Abstract
Matrix metalloproteinaser (MMP) stimulere tumorinvasjon og metastasering av nedverdigende ekstracellulære matrise. Her avslører vi en uventet rolle for Mmp10 (stromelysin 2) i vedlikehold og tumorgenisiteten av mus lungekreft stilk-lignende celler (CSC). Mmp10 er sterkt uttrykt i oncosphere kulturer beriket i cscs og RNAi-mediert knockdown av
Mmp10
fører til et tap av stamcelle markør genekspresjon og hemming av oncosphere vekst, klonal ekspansjon, og forvandlet vekst
in vitro
. Interessant, klonal ekspansjon av
Mmp10
mangel oncospheres kan gjenopprettes ved tilsetting av eksogent Mmp10 protein i dyrkningsmediet, noe som demonstrerer en direkte rolle for Mmp10 i proliferasjon av disse cellene. Oncospheres viser forbedret tumor initiere og metastatisk aktivitet når injiseres orthotopically inn syngene mus, mens Mmp10-mangel kulturer viser en alvorlig mangel i startfasen. Omvendt, oncospheres implantert inn i syngeniske ikke-transgen eller
Mmp10
– /- mus viser ingen signifikant forskjell i startfasen, vekst eller metastase, noe som viser viktigheten av å
Mmp10
produsert ved cancer celler i stedet for svulsten mikromiljøet i lunge svulst initiering og vedlikehold. Analyse av genuttrykk data fra humane kreftformer avslører en sterk positiv korrelasjon mellom tumor Mmp10 uttrykk og metastatisk oppførsel i mange humane tumortyper. Dermed
Mmp10
er nødvendig for vedlikehold av en svært tumorigent, kreft-initiering, metastatisk stilk-lignende cellepopulasjonen i lungekreft. Våre data viser for første gang at
Mmp10
er en kritisk lungekreft stamcelle genet og romanen terapeutisk mål for lungekreft stamceller
Citation. Justilien V, Regala RP, Tseng IC, Walsh MP, Batra J, Radisky ES, et al. (2012) matriksmetalloproteinase-10 er nødvendig for Lung Cancer Stem Cell Vedlikehold, startfasen og metastatisk potensial. PLoS ONE 7 (4): e35040. doi: 10,1371 /journal.pone.0035040
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 31 januar 2012; Godkjent: 08.03.2012; Publisert: 24 april 2012
Copyright: © 2012 Justilien et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health /National Cancer Institute (R01 CA081436-13 og R21 CA151250-01), V Foundation for kreftforskning, og James og Esther kong Biomedical Research Program (1KG-05-33971) til APF ; en Ruth A. Kirschstein National Cancer Institute postdoktorstipend (CA115160) til RPR; og en National Institutes of Health Research Supplement å fremme mangfold i helsefaglig forskning Award fra National Cancer Institute (VJ). APF er Monica Flynn Jacoby Professor of Cancer Research, et gavefond som gir delvis støtte til etterforsker forskningsprogram. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den ledende årsak til kreft dødsfall i USA [1]. Utfallet for NSCLC pasienter forblir fattige, og understreker behovet for å identifisere mer effektive middel for forebygging, diagnostisering og behandling. Svulster inneholde subpopulasjoner av celler som utviser stilk-lignende egenskaper som driver patogenesen [2], [3], [4]. Disse kreft initiere eller kreft stamceller (cscs) oppviser selvfornyelse, tumor-initiere aktivitet, klonal ekspansjon som «oncospheres», muligheten til å støtte tumor vedlikehold og metastase, og for å skille ut de forbigående forsterkende celler som omfatter hoveddelen tumor [2], [4], [5], [6]. Cscs dele molekylære egenskaper med embryonale stamceller, inkludert ekspresjon av aldehyddehydrogenase (Aldh) [7], og stamcellemarkører slik som CD133 [8], [9], Nanog [10], Oct4 [10], Sox2 [11] og Notch reseptorer [12]. Cscs har blitt beskrevet i mange former for kreft hos mennesker, inkludert lungekreft [9], [13]. Den sentrale rollen av cscs i tumorgenese indikerer at disse cellene skal være målrettet terapeutisk for å oppnå effektiv behandling av kreft.
