Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er en nesten universelt dødelig sykdom som følge av tidlig invasjon av tilstøtende strukturer og metastasering og mangelen på en effektiv behandlingsform. Våre tidligere studier har vist at Qingyihuaji formel (QYHJ), en syv-urt kinesisk medisin formel, hadde betydelige anti-kreft effekt i bukspyttkjertelkreft. Her, undersøkte vi effekten av QYHJ på bukspyttkjertelkreft celleinvasjon og metastase og potensialet knyttet mekanisme (r). Vi fant ut at QYHJ hemmet både tumorvekst og metastasering i nakne mus med menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celle xenografter. Videre studier indikerte at QYHJ hemmet epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT), som er karakterisert ved øket E-cadherin ekspresjon og redusert vimentin, N-cadherin og Slug uttrykk. Interleukin 6 (IL-6), et pro-inflammatorisk cytokin som produseres hovedsakelig av makrofager, kunne fremme kreftcelle EMT og invasjon. I motsetning til dette, behandling med QYHJ hemmet kreft-relaterte inflammasjon i tumorer ved å redusere infiltrasjon av tumor-assosierte makrofager og IL-6-produksjon, og dermed hindrer celle invasjon og metastase. Disse resultatene antydet at kinesisk urtemedisin QYHJ kan hemme kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon og metastase delvis ved å reversere tumorbærende betennelse
Citation. Zhang J, Wang P, Ouyang H, Yin J, Liu A, Ma C, et al. (2013) Targeting Cancer-Related Betennelse: kinesisk urtemedisin hemmer epithelial-til-Mesenchymale Overgang i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 8 (7): e70334. doi: 10,1371 /journal.pone.0070334
Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanita, Italia
mottatt: 03.02.2013; Godkjent: 18 juni 2013; Publisert: 29.07.2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Science Foundation of China National (81001061, 81072942, 81173461); Shanghai Nature Science Fund, Shanghai, Kina (09ZR1406800); Foundation doktorgradsprogrammer av Ministry of Education of China (20090071120076); Shanghai Science and Technology Committee Rising Star Program (11QA1401300); og medisinsk Talenter Training Program of Health Bureau of Shanghai (XYQ2011008). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er fortsatt en av de vanskeligste kreft å behandle [1]. Den dårlig prognose for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen er i stor grad på grunn av tidlig lokal invasjon av tilstøtende strukturer og fjernmetastaser [2]. De fleste pasienter med kreft i bukspyttkjertelen er diagnostisert med metastatisk sykdom, og bare 10% til 20% av pasienter med lokalisert sykdom er resectable på diagnosetidspunktet [3]. Gemcitabin monoterapi eller kombinasjonsterapi med Erlotinib har blitt standard kjemoterapi å behandle avansert kreft i bukspyttkjertelen; imidlertid, er median overlevelse 5-6 måneder [4]. Derfor er det viktig å finne en terapeutisk tilnærming som hjelpemidler i forebygging og /eller behandling av kreft i bukspyttkjertelen metastasering.
Epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT), prosessen av celler miste sin epitelial fenotype og anskaffe en trekkfugl mesenchymale fenotype, har blitt akseptert å spille en viktig rolle i kreft metastaser i flere menneskelige maligniteter inkludert kreft i bukspyttkjertelen [5], [6]. EMT har vist seg å ha negativ innvirkning på total overlevelse av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen [7]. Videre EMT bidrar til resistens i kreft i bukspyttkjertelen [8]. Dermed kan hemming av EMT i kreft i bukspyttkjertelen celler til rette for utvikling av en effektiv strategi for forebygging og /eller behandling av metastatisk kreft i bukspyttkjertelen.
