0. (C) Pseudo-konfokale bilder av tumorassosierte blodkar (CD31 +) farget for TUNEL under CFRT. Piler: TUNEL + /CD31 + celler. (D) Bilde kvantifisering av CD31 + /+ TUNEL overflate. Verdier representerer gjennomsnittet av n≥13 per poeng ± sem. (E) Representative Z-stack bilder av 100 mikrometer tykk tumorsnitt før (t0) eller etter 2 uker med CFRT (t14) og farget for blodkar (CD31 + /Fli-1 +). (F) Bildeanalyse av blodkar nettverk fra 100 um tykke tumorsnitt. Verdier representerer gjennomsnittet av n = 9 per poeng ± sem.
CFRT induserer modning av karveggen
Unormale kreft fartøy viser ofte ikke-sammenhengende endothelial veggen, noe som resulterer i forsterket permeabilitet og leakiness. Å sette pris på endothelial veggen samhold, vi farget for zonula-okkludens (ZO) -1, et protein som er involvert i tett veikryss. Endothelial (CD31 +) – bestemt ZO-1-indeksen var signifikant oppregulert etter 2 uker med CFRT (+ 38% av t0, p. 0,05; fig 4A, B). Enda viktigere, dette var assosiert med økt dekning av endotelceller med alfa glatt-muskel-aktin (SMA) positive celler (+ 111% av t0, s 0,05, Fig. 4A, C). Ved konfokal mikroskopi og histogramanalyse ble ZO-1 bekreftet til å være endotelial (innvendig CD31-uttrykkende celler), og uttrykkes kontinuerlig, spesielt etter bestråling (fig. S6a-B). I motsatt, SMA var ikke-endothelial og sidestilt til endothelial veggen. Å presis natur perivaskulær celler, vev ble co-farget for desmin, en pericyte markør [25]. I tillegg til SMA-indeksen, ble desmin + perivaskulære celler også øket (t0: 0,034 vs. t14: 0,065, p 0,01; figur 4D.). Videre SMA og desmin ble co-uttrykt av de samme celler (fig. 4E, F). Dessuten er frekvensen for desmin + /SMA + dekket fartøy fordoblet mellom dag 0 og dag 14 av CFRT (t0: 20,0 vs. t14: 39,4, p 0,05). Av notatet, SMA og desmin ble også co-uttrykt i de sjeldne dekket ikke-bestrålte fartøy (Fig. S7). I normal prostata, ble desmin uttrykt av både mikro (intra-acini) og makro (inter-acini) -vessels, selv om SMA ble strengt begrenset til makro fartøy (Fig.S3A, D-E, Fig. S8A-B). Dessuten ble det ikke oppregulering av SMA påvist i bestrålte normal mikrovaskulatur (fig. S9A, C), og heller i ikke-bestrålte tumor microvessels (fig. S5C, D). Således, er økningen av perivaskulære desmin + /SMA + celler spesifikt av bestrålte tumor mikrokar.
(A) Pseudo-konfokale bilder av tumorblodkarene under CFRT og farget for ZO-1 /CD31 (øverst) eller SMA /CD31 (nederst). (B, C). Bilde kvantifisering av ZO-1 + /CD31 + (B) og peri-CD31 + SMA flatene (C). Verdier representerer gjennomsnittet av n≥13 per poeng ± sem. (D) Bilde kvantifisering av peri-CD31 + desmin overflate og hyppigheten av desmin + /SMA + fartøy. (B, E, D) Statistiske sammenligninger vs. t0. (E) Representative konfokale bilder av et blodkar fra en 14-dagers behandlede tumor farget for CD31 /desmin /SMA. (F) histogram analyse av CD31 /desmin /SMA pseudocolor profilen til confocal bilde tverrsnitt.
Diskusjoner
Selv om flere studier antyder at bestråling fører til fartøy ødeleggelse, effekten av konvensjonelt fraksjonert bestråling har vært stort sett uutforsket. Vi brukte en orthotopic modell av prostatakreft med en klinisk relevant fraksjone ordningen, indusere beskjeden celledød, økende spredning arrest med dose og differensialeffekt mellom normal /tumorceller. Vi finner at CFRT nesten avskaffet svulsten hypoksi etter 2 ukers behandling, sammen med økt perfusjon. Uventet ble disse effektene ikke er forbundet med betydelige endringer i fartøyets morfologi eller densitet, men snarere med fenotypisk modning av karveggen, inkludert endotelceller (CD31 + /ZO-1 +) og pericytes (desmin + /SMA +). Samlet er disse observasjonene tyder på at vaskulær tilpasning spiller en udekket rolle i tumor Reoksygeneringen under fraksjonert strålebehandling.