MMP har vært implisert i lunge tumor proliferasjon, invasjon og metastase [14]. Den stromelysin underfamilie [stromelysin 1 (Mmp3), 2 (Mmp10) og 3 (Mmp11)] er ofte overuttrykt i NSCLC [15]. Interessant er Mmp10 sterkt uttrykt i NSCLC-tumorer, men ikke tumorassosierte stromale celler, mens Mmp3 og Mmp11 er uttrykt overveiende i stroma [17]. Vi har nylig vist at Mmp10 er nødvendig for forvandlet vekst og invasjon av menneskelig NSCLC celler
in vitro product: [19], er indusert i bronchio-alveolar stamceller (BASCs) forvandlet av onkogene
Kras product: [ ,,,0],20], og fremmer
Kras
-mediert lunge tumorigenesis in vivo [21].
Mmp10
-deficient mus viser en blokk i
Kras
-og uretan-indusert tumordannelse, en effekt som korrelerer med en manglende evne til Mmp10-mangel BASCs å utvide og gjennomgå transformasjon som svar på uretan eller
Kras product: [21]. Dermed Mmp10 formidler startfasen gjennom kontroll av tumor-initiering celle (BASC) ekspansjon.
Her vurderer vi rollen Mmp10 i vedlikehold og tumorigent potensialet fullt forvandlet mus lunge cscs. Kulturer beriket i cscs fra mus lunge adenokarsinom celler uttrykker forhøyet Mmp10, Nanog, Aldh1, CD133, Notch3, Notch4, Hey1 og hey2. Disse kulturene utviser økt forankringsuavhengig vekst in vitro, og forbedret startfasen, vekst og metastatisk spredning som ortotopiske svulster i syngene mus. Disse stilk-lignende egenskaper krever ekspresjon av Mmp10 i tumorceller, men ikke i tumor-assosiert stroma. Våre resultater tyder på at Mmp10 er en attraktiv kandidat for utvikling av mekanismebasert terapi rettet mot svært tumorigene lunge cscs.
Resultater
Mus lunge oncospheres uttrykkelig forhøyet Mmp10 og Mmp10-avhengige stilk-lignende egenskaper
Mmp10
er sterkt indusert i tumor initiere lunge bronchio-alveolar stamceller (BASCs) ved aktivering av onkogene
Kras product: [20]. Videre
Mmp10
-deficient mus utstillings redusert
Kras
formidlet lungetumordannelse og et tap av
Kras
-mediert BASC ekspansjon in vitro og in vivo [21]. Å direkte utforske betydningen av Mmp10 i lunge CSC biologi, analyserte vi muse CMT167 celler, en svært tumorigen, metastatisk cellelinje avledet fra en spontan alveolar lunge adenokarsinom i en C57BL /6 mus [22], [23]. DNA-sekvensering viste at CMT167 celler havn en aktive
Kras
G12V
mutasjon (figur 1A), noe som gjør det til et ideelt cellulær modell for å studere Mmp10 i mutante
Kras
lunge cscs. I motsetning til CMT167 celler dyrket i tilhenger kultur (figur 1B, til venstre), celler dyrket i definerte stamcellemedium i lav etterlevelse plater vokse som oncospheres (Figur 1B, midtre) minner om CSC kulturer fra human lunge kreft cellelinjer [13] . Disse oncospheres redifferentiate da tilbake til tilhenger kultur, viser morfologi sammenlignes med foreldre celler (figur 1B, til høyre). CMT167 oncosphere kulturer viser en ~8 ganger økning i forankringsuavhengig kolonidannelse i forhold til foreldre celler (figur 1C), i samsvar med de forbedrede tumorigene egenskaper cscs [13]. Forbedret kolonidannelse er i stor grad tapt når disse cellene er lov til å redifferentiate sender dem tilbake til tilhenger kultur (figur 1C). Lignende resultater ble oppnådd ved anvendelse av en andre mus lunge adenokarsinom-cellelinje, Lewis Lung Carcinoma (LLC) (fig S1A og B). LLC celler dyrket som oncospheres i stamcelle kultur utstillings forbedret forankringsuavhengig koloni formasjon, men mister disse egenskapene da tilbake til tilhenger kultur. Disse resultatene viser at våre oncosphere kulturer er beriket i kreft stilk-lignende celler.