Økende bevis tyder på at noen medisinske urter, for eksempel
Coptis chinensis product: (Huang Lian),
Scutellaria baicalensis plakater (Huang Qin),
Camellia sinensis plakater (Lu cha),
Wedelia chinensis plakater (Peng qi ju) og Songyou Yin (en kinesisk urte forbindelse), som inneholder noen bioaktive forbindelser eller en rekke fytokjemikalier, kan reversere EMT og redusere metastase [9] – [13]. Således kan disse urter anvendes som komplementære og alternative behandlinger og /eller som adjuvant terapi for konvensjonell cytotoksiske terapier. QYHJ, en syv-urt kinesisk medisinsk formel og anvendt for kreft i bukspyttkjertelen i Kina, har vist seg å hemme både tumorvekst og metastase i nakne mus med bukspyttkjertelcancercelletransplantater [14] – [16]. I tillegg QYHJ kombinert med konvensjonell vestlig medisin har vist seg å forlenge overlevelsestiden hos pasienter med levermetastaser fra bukspyttkjertelkreft [17]. Imidlertid gjenstår det underliggende molekylære mekanismen uklart.
Her viser vi at QYHJ hemmer både tumorvekst og metastasering i hårløse mus med kreft i bukspyttkjertelen celle xenografter. Resultatene indikerte at QYHJ hemmet kreft-relaterte inflammasjon i tumorer ved å redusere infiltrasjon av tumor-assosierte makrofager og IL-6-produksjon, som til slutt redusert EMT og celle invasjon. Derfor dagens funn tyder på at QYHJ er i stand til å hemme kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon og metastasering i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen delvis ved å reversere tumorbærende betennelse.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle mus forsøkene ble gjennomført i samsvar med retningslinjene i National Institutes of Health for omsorg og bruk av forsøksdyr. Studien protokollen ble også godkjent av komiteen for bruk av levende dyr i undervisning og forskning, Fudan University, Shanghai. Under etablering av en levermetastase modell og en ortotopisk modell av kreft i bukspyttkjertelen, ble musene bedøvet med 3% natrium-pentobarbital (40 mg /kg), og alle forsøk ble gjennomført for å redusere smerte.
Cellelinjer og mus
den menneskelige kreft i bukspyttkjertelen cellelinje BxPC3 ble oppnådd fra American Type Culture Collection. SW1990HM, en svært metastatisk human bukspyttkjertelkreft linje, ble subklonet fra SW1990 av vår gruppe [18]. Alle av de dyrkede celler ble dyrket i RPMI1640 /10% føtalt kalveserum og holdt i en fuktig 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C. Alle cellelinjer ble regelmessig autentisert ved å sjekke deres morfologi og testet for fravær av mycoplasma forurensning (MycoAlert, Lonza, Rockland, ME, USA).
Kvinne BALB /c-nu /nu hårløse mus alderen 4 -6 uker ble hentet fra Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og holder til i laminær skap under spesifikke patogen-frie forhold og utstyrt med mat og vann
ad libitum
.
narkotika og reagenser
QYHJ, en syv-urt kinesisk medisinsk formel, som består
Scutellria barbata plakater (Ban zhi lian),
Heydyotis diffusa plakater (Bai hua hun hun cao),
Amorphophallus kiusianus product: (hun liu gu),
Coix Lacryma-Jobi plakater (Yi rEN),
Gynostemma pentaphyllum plakater (Jiao gu lan),
Ganoderma luncidum plakater (Ling Zhi) og
Amomum cardamomum plakater (Bai dou kou). QYHJ ble framstilt som previouly beskrevet [14] – [16]. Kort sagt ble pulver av QYHJ formel produsert av Jiang-Yin Jiang Pharmaceutical Co, Ltd for å sikre og opprettholde standardisering mellom satsene pålitelighet av QYHJ, ble en høy-ytelse-væskekromatografi (HPLC) kromatografiske fingeravtrykk utviklet for sin kvalitetskontroll. Fingeravtrykks kromatogrammer av QYHJ formel ble vist i figur S1. Den endelige avkok av QYHJ ble fremstilt ved oppløsning av urte pulver i destillert vann til den ønskede konsentrasjon. Den daglige dosering for nakne mus var 18 g /kg, beregnet i henhold til følgende humane-muse overføring formel Db = Da x (Rb /Ra) x (Wb /Wa) 2/3, hvor D, R, og W representerer dosering, form koeffisient, og kroppsvekt, henholdsvis, og a og b representerer humant og mus, respektivt. Human rekombinant interleukin-6 (IL-6) ble oppnådd fra R kanin anti-CD68 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); geit anti-IL-6 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); GAPDH (Epitomics, Burlingame, CA).