Vi har ikke observere en drastisk økning i apoptotiske endotelceller 24 timer etter daglig 2 Gy bestrålinger, og MVD holdt seg stabil, konsekvent med nyere informasjon i normale hjernen blodkar [13]. Disse resultatene er i kontrast med tidligere studier som bruker høyere dose bestråling, hvor endotelial celledød og nedgang i kar tetthet ble rapportert, selv om på tidligere tidspunkter [2], [4]. Spesielt fraksjoner av 4 og 12 Gy for 2-3 uker førte til økt endotelceller død og redusert MVD i subkutane svulster [8], [9], [10]. Dette er overraskende siden endothelial apoptose er tenkt å skje bare ved enkeltdoser ≥ 10-15 Gy [2], [4]. Imidlertid kan EC død avhenge av tumor omgivelser, ettersom bare små vaskulære endringer ble notert 24 timer etter en enkelt dose på 15 Gy i en annen prostatakreft modell [26]. Forskjellige endotelcelle tilstander mellom studier kan ta hensyn til forskjeller i Radiosensitivity, siden hvilende endotelceller som er mer motstandsdyktig mot DNA-skade indusert ved bestråling, men ikke til kortvarig membran-indusert celledød [14] [15]. Dette kan forklare at de observerte økninger i pericytic dekning og perfusjon var bare signifikant i det bestrålte svulst rommet, hvor mikrovaskulær miljøet kan være mer lydhør /givende. Disse resultater illustrerer kompleksiteten i tumorvaskulaturen og dens heterogene respons til behandlinger. Kanskje betydningen av en ortotopisk innstillingen er ofte under pris på siden blodkar vise sterk heterogenitet mellom organene (f.eks androgen reseptor ekspresjon for prostata endotelet, blod-hjerne-barrieren etc ..). Faktisk, PC3-avledede tumorer dyrket subkutant ha vesentlig større fartøy størrelse og tetthet (≈ x3, data ikke vist). Viktigst, nyere studier med høyere andel doser er i samsvar med vårt arbeid for en reduksjon i tumor hypoksi og økt perfusjon sammen med pericyte dekning [9], [10], bortsett fra en rapport ved hjelp av svært høy (30 Gy) enkeltdose bestråling [ ,,,0],27]. Kollektivt, disse studiene tyder på at økt perivaskulær dekning kan spille en viktig rolle i fartøy perfusjon og Reoksygeneringen etter fraksjonert bestråling.
Bevare blodkar er nå sett positivt for kreftbehandling, på grunn av begrepet vaskulær normalisering. Konseptet utover denne observasjon var at ødelegge vaskulaturen ville produsere hypoksi som gjengir bestråling mindre effektiv. Den opprinnelige observasjon var at inhibering av angiogenese overproductive med et anti-VEGFR2 antistoff rekrutterer pericytes midlertidig og nedregulerer tumor hypoksi [24]. Siden ukontrollert EC spiring har vært assosiert med ikke-funksjonell angiogenese, kan bestrålingen-indusert beskjæring av vaskulære spirer resultere i redusert kompleksitet og forbedret nettverk perfusjon [15]. Men vi fant ikke viktige funksjoner som karakteriserer normalisert blodårene siden forgrening, MVD, tortuosity og fartøy diameter var uendret. Selv om perfusjon var lik i noen aspekter, slik at for den normale prostata, kar fenotype var klar, med høyere ZO-1 i bestrålte fartøy enn det som normalt forekommer. I tillegg, i normal prostata, omkretsen av mikroårer var konsekvent desmin + /SMA-, mens SMA ekspresjon var strengt begrenset til store, inter-acini fartøy. Dette vaskulær hierarkiet er også funnet i prøver fra mennesker [28]. I motsetning til dette bestråles tumoren mikrokarene (≈ 10 um diameter) fikk perivaskulær SMA uttrykk. Disse data indikerer at beholderveggen kan skille entydig etter bestråling, i samsvar med andre rapporter på perivaskulær celle respons til inflammatoriske spenning (TGFb, PDGFb).