A) CMT167 celler havn en aktive
Kras
G12V
mutasjon. DNA sekvens kromatogram av
Kras
allel i CMT167 celler avslører et kodon 12 mutasjon fra glysin til valin (
Kras
G12V
) (rød pil). B) Fase kontrast photomicrographs av foreldreheft CMT167 celler (
venstre panel
), CMT167 oncospheres i stamcelle kultur (
midtre panelet
) og redifferentiated oncosphere celler etter retur til tilhenger kultur (
høyre panel
). C) CMT167 oncosphere kulturer utviser forbedret forankringsuavhengig vekst. Gjennomsnittlig fold-endring fra CMT167 foreldre celler +/- SEM. n = 5, * p 0,00001; ** P. 0,00001
For ytterligere å karakterisere våre oncosphere kulturer, vurdert vi dem for uttrykk for godt karakterisert stamcelleassosierte gener. QPCR avslørte at CMT167 oncosphere kulturene uttrykker forhøyet mRNA for mange gener som er knyttet til stamcelle-fenotypen [24] inkludert Nanog, Aldh1, CD133, Notch3, Notch4, Hey1 og hey2 (figur 2A). Påfallende, disse kulturene uttrykker også forhøyet Mmp10 mRNA (Figur 2A), men ingen økning i MMP2, Mmp7, Mmp9, Mmp11, MMP12 eller Mmp14, andre MMP arter vanligvis knyttet til lungekreft (figur 2A). Som forventet, oncosphere kulturer vise et tap av stamcellemarkører og Mmp10 uttrykk når lov til å redifferentiate i tilhenger kultur (figur 2B). Et lignende mønster av stamcelle markør uttrykk ble observert i oncosphere kulturer fra LLC celler, blant annet en dramatisk økning i MMP10, noe som indikerer at disse endringene er ikke unikt for CMT167 oncospheres (Figur S1C). CMT167 oncosphere kulturer utsondre forhøyet Mmp10 protein inn i mediet i forhold til foreldrenes eller redifferentiated kulturer (Figur 2C), som viser den funksjonelle betydningen av forhøyet Mmp10 uttrykk i disse kulturene. CD133 og Notch4 er to svært selektive overflatemarkører uttrykt på andre lunge cscs [9],. Derfor vurderte vi uttrykket av disse markørene i CMT167 foreldre, oncosphere og redifferentiated oncosphere kulturer ved flowcytometri (figur 2D). Foreldrecellekulturer inneholde ~8% CD133
+ /Notch4
+ celler. I kontrast, oncosphere kulturer inneholde ~38% CD133
+ /Notch4
+ celler og redifferentiated kulturer ~6% CD133
+ /Notch4
+ celler. Disse resultatene er i samsvar med utbredelsen av cscs i andre lungekreft cellelinjer [9], og indikerer at disse er selektive markører til CSC-beriket kulturer.
A) Uttrykk for kreft stamcellemarkører i CMT167 foreldrenes og oncosphere kulturer. QPCR av kreft stamcelle-assosierte gener; * P 0,05. B) QPCR for stamcellemarkører i foreldre, oncosphere og redifferentiated oncosphere kulturer. Brett av foreldre celler +/- SEM, n = 3; * P 0,05. C) CMT167 oncosphere kulturer utsondre forhøyet Mmp10 protein. ELISA av kultursupernatanter fra foreldre, oncosphere og redifferentiated CMT167 oncosphere kulturer. Mean +/- SEM. n = 3, * p 1 x 10
-8 foreldre vs. oncospheres; ** P 2 × 10
-8 oncospheres vs. redifferentiated oncospheres. D) Flowcytometri av CMT167 foreldre, oncosphere og redifferentiated oncosphere kulturer for CD133 og Notch4.