Etablering av levermetastaser Model i Nude Mice
En modell for kreft i bukspyttkjertelen levermetastaser ble etablert som beskrevet tidligere [18]. Kort sagt ble nakne mus som bedøvet med kloralhydrat; milten ble utsatt; og bukspyttkjertelcancerceller SW1990HM (5 x 10
6 /0,2 ml PBS) ble injisert inn i milten ved hjelp av en sprøyte. Milten ble returnert til magen, og såret ble lukket i ett lag med sår klips. Seks uker etter injeksjon, ble musene undersøkt grovt ved obduksjon for levermetastaser. Deretter evaluerte vi tumormetastase ved å telle antallet av metastatiske kolonier i en histologisk del av midtpartiet av hver leverprøve fra hver mus og ved å bestemme forholdet mellom metastatisk området til det totale areal i histologiske snitt fra midtpartiet av hvert leveren [19], [20] sikret metastatisk til totalt areal forholdet ble beregnet ved hjelp av Adobe Photoshop versjon 7.0 (Adobe Systems) og ImageJ versjon 1.29 (National Institutes of Health) programvare, og resultatene er uttrykt som prosent.
ortotopiske modell av kreft i bukspyttkjertelen
orthotopic modell for kreft i bukspyttkjertelen ble etablert som tidligere beskrevet [21]. I korthet, 2 x 10
6 SW1990HM kreft i bukspyttkjertelen celler per dyr i 100 ul fosfatbufret saltløsning ble injisert subkutant inn i den venstre flanken av en naken mus. Tumor størrelser ble målt 3 ganger i uken ved hjelp av en caliper. Når tumorer dyrket subkutant nådd en størrelse på 0,5 til 1 cm
3, de ble aseptisk fjernet fra mus og overført til Petri-skåler inneholdende 10 ml av fosfat-bufret saltløsning. Makroskopisk vitale områder av svulsten ble kuttet i 1 mm
3 stykker ved hjelp av en skalpell. Musene ble deretter bedøvet med 3% natrium-pentobarbital (40 mg /kg), og alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse. En liten tverrgående snitt ble opprettet i venstre mage flanke, og bukspyttkjertelen ble nøye utsatt. En lomme på 2 til 3 mm ble fremstilt i halen i bukspyttkjertelen ved hjelp av den store blodåre milten som en ledende struktur, og tumorstykker ble innsatt. Bukspyttkjertelen ble så satt inn igjen i magen, og bukveggen ble stengt ved hjelp av 6-0 ikke-absorberbare suturer.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Konsentrasjonen av serum IL-6 og TNF-α ble målt ved anvendelse av en ELISA. Blodprøven ble lagret ved romtemperatur i 30 minutter, sentrifugert (12 000 x g) i 15 min, og deretter oppbevart ved -80 ° C. Konsentrasjonene av IL-6 og TNF-α ble målt ved hjelp av en sandwich ELISA kit (DuoSet, R D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)
Immunohistochemistry og immunfluorescens
Immunohistochemistry (IHC. ) ble utført som beskrevet tidligere [19]. Kort beskrevet ble prøver av tumor vev fiksert i 10% formalin og innstøpt i parafin voks. Ufargede 3-mikrometer seksjoner ble deretter kuttet fra parafinblokker for IHC analyse. Snittene ble farget med kanin-anti-vimentin (1:200) og kanin anti-E-cadherin (1:100) og kanin-anti-CD68 (1:200) ved 4 ° C over natten. Det sekundære antistoff og avidin-biotin-peroksidasekompleks metoden ble anvendt i henhold til standard protokoller levert av produsenten (Vector Laboratories, CA). Et immunglobulin-negativ kontroll ble anvendt til å utelukke ikke-spesifikk binding. Prosedyrene ble utført av to uavhengige etterforskere (PW og JZ) og en patolog (JF), som alle ble blindet av modell /behandling typen for serien av prøver. Å kvantitativt vurdere TAM infiltrasjon i hver gruppe, vi beregnet Forholdet av området som var positiv for farging CD68 til det totale areal av de histologiske seksjoner fra ti felter er tatt ved hjelp av lys-mikroskopi (x 200). E-cadherin og vimentin uttrykk ble bestemt i henhold til vår forrige rapport [16].
