Abstract
Bakgrunn
Identifikasjon av prediktive biomarkører er avgjørende for en vellykket utvikling av målrettet terapi. Insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF1R) er blitt undersøkt som et potensielt terapeutisk mål for ulike kreftformer. Men nyere kliniske studier viste at anti-IGF1R antistoff og kjemoterapi ikke er effektive for behandling av lungekreft.
metodikk /hovedfunnene
For å definere biomarkører for å forutsi vellykket IGF1R målrettet terapi, vi evaluert anti-spredning effekten av figitumumab (CP-751 871), et humanisert anti-IGF1R antistoff, mot ni mage og åtte hepatocellulære kreftcellelinjer. Ut fra 17 cancercellelinjer, figitumumab effektivt hemmet veksten av tre cellelinjer (SNU719, HepG2, og SNU368), redusert p-AKT og p-STAT3 nivåer, og induserte G en arrest i en doseavhengig måte. Interessant nok har disse cellene viste ko-overekspresjon og endret mobilitet av IGF1R og insulinreseptor (IR). Immunoprecipitaion (IP) analyser og ELISA bekreftet tilstedeværelsen av IGF1R /IF heterodimere reseptorer i figitumumab-sensitive celler. Behandling med figitumumab førte til dissosiasjon av IGF1-avhengige heterodimere reseptorer og inhiberte tumorvekst med reduserte nivåer av heterodimere reseptorer i en mus xenograft modell. Vi neste fant at både IGF1R og IR var N-bundet glyosylated i figitumumab-sensitive celler. Spesielt massespektrometri viste at IGF1R hadde N-koblede glykaner på N913 i tre figitumumab-sensitive cellelinjer. Vi observerte at et fravær av N-bundet glykosylering på N913 ført til mangel på membran lokalisering av IGF1R og figitumumab ufølsomhet.
Konklusjon og betydning
Dataene tyder på at nivået av N-koblede glykosylert IGF1R /IR heterodimer reseptor er sterkt forbundet med følsomhet for anti-IGF1R antistoff i kreftceller
Citation. Kim JG, Kang MJ, Yoon YK, Kim HP, Park J, Song SH, et al. (2012) heterodimerisering av Glycosylated Insulin-like growth factor-1 reseptorer og insulinreseptorer i kreftceller Sensitive til Anti-IGF1R antistoff. PLoS ONE 7 (3): e33322. doi: 10,1371 /journal.pone.0033322
Redaktør: Frank T. Kolligs, Universitetet i München, Tyskland
mottatt: 29 oktober 2011; Godkjent: 07.02.2012; Publisert: 16 mars 2012
Copyright: © 2012 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble delvis finansiert av den koreanske helsetjenester 21 og teknologi R D prosjekt, departementet for helse, velferd Familiedepartementet, Republikken Korea (A091081), og støttes av tilskudd No. R31-2008-000-10103-0 fra World Class Universitetet program MEST og NRF. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Med de utskilte ligander, IGF1 og IGF2, insulinlignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF1R) blir høyt uttrykt i mange humane kreftceller, inkludert gastrisk (GC) og hepatocellulært karsinom (HCC) [1] – [ ,,,0],5]. Som et resultat av dette har en rekke strategier som hemmer IGF1R signalveien blitt utviklet i løpet av de siste to tiårene [6]. Blant disse, har en anticancer terapeutisk strategi å bruke fullt humanisert antistoff blitt et viktig forskningsfokus [7], fordi den har et stort potensial for å bli vellykket anti-kreftbehandling som kan effektivt hemmer kreftcelle spredning med lav toksisitet og gi kliniske fordeler når det gis i kombinasjon med kjemoterapi [8] – [14]. Et fullt humanisert anti-IGF1R monoklonalt antistoff (figitumumab) har blitt testet i kliniske fase III-studier; imidlertid ikke statistisk signifikant forbedring ble demonstrert ved administrering figitumumab sammen med standard kjemoterapi for pasienter med langt fremskreden ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [15].