Siden oncospheres uttrykkelig forhøyet Mmp10, vi neste vurdert om Mmp10 er viktig for vedlikehold og vekst. Tre RNAi lentiviruses rettet mot mus Mmp10 RNA ble identifisert som hemmer Mmp10 uttrykk (Figur S2A og B). Hver Mmp10 knockdown virus forårsaket en tilsvar hemming av forankringsuavhengig vekst sammenlignet med ikke-target (NT) RNAi kontrollceller (Figur S2C). Den mest effektive Mmp10 RNAi-konstruksjon (# 3) ble anvendt for å fremkalle effektiv knockdown av Mmp10 mRNA i begge foreldre og oncosphere kulturer (figur 3A). Mmp10 knockdown forårsaket en hemming av transformert vekst (figur 3B), og et tap i ekspresjon av Nanog, Aldh1, Cd133, Notch3 og 4, Hey1 og 2, og Mmp10 (figur 3C). ble oppnådd i Advisor lignende resultater oncosphere kulturene hvor MMP10 ble slått ned av RNAi (figur S3A-C). Mmp10 RNAi oncosphere kulturer også viste en nedgang i CD133
+ /Notch4
+ celler i forhold til NT RNAi oncosphere kulturer (Figur 3D). Interessant, Mmp10 knockdown også forårsaket en reduksjon i CD133
+ /Notch4
+ celler i foreldre kulturer (fra ~11% til ~ 5%) (figur 3D), noe som indikerer at Mmp10 er viktig for opprettholdelsen av et CSC befolkningen innenfor foreldre kulturer.
A) QPCR viser RNAi-mediert knockdown av Mmp10 i foreldre CMT167 og oncosphere kulturer. I forhold til NT foreldre celler; Mean ± s.d, n = 3. * p. 0,0002 og ** p = 0,01 vs. NT foreldrekontroll. B) Effekt av Mmp10 RNAi på forankringsuavhengig vekst av foreldrenes og CMT167 oncosphere kulturer. I forhold til NT parentale celler +/- SEM, n = 5; * P 0,05 vs, NT; ** P 0,05 vs. NT foreldre. C) QPCR for stamcellemarkører i NT foreldre, og NT og Mmp10 RNAi CMT167 oncosphere celler. Brett av NT foreldre +/- SEM, n = 3; * P 0,05. D) Flowcytometri av NT og Mmp10 RNAi foreldre og oncosphere celler for CD133 og Notch4.
Vi neste fastslått om Mmp10 er viktig for klonal ekspansjon av oncospheres, en godt definert karakteristisk for cscs. Enkelt Mmp10 RNAi- og NT RNAi oncosphere celler ble sådd ut i individuelle brønner i lav-adherente vevskulturplater og tillates å ekspandere klonalt. Praktisk talt alle NT RNAi cellene ekspandere inn i store oncospheres i løpet av en 15 dagers periode (figur 4A, øvre del), mens de fleste av Mmp10 RNAi celler forblir som enkeltceller (figur 4A, lavere). Lignende resultater ble oppnådd i LLC oncosphere kulturer (figur s3D). Den reduserte klonal ekspansjon av CMT167 oncospheres skyldes genetisk tap av Mmp10 siden tilsetningen av rekombinant Mmp10 til kulturmediet gjengitte klonal ekspansjon av Mmp10 RNAi-celler (figur 4A, lavere). Kvantitering bekreftet at NT RNAi oncospheres vokse betydelig større enn Mmp10 RNAi oncospheres, og tillegg av rekombinant Mmp10 gjenoppretter veksten av Mmp10 RNAi celler til som kan sammenlignes med NT RNAi celler mens du har ingen signifikant effekt på NT RNAi celler (figur 4B). Eksogene Mmp10 førte også til å re-uttrykk for CD133 og Notch4 på Mmp10 RNAi celler (figur 4C), og re-uttrykk for stamcellemarkører (Nanog, Aldh1, Cd133, Notch3, Notch4 og hey2) (Figur S4A). Den reduserte klonal vekst av Mmp10 RNAi oncospheres er ikke på grunn av tap av celle levedyktighet, siden disse cellene sprer med en hastighet umulig å skille fra NT RNAi oncospheres når den plasseres tilbake i tilhenger kultur (figur S4B).
A) Mikrofotografier av klonal ekspansjon av enkelt NT og Mmp10 RNAi CMT167 oncosphere celler i nærvær eller fravær eller rekombinant Mmp10. B) Colony diameter avledet fra enkelt CMT167 NT og Mmp10 RNAi celler. Mean +/- SEM; n = 10, * p 0,05 vs. dag en hver behandling; ** P 0,05 vs. dag 15 NT RNAi uten Mmp10. C) Flowcytometri av NT og Mmp10 RNAi CMT167 oncosphere kulturer +/- Mmp10 for CD133 og Notch4.