For immunfluorescens farging, celler og lysbilder ble fiksert med 4% paraformaldehyde og 10% formalin, henholdsvis. Objektglassene ble behandlet med 10 mM citratbuffer (pH 6,0) for antigen gjenfinning, i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene eller Glassene ble deretter inkubert over natten med anti-vimentin (1:200), anti-E-cadherin (1:100), anti-CD68 (1:200) og anti-IL-6 (1:200) ved 4 ° C over natten. Cellene eller Glassene ble deretter inkubert med fluorescens-konjugert sekundært antistoff i 1 time. Til slutt, ble cellene vasket og montert sammen med monteringsmedium inneholdende DAPI (Vector Laboratories). En negativ kontroll i hvilket det primære antistoff ble utelatt ble anvendt for å teste for antistoffspesifisitet. Bilder ble tatt med en confocal Leica fluorescens mikroskop.
Western Blot analyse
ble utført Western blot analyse som beskrevet i vår forrige rapport [19]. I korthet proteiner ble utvunnet fra dyrkede celler, og kvantifisert med nevnte bicinchoninic syre (BCA) assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA) ved anvendelse av BSA som en standard. Like mengder av protein fra forskjellige celler ble separert ved anvendelse av 10% SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk og inkubert med primære antistoffer. Målproteinene ble detektert ved bruk av en forbedret kjemiluminescens (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige).
lukking av sår Analyser
lukking av sår analyser ble utført som tidligere beskrevet [19]. Celler ble sådd ut i 6-brønns plater. Cellen mono ble såret ved manuelt å tegne en fure over monolaget med en 1-10-mL pipette tips. Cellekulturmediet ble deretter erstattet med friskt medium, 100 ng /mL av IL-6 eller bærer ble tilsatt etter behov, og sårheling ble overvåket i 48 timer under anvendelse av fasekontrastmikroskopi. Etter såret, ble såret området kvantifisert ved hjelp av Image J versjon 1.29 (National Institutes of Health) programvare. Forsøkene ble utført i duplikat.
Invasion analysen
Cell invasjonen ble bestemt ved hjelp av Matrigel invasjonen kamre (Matrigel belagt membran, BD Biosciences). Celler (1,0 x 10
4) ble sådd ut i serum-fritt medium i det øvre kammeret og tillatt å invadere mot 10% FCS til stede i det nedre kammer som et kjemotiltrekkende. Etter 48 timer ble celler som hadde reist gjennom og festet til undersiden av membranen telles som tidligere beskrevet [19].
Statistical Analysis
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik ( SD). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av variansanalyse (ANOVA) modeller og Student t-tester. En P-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 15.0 programvarepakken.
Resultater
QYHJ undertrykker levermetastaser fra menneskelig kreft i bukspyttkjertelen in vivo
Først fikk vi bekreftet effekten av QYHJ i undertrykke levermetastaser av kreft i bukspyttkjertelen. Nakne mus ble inokulert intrasplenically med den humane kreft i bukspyttkjertelen cellelinje SW1990HM og tilfeldig delt inn i QYHJ eller kontrollgruppen. En uke etter randomisering ble musene i QYHJ gruppe behandlet oralt med QYHJ (0,2 ml, gavage, daglig), mens musene i kontrollgruppen mottok normal saltløsning som en kontroll i 4 uker (dag 7-35). Seks uker etter injeksjon, ble musene avlivet og leveren deres høstet. Både QYHJ- og kontroll-behandlede celler dannet svulster når implantert i milten, men musene behandlet med QYHJ utviklet signifikant færre levermetastaser enn gjorde de som ble behandlet med kontroll fysiologisk saltvann. I tillegg mus behandlet med QYHJ vist færre metastatiske kolonier og en redusert metastatisk til totalarealforholdet (figur 1A og B). Sammen utgjør disse funnene tyder på at QYHJ kunne undertrykke levermetastaser i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen.