Aberrant ekspresjon av endoteliale synaptiske proteiner, inkludert ZO-1, kan det oppstå i fravær av endotelial cellepolarisering [29] eller kort tid (f.eks min.) etter bestråling [30]. Men den økede endotelial ZO-1 observert her etter 2 uker er sannsynligvis relatert til fartøyet stabilisering siden 1) perfusjon våre data tyder på at de fleste skip er effektivt lumenized og 2) mønsteret av ZO-1 er membranøs, lineær og kontinuerlig. Som for perivaskulær modning, den nære tilknytning til CD31-motfarget endotelceller og tilstedeværelsen av to markører (desmin /SMA) identifisere de omgivende celler som pericytes [25]. Perivaskulær celler er viktige regulatorer av vaskulær formasjon, stabilisering, ombygging og funksjon for å generere en moden, hvilende blodkar [31]. Modning av skip skjer gjennom gjensidig parakrint signale der EF-avledet faktorer tiltrekke pericytes og senere favør etablering av endotelcelle veikryss [32]. Av betydning, pericyte-skilles signaler beskytte egenkapitalbevis fra stråleindusert død
in vitro product: [33]. Dette tyder på at fartøy uten pericyte dekning vil være mer utsatt for stråling, som hypotese nylig av Chen et al [9]. Derfor kan fraksjonbestrålings regimer, som gir mulighet for vaskulær modning, forbedre svulst vaskulær funksjon.
Våre data indikerer en reduksjon av hypoksisk brøkdel etter to ukers behandling og er i overensstemmelse med nyere data i subkutane svulster [9 ], [10], [34]. Tumor reoksygenering ble definert som det konseptet at kronisk hypoksiske tumorceller få en bedre tilgang til oksygen i løpet av fraksjonert strålebehandling fordi aerobe tumorceller blir eliminert ved tidligere fraksjonene [35]. I vår modell, tumor reoksygenering skjedde ikke bare i sammenheng med redusert tumorcelle-proliferasjon og økt celledød, men også med en forbedret funksjonalitet av vaskulaturen dokumentert av perfusjon og diffusjon av små molekyler. Dette betyr at tumor reoksygenering er ikke bare på grunn av øket avliving av tumorceller og mindre oksygen forbruk, men også til en bedre fordeling av oksygenet av blodkar. I ulike eksperimentelle tumormodeller samt i kliniske studier, ble intertumoral heterogenitet i kinetikken til oksygenmetning ved fraksjonert vist [36], [37], [38], [39]. For eksempel, i squamous cell carcinoma, redusert hypoksi under CFRT i et flertall av tumorlinjer, mens det i visse tumorcellelinjer ble det observert en tidsmessig økning eller ingen endring og brøkdel av perfuserte fartøy og vaskulært område viste bare moderate endringer [34]. Videre tyder våre resultater at under CFRT, er nødvendig stabilisering av skip, slik at de to
nd uke fraksjoner bli mer effektiv. Mens det er en økende interesse i høye doser hypofractionated protokoller, særlig i prostatakreftpasienter [40] Disse data reiser spørsmålet om slike protokoller bevare den fordel at med økende oksygennivå og derved den terapeutiske indeks [41]. I andre tumormodeller imidlertid hypofractionated (3 Gy /fraksjon radioterapi) forbedret oksygenering bare i løpet av den tidlige fase av behandlingen, men førte til en betydelig reduksjon av tumor-oksygenering i den senere fase av bestråling ( 45 Gy) [42]. Dermed er behov for mer kunnskap om påvirkning av vaskulær modning på Radiosensitivity av tumorceller.
I sammendraget, fant vi at konvensjonelt fraksjonert bestråling induserer vaskulær modning, sammen med økt perfusjon /redusert hypoksi. Disse resultatene antyder at den vaskulær mikromiljøet spiller en rolle i tumor reoksygenering, i tillegg til de kjente effekter på tumorceller. Det er uklart om hypofractionated protokoller kan tillate vaskulær modning eller i stedet føre til vaskulær sterilisering og hypoksi. Virkningen av slike protokoller på tumorblodårer og på klinisk utfall bør være utsikter til videre studier.
Materialer og metoder
ortotopiske prostata tumorigenesis og vev samling
Seven -week gammel mannlig NMRI-nakne mus (Janvier, Saint Berthevin, Frankrike) ble bedøvet ved bruk av ketamin /xylazin (50/15 mg /kg) og 2 × 10
6 PC3-luc celler (Caliper Life Sciences, Villepinte, Frankrike ) ble injisert i venstre dorsolateral flik av prostata ved kirurgi. Etter to uker ble tumoropptak verifisert av luminescens bruke en PhotonImager (BiospaceLab, Paris, Frankrike) og grupper med lignende svulst bioluminesens signal ble dannet. Eksperimenter begynte 3 dager senere. Når det er hensiktsmessig, ble dyrene avlivet, ble vev ble skåret ut og vektet hvis det er nødvendig, og frosset (-80 ° C) innebygd i oktober medium (Sakura Finetek, Villeneuve d’Ascq, Frankrike). Prøvene ble samlet ved neste CFRT brøkdel, for å analysere svulst tilstand på det tidspunktet hvor det bør behandles.