Mange studier har vist at en isoform av insulinreseptoren ( IR) blir unormalt overuttrykt i forskjellige krefttyper, og kan fremme tumorvekst [16] – [19]. Dette IR-deler en høy sekvenshomologi med IGF1R, spesielt innen det intracellulære kinasedomenet [7], [20]. IR pro-reseptorer kan danne heterodimere reseptorer (HRS) med IGF1R pro-reseptorer post-translatorisk, før spaltning for å generere to ekstracellulære alfa subenheter og to beta-underenheter som inneholder ekstracellulære, transmembrane og tyrosin kinase domener [21]. Derfor, når cellene co-express IGF1R og IR, kan pro-reseptorer heterodimerize å skape IGF1R /IR timer [22] – [24]. Disse HRS kan også være overuttrykt i forskjellige tumorceller og prøver som et resultat av både IGF1R og IR-overekspresjon [2], [25], [26]. Følgelig er den relative overflod av IR påvirker IGF systemaktivering gjennom timer, som reagerer på både insulin og IGF [27] – [29]. I kreftceller med høye nivåer av IGF1R /IR timer, IGF1 og IGF2 aktivere ulike nedstrøms signalveier gjennom heterodimere reseptorer snarere enn gjennom homodimerisk IGF1Rs [30].
En rekke studier har forsøkt å identifisere prediktive biomarkører med preklinisk og kliniske relevansen [15], [31], [32]. Identifisering av prediktive biomarkører for overvåking av effektiviteten av IGF1R målrettet terapi for egnede pasienter, men er fortsatt nødvendig. I foreliggende studie demonstrerte vi at figitumumab besitter en høy affinitet for IGF1R /IR heterodimere reseptorer, så vel som IGF1 homodimer reseptorer og hemmer IGF /IGF1R signale akse i magekreft og hepatocellulære karsinomceller. I tillegg viser våre data viser at funksjonell membranbundet IGF1R /IF heterodimere reseptorer spiller en viktig rolle i signalisering IGF1 [26], [33], og derfor kan tjene som biomarkører for å forutsi sensitivitet til anti-IGF1R antistoff.
Resultater
anti-proliferativ effekt av figitumumab
som et første skritt, vurdert vi den anti-proliferativ effekt av figitumumab, et monoklonalt antistoff som forhindrer ligander fra binding til IGF1R [12], på 17 cancercellelinjer (figur 1A). Noen celler som anses for å være følsomme for figitumumab, slik som SNU719, HepG2, og SNU368, viste en doseavhengig reduksjon av cellelevedyktighet; IC
30 verdi av figitumumab (vekstinhibering av ~ 30%) for hver cellelinje var 0,063 ug /mL, 0,062 ug /ml, og 0,047 ug /ml, henholdsvis (tabell 1).
A ) Analyse av den anti-proliferative effekt av figitumumab på mage og hepatocellulære karsinomceller. To grupper av kreftceller, inkludert ni gastrisk kreft-cellelinjer og åtte hepatocellulære karsinom-cellelinjer, ble behandlet med økende konsentrasjoner av figitumumab (0, 0,1, 1, og 10 ug /ml) i 120 timer for å hemme veksten av kontrollcellene med 30%. Celleformering ble bestemt ved en MTT-analyse. Seks replikere brønner ble anvendt for hver analyse, og minst tre uavhengige eksperimenter ble utført. Data fra replikate brønner er presentert som gjennomsnittet av de resterende celler. Barer = ± SE. B) Virkning av figitumumab på IGF1R signalveien. Immunoblotting analyse ble utført for å observere den dose-responseffekt av figitumumab (0,1-10 ug /ml) på IGF1R signalering. SNU638, SNU719, SNU354, HepG2, og SNU368 celler ble eksponert for økende konsentrasjoner av figitumumab i 72 timer. Nivåene av proteiner forbundet med den IGF1R veien og deres aktiverte former ble analysert. Forskjellen i forhold til styre vises. I hvert panel, er representative blotter fra tre uavhengige eksperimenter er vist. C) Virkning av figitumumab på cellesyklusfordelingen. Figitumumab følsomme celler (SNU719, HepG2, og SNU368) ble behandlet med økende konsentrasjoner av medikamentet [0 ug /ml (svart fast stoff bar), 0,1 ug /mL (grått, fast stoff bar), 1 ug /ml (hvit bar), og 10 ug /ml (mørkegrå skravert bar)] i 48 timer og deretter farget med propidiumjodid og analysert ved strømningscytometri. Prosentandelen av celler i G