A. En levermetastase modell ble etablert som beskrevet i Materialer og Metoder. Mus mottok en 28-dagers behandling av QYHJ eller normal saltoppløsning som en kontroll. Mus ble ofret 6 uker etter injeksjon, og leveren deres ble høstet. Representative lever fra hårløse mus vises. H E farging ble utført på deler av metastatiske tumorer (M) og normal lever (N) vev. De metastatiske knuter er angitt med piler. n = 6 per gruppe. Original forstørrelse, × 200. B. levermetastaser ble kvantifisert ved å telle antallet av metastatiske kolonier i en histologisk del av midtpartiet av hver leverprøve fra hver mus og ved å bestemme forholdet mellom metastatisk til det totale arealet i histologiske snitt fra midtpartiet av hver leveren. Den t-test ble brukt for å bestemme statistisk signifikans.
QYHJ hemmer veksten av menneskelig pankreastumorer i en ortotopiske Nude Mouse Model
Vi har vist at behandling med QYHJ reduserer levermetastaser i hårløse mus inokulert intrasplenically med menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler. Vi har utvidet dette arbeidet for å få ytterligere innsikt om effekter av QYHJ på primære svulsten i bukspyttkjertelen og på levermetastaser. Nakne mus mottok pankreatiske implantater med tumorfragmenter og deretter ble tilfeldig fordelt i to grupper: en gruppe fikk QYHJ og den andre mottok normal saltløsning som en kontroll. Behandlingen ble administrert i 28 dager (figur 2A). Svulster i bukspyttkjertelen ble identifisert i 8 av 10 mus (80%) i begge grupper. Levermetastaser var ikke tydelig i noen av gruppene på grunn av celletypespesifikke «frø og jord» interaksjoner som styrer kronologi og områder av metastatiske mål og den korte observasjonsperioden [22]. Imidlertid QYHJ vesentlig hemmet veksten av humane pankreatiske tumorer i en ortotopisk modell naken mus (figur 2B). Den gjennomsnittlige tumorvekt var 0,90 ± 0,25 g i kontrollgruppen og 0,51 ± 0,28 g i QYHJ gruppen (p = 0,036) (figur 2C). I tillegg QYHJ først å bremse tapet av kroppsvekten i nakne mus som ble indusert ved hjelp av tumorbyrden, men denne forskjellen var ikke signifikant (figur 2D). Disse resultatene antydet at QYHJ kan hemme kreft i bukspyttkjertelen i en orthotopic naken mus modell.
A. Flytskjema for eksperimentell design og behandlingsplan. B-D. Ortotopiske modeller av kreft i bukspyttkjertelen ble etablert som beskrevet i materialer og metoder. Tre dager etter etablering, mus ble behandlet oralt med eller uten QYHJ i 28 dager, og deretter tumorene ble fjernet og veiet. Fotografier av ortotopiske transplanterte tumorer fra begge grupper er vist i B. tumorvekter er vist i C, og kroppsvekten til musene i begge gruppene er vist i D. n = 10 per gruppe. Den t-test ble brukt for å bestemme statistisk signifikans.
QYHJ hemmer EMT av kreft i bukspyttkjertelen celler
EMT, en utviklings program der epitelceller kjøpe en spindel celle morfologi og oppviser celle motilitet, er foreslått som en forutsetning for invasjon og spredning av carcinoma celler og som en presedens for kreft i bukspyttkjertelen dannelse og metastase [6], Derfor har vi målt ekspresjon av store epiteliale markør E-cadherin og mesenkymale markører vimentin, N-cadherin og Slug i tumorvev i de to gruppene. Immunohistochemisty og /eller Western blot analyse viste at behandlingen av QYHJ indusert ekspresjon av E-cadherin og undertrykt ekspresjon av vimentin, N-cadherin og transkripsjonsfaktor Slug (figur 3). Disse data antydet at QYHJ kunne hemme EMT i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler.