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til den europeiske rådsdirektiv 2010/63 /UE og godkjent av den lokale Animal Care og bruk Committee (Comité d’Ethique en eksperimentering Animale des Pays-de-la Loire, C2EA-06).
In vivo
hypoksi og perfusjon
Hypoksi og perfusjon ble bestemt ved bruk av spesifikke markører som ble administrert iv i saltvannsbuffer. For hypoksi ble 300 pl av 3 mg /ml EF5 (hypoxia-imaging.org) injisert i 2 timer før det går på bekostning [23], [43], mens 300 ul av blandede perfusjon markører (1,6 mg /ml Hoechst 33342, 0,6 mg /ml Alexa
647-10 kDa dekstran og 3 mg /ml rhodamine-to MDA dekstran, Life Technologies, Saint Aubin, Frankrike) ble injisert tre minutter i forkant av vev samling [44] vev ble snap-frosset, cryosected, kontra med SYBR Grønn (Fisher Scientific, Illkirch, Frankrike) for total cellekjerner og montert i Forleng Gold uten DAPI (Life Technologies).
Strålebehandling
bestrålinger ble utført ved hjelp av en CP-160 X-ray stråle (Faxitron, Lincolnshire, IL) med en 0,3 mm Cu filter, en akselererende spenning på 160 kV og en dose på 1,3 Gy /min. Dyr fått en dose (brøkdel) av 2 Gy daglig mandag-fredag for to uker, sentrert på en nedre del av magen innen 2 cm x 2 cm ved hjelp av bly skjold designet for å minimere stråling til normalt vev og bein (hofter). Denne ordningen (her definert som konvensjonelt fraksjonert strålebehandling, CFRT) er standard klinisk praksis for prostatakreft
Immunohistochemistry
Vev ble cryosected på 5 mikrometer tykkelse. (Unntatt for nettverksanalyse: 100 mikrometer) fast med 4% paraformaldehyde og permeabilized med 0,05% Triton-X100. IHC ble gjort ved hjelp av standard farging og vaskeprosedyrer [45]. For fler farging ble antistoffer inkubert i rekkefølge: den første, over natten etterfulgt av sekundær og fiksering, og CD31 som det andre og SMA som den tredje. Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt: rotte anti-mus CD31 (BD Biosciences, Le Pont-de-Claix, Frankrike), kanin anti-ZO-1 (Life Technologies), kanin anti-desmin (Ozyme, St-Quentin-en- Yvelines, Frankrike), kanin anti-Ki67 (Dako, Les Ulis, Frankrike), kanin anti-Fli1 (Fisher Scientific) Alexa488-konjugert mus anti-EF5, Cy3-konjugert mus anti-alpha glatt muskel aktin (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, Frankrike). De sekundære antistoffer var: Alexa
647-konjugert geit anti-kanin, Alexa
488-konjugert geit anti-rotte (Life Technologies). TUNEL ble utført som anbefalt av produsenten (Roche, Boulogne-Billancourt, Frankrike) som siste flekker trinn. Lysbilder ble montert i Forleng Gold med DAPI (Life Technologies) for kjerner kontra (unntatt for perfusjon analyse).
Lysbilder ble observert under en Axiovert 200M ApoTome ( «pseudo-confocal») mikroskop, med Axiovision 4.8 programvare ( Carl Zeiss, Le Pecq, Frankrike). Mosaikk av felt opp til 4 mm
2 ble registrert ved 63x olje objektiv, og fire Z-trinn på 1 mikrometer ble stablet inn i ett bilde. Skiver av 100 mikrometer tykkelse ble vanligvis registrert i ≈ 60 Z-trinn på 1 mikrometer, på grunn av vev utflating etter dehydrering. Konfokalmikroskopi ble gjort med en A1R (Nikon Instruments, Champigny-sur-Marne, Frankrike) med Nis-Elements, et numerisk apertur på en og skive skanning gjennomsnittsberegning av 4.
Bildeanalyse
Analysene ble gjort på ukomprimerte opprinnelige 16-bits bilder med høy oppløsning mosaikker (pseudo-confocal), med unntak av fargefordelingen langs fartøyet tverrsnitt (konfokal; «histogram analyse», se senere). To typer verdier ble målt: verdier for overflatebaserte analyser samsvarer med fargeflater (um
2) betraktet som positiv for farging av interesse (ex, CD31 området) delt på overflaten av regionen av interesse (ROI; ex , total vev); Verdiene for objektbaserte analyser samsvarer med det absolutte antall elementer som anses positiv (ex, antall fartøyer) delt på overflaten av ROI (ex, total vev).
Overflate-baserte analyser ble utført ved anvendelse av ImageJ 1.46r programvare (National Institutes of Health, USA).