0 /G
1, S og G
2 /M-fasene er vist. Kolonnene representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter; Barer = ± SE. *
P-
verdier 0,05, **
P-
verdier og 0,01. D) Virkning av figitumumab på tumorvekst i mus med HepG2-xenografter. HepG2-celler (1 x 10
7) ble injisert inn i den høyre flanken til nakne mus (n = 5). Behandling med figitumumab (125 mikrogram /ml [6,3 mg /kg kroppsvekt], en gang per uke i 3 wk) ble igangsatt når tumorvolumet hadde nådd 200 mm
3. Ingen signifikant kroppsvekttap ble observert i løpet av studien. Tumorene ble målt av målepunkter med jevne mellomrom. Solid sirkler = behandling med kjøretøy kontroll alene (kontroll), Open trekanter = behandling med figitumumab. Forskjeller mellom de to gruppene (tumorstørrelser på kontrollmusene og de av mus behandlet med figitumumab) ble sammenlignet fra dag 17 til slutten av behandlingsperioden (dag 21) med en tosidig Student «s
t
test . *
P-
verdier 0,05; **
P-
verdier. 0,01 versus kontroll
Figitumumab forstyrrer IGF1R signaliserer hovedsakelig gjennom AKT og Stat3 stier og induserer G
1 arrest
for å undersøke mekanisme som figitumumab hemmer celledeling, vi undersøkt om det var noen forskjeller i nedstrøms signal mellom sensitive og resistente celler i nærvær av serum etter langtidsbehandling med serie doser av figitumumab (figur 1B). I dette eksperimentet, bare figitumumab-sensitive celler utviste markert reduserte nivåer av p-AKT og p-STAT3 på en doseavhengig måte; var det imidlertid ingen endringer i nivåene av p-ERK. Vi observerte også at figitumumab reduserte nivået av totalt cellulært IGF1R i SNU719 celler, hvilket antyder at nedregulering av denne reseptoren kan representere en antistoff-mediert nedbrytning prosessen [8]. Vi har undersøkt om figitumumab indusert nedregulering av ekspresjon IR samt IGF1R nivåer i andre celler ved en rekke forskjellige tidspunkter. Interessant, figitumumab forårsaket den raske nedgangen i total IGF1R nivåer etter tre timers i SNU668 og SNU739 celler (IR-negative celler), men gjorde ikke signifikant nedregulerer enten IR eller IGF1R uttrykk i de andre cellelinjer (figur S1). I kontrast, figitumumab ikke nedregulerer Pakt, Perk, eller pSTAT3 i resistente celler.
For å finne ut IGF1R signal avhengighet i sensitive celler, vi neste utførte eksperimenter med siRNA til taushet IGF1R uttrykk (figur S2A). Resultatene indikerte at IGF1R sekvensspesifikke sirnas indusert dyp IGF1R nedregulering uten å påvirke IR-ekspresjon og viste en klar korrelasjon mellom evne siRNA og figitumumab å hemme fosforylering av spesifikke ned-strøm-signaler, slik som p-AKT og p- STAT3, bare i følsomme celler. Vi undersøkte også effekten av IGF1R knockdown på proliferasjonen av sensitive celler og bekreftet at stanse IGF1R ekspresjon resulterte i en anti-proliferativ effekt på følsomme celler (figur S2B). Kort sagt, disse resultatene viste at anti-proliferative effekter av figitumumab er spesielt mediert gjennom nedregulering av AKT og STAT3 signalveier i stedet for gjennom ERK-signalveien i sensitive celler som har en sterk IGF1R signaleringsavhengighet.
for ytterligere å analysere mekanismene gjennom hvilke figitumumab hemmet spredning og overlevelse av kreft celler, gjennomførte vi en flowcytometrisk analyse (figur 1C). Figitumumab induseres en tilsvarende økning doseavhengig i den prosentvise SNU719, HepG2, og SNU368 cellen i G1 fase. Men det var ingen økt forekomst av apoptose (prosent av sub-G1 celler, data ikke vist). Denne analysen viste at figitumumab redusert celle levedyktighet gjennom cellesyklus hemming uten å indusere apoptose.