A. H E farging og IHC-farging med anti-Ecadherin og anti-vimentin-antistoffer ble utført under anvendelse av deler av ortotopiske transplanterte tumorer. N, normal bukspyttkjertelen vev; T, tumor. Original forstørrelse, × 200. B. Western blot-analyse ble brukt for å måle ekspresjonen av EMT-relaterte markører E-cadherin, N-cadherin, vimentin og Slug i celler avledet fra tre representative xenograft prøver fra hver gruppe. Bandet intensiteter ble målt ved densitometri og den relative angitte protein uttrykk ble vist (lavere).
QYHJ undertrykker Kreft-relatert Betennelse i bukspyttkjertelen
Tallrike studier har som kreft indikert beslektet betennelse fremmer utviklingen av svulster [23], [24]. I tillegg er noen pro-inflammatoriske cytokiner, slik som IL-8, IL-6 og TNF-a, har vist seg å aktivere EMT og til slutt for å lette celleinvasjon og metastase [25] – [29]. Derfor har vi brukt et enzymkoblet immunosorbent assay for å undersøke serumnivå av de to pro-inflammatoriske cytokiner IL-6 og TNF-α i nakne mus. Serum IL-6-nivåer var lavere i mus behandlet med QYHJ (15,50 ng /L ± 4,49 ng /l) sammenlignet med de som mottar kontrollbehandling (29,06 ng /L ± 6,99 ng /L, P 0,01). I tillegg ble serum TNF-α svekket etter behandling med QYHJ (19,94 ± 3,55 ng /L vs 29,50 ± 5,09 ng /L, P 0,01) (figur 4A). Disse data viste at QYHJ redusert produksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner. Leukocyttinfiltrasjon er observert i de fleste tumorer og er involvert i tumorinvasjon og metastase [30]. Tumorassosierte makrofager (TAM) er en viktig komponent i leukocytt infiltrat [31]. TAM infiltrerer er blitt vist å korrelere med tumorprogresjon og en dårlig prognose i kreftpasienter [32], [33]. Vi fant ut at infiltrasjon av TAM ble blokkert av QYHJ (figur 4B). I tillegg vil redusert QYHJ ekspresjon av IL-6 i TAM (figur 4C). Samlet utgjør disse resultatene viste tydelig at QYHJ redusert TAM infiltrasjon og hemmet IL-6 uttrykk, slutt å undertrykke kreftrelatert betennelse.
A. En ortotopisk modell naken mus ble etablert og behandlet med QYHJ eller bærer som beskrevet ovenfor. Blod ble samlet opp fra hver mus, og serumkonsentrasjonen av de pro-inflammatoriske cytokinene IL-6 og TNF-a ble påvist ved hjelp av ELISA. Den t-test ble anvendt for å bestemme den statistiske signifikans. B. For å evaluere TAM infiltrasjon, ble CD68 flekker utført ved hjelp av IHC. Original forstørrelse, 200 ×. TAM infiltrering ble bedømt kvantitativt ved å beregne forholdet mellom CD68-positive område til det totale areal i hvert felt, og den midlere verdi fra ti felt under 200 x mikroskopi ble bestemt. * P 0,05. C. Konfokalmikroskopi av kreft i bukspyttkjertelen vev behandlet med anti-CD68 (rød) og anti-IL-6 (grønn). Cellekjerner ble kontra med DAPI.
IL-6 induserer kreft i bukspyttkjertelen Cell EMT
For ytterligere å bekrefte sammenhengen mellom EMT og den inflammatoriske svulstens mikromiljø, evaluert vi effekten av IL- 6 på bukspyttkjertelkreft celle EMT
i
vitro
. SW1990HM, som oppviste et høyt nivå av ekspresjon vimentin, og BxPC3, som oppviste et høyt nivå av E-cadherin ekspresjon, ble behandlet med rekombinant humant IL-6. IL-6-behandling resulterte i økt ekspresjon i vimentin SW1990HM celler og redusert E-cadherin ekspresjon i BxPC3 celler, som påvist ved immunocytofluorescence (figur 5A). Disse resultatene ble bekreftet ved western blot analyse (figur 5B). Derfor våre resultater indikerte at overproduksjon av pro-inflammatoriske cytokin IL-6 promobukspyttkjertelkreft celle EMT.