Oncosphere kulturer utstillings Mmp10 avhengig svulst-initiere aktivitet
in vivo
Vi har evaluert neste svulsten-initiere aktivitet oncosphere og foreldre kulturer ved orthotopic injeksjon i venstre flik av lunge av syngene mus. Innledende forsøk bestemt at injeksjon av 100.000 foreldre CMT167 /luc celler ble pålagt å etablere ortotopiske svulster mens injeksjon av så få som 1000 NT RNAi CMT167 /luc celler fra oncosphere kulturer rutinemessig ga svulster. Injeksjon av 1000 NT RNAi CMT167 /luc oncosphere celler førte til store svulster, mens injeksjon av 1.000 foreldre NT RNAi CMT167 /luc celler eller Mmp10 RNAi CMT167 /luc oncosphere cellene ikke klarte å produsere store svulster som bestemmes av levende avbildning av bioluminesens (figur 5A). Patologisk undersøkelse av lunge vev på tidspunktet for offer viste at svulsten ta var 100% for NT RNAi CMT167 /luc oncosphere celler (9/9) med en gjennomsnittlig tumorstørrelse på 3,63 +/-. 35 mm
2, bare, men 45% svulst ta for foreldre NT RNAi CMT167 /luc celler (5/11) med en gjennomsnittlig tumorstørrelse på 0,42 +/-. 06 mm
2, og 27% svulst ta for Mmp10 RNAi CMT167 /luc oncosphere celler (3 /11) med en gjennomsnittlig tumorstørrelse på 0,36 +/-. 09 mm
2. Disse data validere våre in vivo Bioluminescens målinger og vise at Mmp10 spiller en avgjørende rolle i tumor initiere aktivitet og vekst av CMT167 /luc oncosphere celler. Interessant, Mmp10 knockdown i parentale celler også fører til et tap av tumordannelse in vivo (figur S5a), noe som indikerer at Mmp10 er viktig for den tumor-initiering av aktiviteten til en CSC-lignende cellepopulasjon er tilstede i foreldrecellekulturer. NT RNAi CMT167 /luc oncosphere kulturer også generert mange metastaser til de riktige fliker av lungen, mens foreldre NT RNAi CMT167 /luc cellekulturer viste langt færre metastaser og Mmp10 RNAi CMT167 /luc oncosphere kulturer enda færre (figur S5b), noe som tyder på en rolle for Mmp10 i metastatisk potensial, en eiendom tilskrevet lunge cscs. Dermed er Mmp10 viktig for den forbedrede karsinogent potensial observert i oncosphere kulturer.
A, ortotopiske tumorvekst etter injeksjon av 1000 celler fra NT tilhenger, ble NT RNAi oncosphere eller Mmp10 RNAi oncosphere kulturer overvåkes av bioluminesens på angitt tidspunkter; * P 0,05 (
venstre panel
). Representative sideutsikt over bioluminescent bilder av mus med lunge ortotopiske tumorer (
høyre panel
). Mmp10 funksjon i CMT167 oncosphere svulster er celle autonom. B) Representative bioluminescent bilder av NT RNAi CMT167 oncosphere ortotopiske svulster implantert i NTG og
Mmp10
– /- mottaker mus. Analyse av C) tumorstørrelse og D) metastaser i NTG eller
Mmp10
– /- mus. C-D, n = 10, betyr +/- SEM.
tumorigenitet er uavhengig av Mmp10 i svulsten mikromiljøet
Effektene av Mmp10 i CMT167 celler
in vitro
er celle autonome. Men vi kan ikke utelukke en rolle for Mmp10 produsert av tumor-assosiert epitel, stromal og /eller immunceller i våre ortotopiske kreftstudier. For å løse dette problemet, injisert vi 1.000 celler fra NT RNAi CMT167 /luc oncosphere kulturer i enten NTG eller
Mmp10
– /- mus. Ingen signifikante forskjeller i tumorvekst (figur 5B), primær tumorstørrelse (figur 5C), eller metastaser (figur 5D) ble sett i NTG og
Mmp10
– /- mottaker-mus, noe som indikerer at Mmp10 uttrykt av oncospheres, men ikke fra Mmp10 produsert av andre tumor-assosierte celler, er kritisk for tumordannelse. Vi har tidligere demonstrert at Mmp10 er uttrykt i forsvinnende små mengder i lungen epitel, men er sterkt indusert i BASCs ved aktivering av onkogeniske
Kras product: [20]. Dermed kreftceller er den viktigste kilden til Mmp10 i lungene av tumorbærende mus.