Antitumor aktivitet figitumumab i en xenograft tumor modell
neste søkt ytterligere bevis på figitumumab aktivitet
in vivo
ved hjelp av HepG2 å etablere xenotransplantater på grunn av deres følsomhet for figitumumab
in vitro
. For å vurdere effekten av figitumumab på tumorvekst
in vivo
, xenografttumorer ble dyrket i atymiske nakne mus. Som vist, som vist i figur 1D, gjentatt ukentlig administrering av en enkelt dose av figitumumab (6,3 mg /kg kroppsvekt) til dyr som bærer HepG2-tumorer resulterte i betydelig tumorvekstinhibering for 21 d av figitumumab dosering og i betydelig grad hemmet tumorvekst på dag 17 ( P 0,01). I tillegg har vi testet effekten av figitumumab på IGF1R-relaterte molekyler etter en d av figitumumab behandling. Figitumumab effektivt reduserte nivåer av fosforylert IGF1R og IRS1 (figur S3A). Samlet utgjør disse dataene viste at behandling med en enkelt dose av figitumumab effektivt hemmet veksten av svulster ved å hemme IGF1R og IRS1 aktivering.
overexpressed IGF1R og IR skjema IGF1R /IR heterodimere reseptorer i figitumumab-sensitive celler
for å identifisere et mål for å forutsi følsomhet for figitumumab, uttrykk for IGF1R relaterte-proteiner og nedstrøms signalmolekyler ble analysert parallelt ved Western blotting. Interessant, fant vi at figitumumab-sensitive kreftceller alt overexpressed IGF1R; basale ekspresjonsnivåene av IR var også mye høyere sammenlignet med den i andre resistente celler (figur 2A). Basert på en nylig rapport [31], forventet vi at figitumumab spesielt ville hemme veksten av celler som overuttrykker IGF1R eller dens fosforylerte formen, men ikke de som overuttrykker IR fordi figitumumab ikke binder til IR [12]. Men IR protein nivåer var mer lydhør overfor figitumumab enn noe annet protein. Som vist i figur 1A, den anti-proliferative effekt av figitumumab var svakere i celler som overuttrykker bare IGF1R, slik som SNU668 og SNU739, enn i celler som overuttrykker både IGF1R og IR. Dette funnet antydet at forskjellig
in vitro
følsomheten celler til figitumumab er assosiert med både IGF1R og IR-nivåer som igjen kan påvirke nivået av IGF1R /IR heterodimere reseptorer [2].
En ) Immunoblot-analyse av total IGF1Rβ og IRβ proteinnivåer. To typer av mage og hepatocellulære karcinomceller ble høstet 24 timer etter utplating og immunblotting med anti-IGF1Rβ-antistoff, anti-IRβ-antistoff, og anti-tubulin α antistoff ble utført. For begge typer celler, er representative blotter fra tre uavhengige eksperimenter er vist. B) Analyse av nærværet av IGF1R /IR heterodimer reseptor (t) ved hjelp av immunpresipitering. Totale celleproteiner (1 mg) fra celler ble anvendt for immunopresipitering med anti-IGF1R antistoff, separert ved SDS-PAGE ved konstant spenning (80 V), og Vest-blottet med et anti-IRβ antistoff. Blottet ble deretter strippet og reprobed med anti-IGF1Rβ antistoff C) kvantitativ analyse av IGF1R homodimer, IR homodimer, og IGF1R /IR heterodimer nivåer ved hjelp av en ELISA. Lyseringsbuffer (100 ul) inneholdende like mengder protein (50 ug /brønn) fra 11 cancercellelinjer inkludert MCF7-celler (positiv kontroll) ble sådd ut på anti-IGF1R antistoff-belagte brønner og påvist med et anti-IR-deteksjonsantistoff. Anti-IR antistoff-belagte brønner, IR-proteinstandarder, og den anti-IR-deteksjon-antistoff ble benyttet som standarder i heterodimer reseptor ELISA. Absorbans ble målt ved 450 nm. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM ng reseptor-protein pr 50 ug totalt protein. Cellelinjer er oppført i henhold til deres følsomhet for figitumumab. Barer = ± SE. D) Effekt av figitumumab på IGF1- mediert IGF1R /IR timer. Celler ble serum-sultet i 24 timer og deretter behandlet med figitumumab, IGF1, eller ubehandlet. SNU719 celler ble inkubert med figitumumab (10 ug /ml) i 1 time ved 37 ° C etterfulgt av stimulering med IGF1 (100 ng /ml) i 30 min. Immunpresipitasjon ble utført med et anti-IGF1R antistoff og Western utslettet. Input = totalt cellelysat uten IP.