A. Pancreatic kreftceller SW1990HM og BxPC3 ble behandlet med IL-6 (100 ng /ml) i 24 timer. Cellene ble deretter farget for å oppdage E-cadherin og vimentin (grønn). Cellekjerner ble kontra med DAPI. Original forstørrelse, × 200. B. bukspyttkjertelkreft-celler ble behandlet med IL-6 (100 ng /ml) i 24 timer. Totalt protein ble ekstrahert, og ekspresjon av E-cadherin og vimentin ble påvist ved western blotting. GAPDH ble brukt som en lasting kontroll.
IL-6 fremmer kreft i bukspyttkjertelen Cell migrasjon og invasjon
Virkningene av IL-6 på cellemigrasjon ble videre undersøkt ved hjelp av en sårhelende analyse. Resultatene viste at flere celler flyttet inn i bunnen av såret i IL-6, behandlede celler sammenlignet med celler som ikke mottok IL-6 behandling i begge cellelinjer (figur 6A). For å undersøke invasjon kapasitet av IL-6-behandlede kreft i bukspyttkjertelen celler, utførte vi en
in vitro
invasjon assay ved bruk av et transwell kammer belagt med matrigel. Som forventet, IL-6 behandlingen resulterte i øket celle invasjon
in vitro
i begge cellelinjer (figur 6B). Disse resultater kombinert med den observasjon at IL-6 indusert bukspyttkjertelkreft celle EMT indikerte at kreft-relaterte inflammasjon ble forbundet med en økt kapasitet for EMT og invasjon (figur 7).
A. Cell migrasjon forekomst av kreft i bukspyttkjertelen celler behandlet med IL-6 (100 ng /ml) eller kjøretøy bare ble sammenlignet via sårheling analyser. Mikroskopiske observasjoner ble registrert ved 48 timer etter å skrape overflaten av et konfluent lag av celler. Asterisk indikerer såret var fullstendig helbredet. B. invasive kapasitet på kreft i bukspyttkjertelen celler behandlet med IL-6 (100 ng /mL) eller bærer bare ble sammenlignet ved bruk av Matrigel invasjons analyser. Antallet celler som reiste gjennom membranen ble talt i 10 felt under × 20 objektiv. Original forstørrelse, × 200. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SD av verdiene som ble oppnådd i tre uavhengige forsøk. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av t-test.
QYHJ rettet mot kreftrelatert betennelse i bukspyttkjertelen via redusert TAM infiltrasjon og IL-6 produksjon. Fordi IL-6 kan fremme kreft celle migrasjon og invasjon ved å fremkalle EMT, undertrykkelse av kreft-relaterte betennelse ved QYHJ kan hemme kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon og metastasering.
Diskusjoner
presentere resultater viste at kinesisk urtemedisin QYHJ kan hemme kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon og metastasering via undertrykkelse av kreft-relaterte betennelse, spesielt reduksjon av TAM-avledet IL-6. Disse funnene utvide våre tidligere observasjoner om viktigheten av svulsten mikromiljøet som et viktig mål for kinesisk urtemedisin.
Tradisjonell kinesisk medisin (TCM), som er basert på en unik teori og ensom sikt praktisk erfaring, er svært populært i Kina. Det har blitt rapportert at 90% av moderne kinesiske kreftpasienter har fått en form for TCM under behandlingsregime [34]. Satsene for TCM som brukes av helsepersonell og pasientenes interesse utenfor Kina fortsetter å stige hvert år, spesielt innen onkologi [35]. Anvendelse av TCM som adjuvans kreftterapi har blitt rapportert å forbedre effekten av både kjemo- og stråleterapi og for å bidra til å redusere de uheldige virkningene av hver behandlings [36], [37]. Videre har de kinesiske urte medisiner som brukes i TCM nylig blitt anerkjent som en viktig kilde for romanen narkotika utvikling, inkludert anti-kreft narkotika [38], [39]. I denne studien fikk vi bekreftet at QYHJ hemmet metastaser i kreft i bukspyttkjertelen; Men de underliggende mekanismene er fortsatt uklart.