Oncosphere kulturer differensiere i bulk kreftceller etter orthotopic injeksjon
cscs initiere og opprettholde svulster ved å opprettholde en CSC befolkning og differensiere til forbigående forsterkende celler som utgjør hoveddelen tumor. For å vurdere skjebnen til CMT167 oncospheres etter ortotropiske tumordannelse, isolerte vi tumorceller fra ortotopiske tumorer avledet fra disse kulturene og analyserte dem for CD133
+ /Notch4
+ celler (figur 6). På tidspunktet for injeksjon, de oncosphere kulturene viste signifikant anrikning i CD133
+ /Notch4
+ celler (~36%) (figur 6A). I motsetning til kreftceller isolert fra ortotopiske svulster besto av ~11% CD133
+ /Notch4
+ celler, i samsvar med foreldre CMT167 celler (Figur 6b). Disse data indikerer at oncosphere kulturer forplante en populasjon av CD133
+ /Notch4
+ stilk-lignende celler, og også differensieres til transient-amplifisering av tumorceller in vivo. Vi utforsket også fordelingen av CMT167 oncosphere celler i ortotopiske svulster ved immunhistokjemi for Mmp10 og Notch4 (figur 6C). Primære svulster avledet fra oncospheres utstilt litt forhøyet Mmp10 farging med mørkere Mmp10 flekker i områder hvor svulsten samhandler med omkringliggende stroma. Tumor-assosierte stroma og normal lunge epitel flekk negativ for Mmp10, i samsvar med mangelen på Mmp10 ekspresjon i normal lunge epitel [20]. Notch4 farging utstilt et lignende mønster, som indikerer samtidig uttrykk for Mmp10 og Notch4 i tumorceller i grense av svulsten og omkringliggende stroma (figur 6C, øvre).
flowcytometrisk analyse for CD133 og Notch4 uttrykk i CMT167 oncospheres før injeksjon orthotopically inn i syngeniske mus (A) og CMT167 celler isolert fra ortotopiske tumorer (B). C) Mmp10 og Notch4 flekker i en primær CMT167 oncosphere tumor (
toppfeltene
) og metastatisk lesjon (
bunnplater
).
Mmp10 uttrykket er assosiert med metastasering av lungekreft celler
Nyere bevis tyder på at cscs bor i pre-metastatisk nisjer som er ansvarlige for metastatisk tumor spredning. Gitt sammenslutning av stemness og metastatisk potensial, vurderes vi uttrykk for Mmp10 og Notch4 i metastatiske lesjoner fra svulster som stammer fra oncospheres. Interessant, både Mmp10 og Notch4 flekker var intens og jevn i metastatiske lesjoner (figur 6C, lavere), noe som indikerer at disse lesjonene er beriket i Mmp10-Notch4 doble positive cscs. Det ble observert en lignende sammenslutning av Mmp10 uttrykk med metastaselesjoner i kreft hos mennesker når vi analysert offentlig tilgjengelige genuttrykk datasett av humane tumorer som bruker NextBio bioinformatikk verktøy. Analyse viste en sterk positiv korrelasjon mellom Mmp10 ekspresjon og metastatiske potensiale i human NSCLC, tykktarmskreft, melanom, brystcancer, nyrecellekarsinom og prostatakreft (tabell 1). Dermed ser Mmp10 å spille en utbredt rolle i menneskelig malignitet.
Diskusjoner
En liten undergruppe av selvfornyende stilk-lignende celler kan være ansvarlig for iverksetting, vedlikehold, progresjon og metastatisk spredning av svulster. Men relativt lite er kjent om de molekylære mekanismene som er involvert i CSC vedlikehold. Cscs kan unnslippe konvensjonell kjemoterapi, på grunn av deres iboende legemiddelresistens og /eller relativ quiescence, noe som resulterer i tilbakevendende sykdom og dårlig pasient resultat. Derfor kan terapeutiske strategier som tar sikte på å utrydde cscs forbedre kliniske resultatet av kreftpasienter.