Siden det er allment kjent at IGF1R og IR kan danne heterodimerer når begge er co-overuttrykt på grunn av deres høyt homologe strukturer [2], vi utførte immunoutfellingsstudier eksperimenter for å avgjøre om IGF1R samhandler med IR for å danne heterodimer i figitumumab-sensitive celler. Som vist i figur 2B, celler som overuttrykker både IGF1R og IR, såsom SNU719, HepG2, og SNU368, inneholdt IGF1R /IF heterodimerer. Den SNU601 cellelinje, som viste moderat følsomhet for figitumumab, inneholdt også IGF1R /IR heterodimerer. For å avgjøre om figitumumab fortrinnsvis gjenkjenner IGF1R /IR heterodimere reseptorer i sensitive celler [12], utførte vi immunoutfellingsstudier eksperimenter med figitumumab som antistoffet som brukes for immunoprecipitation. Betydelige nivåer av både IGF1R og IR i figitumumab-sensitive celler ble påvist i figitumumab immunutfelninger, noe som tyder på at dette antistoffet har en overlegen evne til å gjenkjenne både IGF1R homodimer og IGF1R /IR heterodimer hovedsakelig i følsomme celler (figur S4).
Vi har også kvantitativt målt IGF1R, IR, og IGF1R /IR HR nivåer med spesifikke ELISA med antistoffer som spesifikt gjenkjenner IGF1R eller IR, og ikke kryssreagerer med hverandre. Vi sammenlignet 11 kreftcellelinjer, inkludert MCF7- (figur S5) som har blitt evaluert i en tidligere studie [2]. Nivåene av IR varierte 0,08 til 2,3 ng /50 ug totalt, cellulært protein, og IGF1R nivåene varierte 0,50 til 10,6 ng /50 ug totalt, cellulært protein (tabell 2). Disse resultatene indikerer at uttrykket av IGF1R og IR var lik, og de fleste ELISA resultater korrelert tett med Western blotting resultater (Figur 2A). Cellenivå av IGF1R /IR HRS varierte 0,39 til 0,99 ng /50 mikrogram totale cellulære proteiner. Nivået av HRS var høyere i følsomme celler enn resistente celler (Figur 2C), noe som tyder på at uttrykket nivået av IGF1R /IR heterodimer reseptor signifikant korrelert med narkotika følsomhet.
Dannelse av IGF1 ligand-avhengig IGF1R /IR heterodimer hemmes av anti-IGF1R antistoff
for ytterligere å definere mekanisme av anti-proliferativ figitumumab aktivitet knyttet til IGF1R /IR heterodimer uttrykk, vi også undersøkt endringer i ligand-avhengig heterodimer reseptor uttrykk (figur 2D ). Vi fant at heterodimerene bundet til IGF1 ligander, men dette IGF1 ligand-avhengig Dannelse ble undertrykt ved figitumumab i følsomme celler. I SNU368, viste det seg at figitumumab trykkes ikke bare IGF1 ligander som binder til HRS, men også et uttrykk for IGF1R /IR timer i fravær av IGF1 ligand. Heterodimer reseptor nivåer i SNU638 og SNU354 celler, var imidlertid relativt stabile i nærvær av figitumumab. I tillegg var det ingen påvisbar insulinavhengig heterodimerdannelse eller dissosiasjon på grunn av figitumumab. Fosforylering som respons på 100 nM insulin ble også reduseres ikke ved figitumumab (figur S6). Til sammen resultatene fra dette forsøket viste at IGF1R /IR heterodimerer responderte godt på IGF1, og blokkering av IGF1 av figitumumab indusert nedregulering av IGF1 ligand-avhengig IGF1R /IR heterodimerdannelse i narkotika-sensitive cellelinjer.