Nyere studier har bekreftet at kreftrelatert betennelse påvirker mange aspekter av malignitet, inkludert spredning og overlevelse av ondartede celler, angiogenese, metastaser, og respons på behandling [24]. Tumor-fremmende inflammatoriske celler inkluderer makrofag-undertyper, mastceller og neutrofiler, samt T- og B-lymfocytter. Makrofager utgjør en viktig del av immunceller infiltrere observert i nesten alle kreftformer [31]. Det er akseptert at, generelt, kreft- og vert celle-avledet signaler programmakrofager til å tilegne seg et M2-aktig polarisert og ellers tumor-støttende fenotype [40]. I mange tilfeller er forhøyede mengder TAMs forbundet med en dårligere prognose [32], [33]. TAM kan slippe vekstfaktorer (for eksempel TGF-β), pro-inflammatoriske faktorer (for eksempel IL-6) og enzymer (f.eks MMP2, MMP9) som fremmer angiogenese, tumorigenese, og metastase [24]. Alle disse faktorene eller enzymer kan fremme EMT. For eksempel, de proinflammatoriske cytokiner TNF-α, IL-6 og IL-8 kan indusere EMT og markeds kreft metastase [25] – [29]. I tillegg bekreftet en klinisk undersøkelse som disse cytokinene ble forhøyet signifikant hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og var assosiert med en dårlig prognose [41]. Derfor, legemidler som er rettet mot kreft-relaterte inflammasjon har potensial til å re-utdanne et tumor-fremmende inflammatorisk infiltrat eller for å forhindre at slike celler fra å migrere til tumorstedet. I denne studien, viste vi at QYHJ redusert TAM infiltrasjon og effektivt hemmet flere proinflammatoriske cytokiner som TNF-α og IL-6, som antydet at QYHJ kan hemme kreft-relaterte betennelse i bukspyttkjertelen.
under prosessen med EMT, ytre signaler som aktiverer den indre transkripsjonsfaktorene snegle, Slug, Twist og ZEB1, som undertrykker ekspresjon av E-cadherin og fremme ekspresjonen av vimentin og N-cadherin, slik at cellene endres fra en polarisert epitel fenotype til en trekkfugl mesenchymale fenotype [42]. De «EMTed» carcinoma celler antas å være ansvarlig for seeding fjernt formidling, til slutt fører til kreft-relatert dødelighet [5], [7]. Derfor hypotese vi at QYHJ hemmer metastasering av kreft i bukspyttkjertelen celler, potensielt ved å undertrykke EMT. Som vi forventet, bekreftet våre resultater at QYHJ behandling resulterte i økt E-cadherin uttrykk og redusert vimentin, N-cadherin og Slug uttrykk, som indikerte at QYHJ hemmet EMT av celler og undertrykt celle invasjon.
IL-6 , som er fremstilt hovedsakelig av mononukleære celler, makrofager og en mindre andel av fibroblaster, endotelceller, T- og B-lymfocytter, kondrocytter og amnion-celler [43], er en pleiotropisk cytokin som forårsaker carcinogenesis, fremmer tumorvekst og letter tumorcellemetastase [ ,,,0],25] – [27]. Akkumulerende bevis tyder på at IL-6 blir ofte forhøyet og således er assosiert med en dårlig prognose i mange typer kreft, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [44], [45]. I tillegg er nye behandlingsformer rettet mot IL-6 for tiden gjennomgår kliniske studier [46]. Fordi vi demonstrert at QYHJ redusert TAM infiltrasjon og effektivt hemmet IL-6 produksjon, søkte vi å bekrefte om redusert IL-6 produksjon var knyttet til undertrykkelse av EMT og invasiv kapasitet på cellene.