Selv om MMP har lenge vært involvert i tumorprogresjon og metastase, vi nylig demonstrert at Mmp10 er overuttrykt i human NSCLC og
Kras
transformerte basc lungekreft initiere celler [19], [20], og at Mmp10 er nødvendig for forvandlet vekst og invasjon av menneskelige NSCLC celler
in vitro product: [19]. Videre Mmp10
– /- mus viser en betydelig reduksjon i urethane- og
Kras
indusert lunge tumorigenesis på grunn av en defekt Mmp10-manglende BASCs å ekspandere i respons til onkogene
Kras
[21]. Her, rapporterer at det er overraskende resultat at Mmp10 fremmer lungetumor initiering og metastase ved opprettholdelse av en CSC-lignende populasjon av lunge tumorceller.
cscs er definert ved deres evne til å ekspandere klonalt, differensieres til bulktumorcellene , og initiere tumorer i mottaker dyr. Her viser vi at Mmp10 er overuttrykt i CSC-beriket oncosphere kulturer fra to muse lunge adenokarsinom cellelinjer og er nødvendig for økt forvandlet vekst og klonal ekspansjon
in vitro
, og for startfasen
in vivo
. Hemming av
Mmp10
uttrykk i oncospheres reduseres vesentlig uttrykk for stamcelleassosierte transkripsjonsfaktorer og celleoverflatemarkører, noe som indikerer at Mmp10 er avgjørende for å opprettholde lunge CSC identitet. Mmp10 uttrykk er også forhøyet i cscs isolert fra menneske småcellet lungekreft cellelinjer [27], noe som tyder på at Mmp10 kan også fungere i vedlikehold av disse cscs.
En nøkkel til effektivt å målrette NSCLC cscs vil være å nøyaktig identifisere denne undergruppe innen svulster. BASCs er de antatte tumor initiere celler som
Kras
indusert muselungesvulster oppstår. BASCs utstillingsflate uttrykk for Sca1, Spc og CCSP, men til dags dato, menneske bronchioalveolar stamceller som co-express SP-C og CCSP er ikke isolert, og Sca1 er ikke uttrykt i humane lungeceller [28]. Interessant, CMT167 oncosphere kulturer er ikke bare anriket i ccsp
+ /SPC
+ celler (data ikke vist), men også i CD133
+ /Notch4
+ -celler, to markører innblandet i human- og mus cscs fra ulike krefttyper, inkludert lunge [25], [29]. Hemming av Notch signale blokkerer muligheten for glioblastom-avledet CSC Neurosfærene å forplante svulster og utarmer CD133
+ stilk-lignende celler i Neurosfærene [29]. Likeledes Notch hemming blokker spredning og tumor-initiere aktivitet av menneskelige lunge cscs [25]. Vi observerte betydelig berikelse av Notch4
+ /CD133
+ celler i CMT167 oncospheres med noen enkle positive celler som tyder på at samtidig uttrykk for disse molekylene er nødvendig for å opprettholde CMT167 cscs. Dermed kan Notch4 og CD133 være nyttige markører for lunge cscs på tvers av arter.
Våre data gir direkte bevis for at rollen som
Mmp10
i lunge cscs er celle autonom. Vår ortotopisk tumormodellen viser Mmp10 farging i tumorceller, men ikke tumorassosiert stroma eller morfologisk normale lunge epitel. Enda viktigere, ble ingen signifikante forskjeller ble observert i tumor antall, størrelse eller metastatiske lesjoner dannet av oncosphere celler orthotopically injisert i syngeniske eller NTG Mmp10
– /- mus. Således, mens mange MMP produsert av tumor-assosiert stroma spille fremtredende roller i invasive og metastatiske egenskaper lunge kreftceller, er Mmp10 produseres hovedsakelig av lunge kreftceller til å støtte den autonome vekst av cscs. Våre data er i overensstemmelse med en rekke rapporter om at Mmp10 er uttrykt i humane NSCLC-celler og ikke har med normale eller tumorassosierte tette vev [15], [17], [18]. Fremtidige studier vil fokusere på å bestemme de molekylære mekanismer som bidrar til Mmp10-mediert CSC spredning.