Selektiv overekspresjon av IR induserer heterodimer reseptor formasjon og forbedrer anti-proliferativ effekt av figitumumab
for å vurdere om effekten av figitumumab var begrenset til SNU719, HepG2 eller SNU368 celler, vi utførte studier i celler med lave nivåer av IR, inkludert SNU739 og SNU886 celler transfektert med pcDNA3.1-IR som indusert høyt uttrykk for IR. Som vist i figur 3A, økt IR uttrykk nivåer i de transfekterte cellene bemerkelsesverdig sammenlignet med celler transfektert med pcDNA3.1 (-) tom vektor. Videre IGF1R /IF HRS ble også dannet i IR-transfekterte celler. For å undersøke om IGF1R /IR HR dannelse på grunn av økt IR-protein nivåer kan forbedre stoffet følsomhet, utførte vi MTT analyser. Resultatet viste at IR-transfekterte celler var mer følsomme for den økte anti-proliferativ effekt av figitumumab (figur 3B). Resultatene indikerte at forhøyede nivåer av IR og IGF1R aktivert kreftceller for å danne IGF1R /IR timer og økt sin anti-proliferativ respons på figitumumab.
A) Effekt av IR transfeksjon på IGF1R /IR HR nivåer i IR- negative cellelinjer. Celler ble transfektert med pcDNA3.1 (-) ekspresjonsvektor inneholdende vill-type IR-cDNA. En like stor mengde av lysater fra celler transfektert med enten tom vektor eller pcDNA3.1 (-) inneholdende IR-cDNA ble underkastet immunoutfelling med anti-IGF1R-antistoff, etterfulgt av Western blot analyser av IRβ og IGF1Rβ. B) Virkning av IR-transfeksjon på figitumumab følsomhet. Transfekterte celler ble sådd ut på 96-brønners plater, ble behandlet med figitumumab for 5 d, og utsatt for MTT-analyser. Solid trekant symbol med stiplede linjer = tom vektor (pcDNA3.1-), Solid sirkel symboler med linjer = pcDNA3.1 (-) IR. Bar = ± SE. Gjennomsnittsverdier var avledet fra seks replikater. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
N-bundet glykosylering av IGF1R og IR i sensitive celler
Bortsett fra foreningen mellom timer og narkotika følsomhet, fant vi også at N-bundet glykosylering (NLG) er en ekstra viktig faktor som påvirker responsen på figitumumab. Blotting for anti-IGF1Rβ subenhet avdekket to isoformer rundt 95 og 105 kDa i de fleste celler; imidlertid sensitive celler viste en svak 105 kDa band og et sterkere bånd på 115 kDa (figur 4A). Kort sagt, IGF1Rβ i figitumumab-sensitive celler migrert saktere på SDS-PAGE enn i resistente celler. Interessant, blotting for den anti-IRβ subenhet produsert samme bånd mønster som for IGF1Rβ. For å fastslå hvorvidt forskjellene i molekylmasse mellom sensitive og resistente celler var på grunn av forskjeller i N-glykosylering, vi enzymatisk deglykosylert IGF1R og IR med PNGage F, som fjernet alle typer av N-bundne glykaner. Behandling med PNGage F økte elektro mobilitet av både IGF1Rβ og IRβ i alle figitumumab-sensitive celler (figur 4B), noe som indikerer at IGF1Rβ og IRβ i sensitive celler var for det meste N-bundet glykosylert.
A) immunoblotanalyse av forskjellig IGF1Rβ vandringsmønster på SDS-PAGE. Elektroforetiske mobilitet mønstre av IGF1Rβ ble analysert i parallell ved Western bloting. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger med lignende resultater. B) Analyse av N-glykosylert IRβ og IGF1Rβ i sensitive cellelinjer ved enzymatiske deglykosylering med PNGage F. Alle prøver ble inkubert ved 37 ° C i 12 timer med PNGage F. IGF1Rβ og IRβ proteiner ble analysert i parallell med Western blotting. Blottene som vises er representanter for tre uavhengige eksperimenter.
En spesifikk NLG stedet IGF1R i figitumumab-sensitive celler
Vi neste fastslått om variasjonen i NLG av IGF1Rβ subenheten kan være en annen kandidat biomarkør for figitumumab følsomhet. Å identifisere en bestemt NLG område innenfor IGF1Rβ subenheten, ble det benyttet en kombinasjon av enzymatisk de-glykosylering og massespektroskopi (MS) -analyse. Etter evaluering av prøver fra både sensitive og resistente celler, identifiserte vi stedsspesifikk glykosylering på Asn900 og Asn913 blant fem antatte NLG nettsteder (Asn747, 756, 764, 900 og 913) av IGF1Rβ subenheten. Andre NLG steder (Asn747, 756 og 764) var vanskelige å identifisere på grunn av tilstedeværelsen av flere NLG områder og mangel på proteolytiske spaltningsseter innen peptidsekvensen regionen (figur 5A). Derfor har vi fokusert på Asn900 og Asn913 rester å vurdere stedsspesifikke NLG forskjeller mellom figitumumab-sensitive og resistente celler. En komplett peptid fragmenteringsmønstre det tryptiske peptid (
897NPGNYTAR
904) som inneholdes tidligere N-glykosylerte peptid ved Asn900 (en tilsetning av ett Da, N + 1) ble observert fra både følsomme og motstandslegemer, som omfattet Asn rest av glykosyleringssete i Asn900 (figur S7). Resultatene viste at Asn900 ble glykosylert i både narkotika-sensitive og resistente celler. Imidlertid ble peptider med NLG på Asn913 kun identifisert i de følsomme, men ikke resistente celler, noe som tyder på at dette spesifikke NLG området ikke ble glykosylert i resistente celler.
A) Identifikasjon av NLG nettstedet belegg på IGF1Rβ subenheter . IGF1Rβ subenheter som inneholder N-bundne glykosyleringsseter (Asn747, Asn756, Asn764, Asn900, og Asn913) ble isolert fra både legemiddelfølsomme (SNU719, HepG2 og SNU368) og motstand (SNU638 og SNU354) celler og identifisert ved tandem MS ved en økning av 1,0 da fra den tilsvarende massen av Asn som et resultat av omdannelsen fra N-bundet glykosylert Asn for Asp. All NLG på Asn900 både sensitive og motstand celler ble bestemt å være opptatt med N-glykosylering (fylt rektangel). NLG ved Asn913 av de sensitive cellelinjer (HepG2, SNU719, og SNU368) ble bestemt for å være opptatt med N-glykosylering (fylt firkant), mens N-glycosites ved Asn913 av resistens cellelinjer (SNU638 og SNU354) ble funnet å være ledig med N-glykosylering. (Åpent rektangel). B) Effekt av N913Q nettstedet mutasjon på elektromobilitetsmønstre IGF1Rβ. Huh7-celler (en IGF1R-negativ cellelinje) ble transfektert med den tomme pcDNA3.1 (-) ekspresjonsvektor (kontroll), pcDNA3.1 (-) inneholdende vill-type IGF1R cDNA (IGF1R WT), eller pcDNA3.1 (- ) med IGF1R mutasjon typen cDNA (IGF1R N913Q). En like stor mengde av cellelysatet fra de transfekterte cellene ble deretter utsatt for Western blot-analyse for IGF1Rβ. C) Virkning av N913Q området mutasjon på dannelsen av IGF1R /IF heterodimere reseptorer. En like stor mengde av cellelysatet fra transfekterte celler, ble så underkastet immunutfelling (IP) med anti-IGF1R-antistoff, etterfulgt av Western blot-analyse for IRβ og IGF1Rβ. Input = totalt cellelysat uten IP. D) Effekt av N913Q nettstedet mutasjon på IGF1R lokalisering. En immunofluoresence analyse ble utført for å observere den lokalisering av IGF1R. IGF1R reaktivitet ble visualisert ved konfokal laser scanning mikroskopi (Skala: 30 mikrometer). Representative bilder vises. Grønn: IGF1R, Blå: kjerner. E) Effekt av N913Q nettstedet mutasjon på figitumumab følsomhet. Huh7-celler transfektert med tom pcDNA3.1 (-) vektoren, vektor inneholdende vill-type IGF1R cDNA, eller en vektor inneholdende IGF1R (N913Q) mutasjon Type cDNA ble sådd ut i 96-brønners plater og behandlet med økende konsentrasjoner av figitumumab i 120 timer (til venstre ). Celleviabilitet prosenter med 1 mikrogram /ml figitumumab (til høyre). Seks replikere brønner ble inkludert i hver analyse, og minst tre uavhengige eksperimenter ble utført. Data fra replikate brønner er presentert som gjennomsnittet av gjenværende celler. *
P-
verdier 0,05; **
P-
verdier. 0,01
For å ytterligere bekrefte NLG konsensus nettstedet (N913) og dets funksjonelle betydning, en seterettet IGF1R mutant ble konstruert. Asn913 ble erstattet med et glutaminresidie for å gi en N913Q (Asn913 ln) mutant. For å vurdere de funksjonelle konsekvensene av denne mutasjonen, ble villtype IGF1R og mutant konstruere forbigående uttrykt i Huh7 celler. Som vist i figur 5B, ble uttrykket nivåer av villtype og mutant IGF1R i de transfekterte cellene øket bemerkelsesverdig sammenlignet med celler transfektert med den tomme pcDNA3.1 (-) vektoren. Imidlertid N913Q mutasjon fremstått som et 105 kDa bånd som migrerte raskere enn villtype-proteinet som produserte et lignende mønster migrering av proteinet på SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) i SNU719 celler. Disse observasjonene bekreftet at ~115 kDa band i sensitive celler samsvarer IGF1R som var NLG på N913.