Dårlig utfall i lungekreftpasienter skyldes metastatisk spredning og motstand av kreftceller til kjemoterapi, to egenskaper tilskrevet cscs. I primær oncosphere-deriverte svulster observerte vi forbedret Mmp10 og Notch4 flekker i grenseflaten mellom svulsten og omkringliggende vev, noe som tyder på en rolle for Mmp10
+ /Notch4
+ celler i tumor invasjon. Disse dataene er i tråd med vår forrige finansiering som Mmp10 er nødvendig for invasjonen av menneskelige NSCLC celler
in vitro product: [19], og vår nåværende funn som Mmp10 bidrar til metastatisk oppførselen CMT167 oncosphere-deriverte svulster. Interessant, kreftceller innenfor metastatiske lesjoner jevnt express Mmp10 og Notch4 som tyder på at de er hentet fra, og høyanriket i, cscs. Mmp10 knockdown fører til en betydelig reduksjon i metastatiske lesjoner indikerer viktigheten av Mmp10 i metastatisk oppførsel.
Analyse av expression profilering data på NSCLC viste en signifikant sammenheng mellom Mmp10 uttrykk og tumorprogresjon, lokal invasivitet og fjernmetastaser [30 ]. Vi observerte lignende assosiasjoner mellom Mmp10 uttrykk og metastatisk oppførsel av menneskelig tykktarmskreft, melanom, bryst, nyre- og prostatakreft (tabell 1). Således kan Mmp10 spille en rolle utbredt i den metastatiske adferd av mange typer humane cancere. Ved hjelp av en bioinformatikk tilnærming, vi nylig demonstrert at Mmp10 uttrykk i humane tumorer er assosiert med både embryonale stamcelle gen signaturer og metastatisk potensial [21]. Interessant, cscs synes å fremme chemoresistance og en fersk undersøkelse viser at Mmp10 er overuttrykt i cisplatin-motstandsdyktig i forhold til cisplatin-sensitive menneskelige eggstokkene adenokarcinomceller [31]. Videre studier vil være nødvendig for å fastslå om Mmp10 fremmer metastase og chemoresistance i humane tumorceller ved å opprettholde et høyt metastatisk, kjemoresistent kreftstamcelle befolkning, som våre nåværende data i mus lunge adenokarcinomceller ville forutse.
Materialer og Metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP, enzymer og lentiviral RNAi-mediert genet knockdown
CMT167 og LLC celler som uttrykker ildflue luciferase var en gave fra Dr. Raphael Nemenoff (University of Colorado, Denver, CO) og var karakterisert tidligere [32]. Kort sagt ble disse cellene transfektert med pGL3 innehold ildflue luciferase konstitutivt drevet av en SV40-promoter og celler som uttrykker høye luciferase ble valgt ved hjelp av neomycin resistens [32]. Rekombinant human proMmp10 katalytiske domenet ble uttrykt i E. coli stamme BL21 (DE3), isolert fra inklusjonslegemer, renset, foldet på nytt, og aktivert
in vitro
ved behandling med 4-aminophenylmercuric acetat, i det vesentlige som beskrevet tidligere for Mmp3 [33]. Detaljer om konstruksjon og metoder har blitt sendt inn for publisering andre steder [34]. Konsentrasjoner av aktivert Mmp10 ble bestemt ved UV absorbans ved 280 nm, med en beregnet molar ekstinksjonskoeffisient på 29 910 M
-1cm
1. Spesifikk aktivitet av Mmp10 (43,75 U /ug; 1 U = 100 pmol /min ved 37 ° C) ble bestemt som tidligere beskrevet [19]. 100 U /ml Mmp10 ble lagt til som vist i figuren legender.
lentiviral vektorer som inneholder kort hårnål RNAi mot mus Mmp10 ble oppnådd fra Sigma-Aldrich. En ikke-target-kontroll lentiviral vektor inneholdende et kort hårnål RNA konstruksjon som ikke gjenkjenner noen mus eller humane gener (NT) ble anvendt som en negativ kontroll. Celler ble transdusert med rekombinant lentivirus og stabile transfektanter valgt av puromycin motstand som tidligere beskrevet [19]. RNAi sekvenser er gitt i figur S1A. Effektivitet av Mmp10 knockdown ble vurdert ved kvantitativ PCR (QPCR).
Enrichment, klonal ekspansjon og redifferentiation av lunge cscs
cscs ble beriket fra CMT167 og LLC celler ved å dyrke 10.000 celler /ml i serum -fri DMEM-F12 medium (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, California) inneholder 50 mikrogram /ml insulin (Sigma-Aldrich), 0,4% Albumin Bovine fraksjon V (Sigma-Aldrich), N-2 Plus Media Supplement (R Kolonner, mener;