Interessant, synes det at fjerning av N-koblede sukker fra N913 til IGF1R hadde tilsynelatende ingen effekt på formasjonene av IGF1R /IR timer. Snarere denne mutasjonen bare berørt på NLG tilstand av reseptoren fordi HR-nivåene ble bemerkelsesverdig økt i de mutante IGF1R-transfekterte celler og mutante reseptoren viste en økt migrasjon rente på SDS-PAGE (figur 5C). Dette resultatet antydet at fjernelse av den N-bundne sukker fra N913 området endret SDS-PAGE banding profilen til IGF1Rβ, men hadde ingen effekt på heterodimerisering av IGF1R og IR.
NLG regulerer IGF1R lokalisering til plasmamembranen og bestemmer følsomhet for figitimumab
Vi neste utførte en immunfluorescens analyse for å fastslå om mutasjon av N913 konsensus nettstedet hindret celleoverflaten uttrykk for IGF1R. -Celler som uttrykker villtype-IGF1R hadde en overflod av plasmamembranbundet IGF1R, mens den muterte formen var i hovedsak beholdes inne i cellene sammen med forholdsvis lite eller ikke noe plasmamembranen lokalisering (figur 5D). For å undersøke funksjonaliteten til NLG-manglende-IGF1Rs sammenlignet med villtype-form, utførte vi MTT-analyser. Resultatene viste at anti-proliferativ effekt av figitumumab ble økt ved å overuttrykke villtype IGF1R, mens celler transfektert med den mutante IGF1R ikke vise noen endring i medikamentsensitivitet (figur 5E). Disse resultatene antydet at en mangel av N-koblede sukkerarter ved N913 i IGF1R forårsaket hovedsakelig cytoplasmisk lokalisering av reseptoren, mens villtype-IGF1R ut til å lokalisere til plasmamembranen med øket følsomhet for figitumumab. Derfor NLG på N913 ser ut til å være avgjørende for funksjonell membranbundet IGF1R og resulterer i en økt respons på anti-IGF1R antistoff i kreftceller.
Diskusjoner
Figitumumab (CP-751 871) har vært aktivt testet hos pasienter med myelomatose, men identifisering av biomarkører og mekanismer er nødvendig for å forutsi behandlingstiltak og dermed bidra med pasientens valg for å maksimere kliniske fordeler. Data fra denne studien viser at nivået av IGF1R /IF HRS kan være en mulig diagnostisk biomarkør for å forutsi sensitivitet til anti-IGF1R antistoff, særlig i GC og HCC celler. Tidligere studier har rapportert at nivået av IGF1R i seg selv kan ha prediktiv verdi i bryst, lunge, og kolorektal kreft [31], [34]. I vår studie, men heller uttrykk for IGF1R alene eller nivåer av andre IGF1R tilhørende molekyler, inkludert IRS1, kan brukes til å tilstrekkelig forutsi figitumumab følsomhet (data ikke vist). I stedet, har vi funnet at en viktig faktor for den respons på figitumumab syntes å være høye ekspresjonsnivåer av IR, fordi bare medikamentsensitive celler viste høye nivåer av IR samt IGF1R (figur 2A). Tatt i betraktning at flere tidligere studier viste at overekspresjon av både IGF1R og IR kan føre til økt dannelse av IGF1R /IR timer og utvide utvalget av IGF1 bindingsseter i ulike menneskelige maligniteter [2], [3], [27], [35 Nei.
