Abstract
Prognose av pasienter med tykk- og endetarmskreft (CRC) er generelt dårlig på grunn av mangel på enkle, praktiske og ikke-invasiv verktøy for CRC deteksjon på et tidlig stadium. Oppdagelsen av microRNAs (miRNAs) og deres ulike uttrykksprofiler mellom ulike typer sykdommer har åpnet en ny vei for svulst diagnose. Vi bygget et serum mikroRNA uttrykk profil signatur og testet sin spesifisitet og sensitivitet som en biomarkør i diagnostisering av CRC. Vi studerte også sin mulige rolle i å overvåke utviklingen av CRC. Vi gjennomførte en case-kontrollmåling to fase til å identifisere serum mirnas som biomarkører for CRC diagnose. Ved hjelp av kvantitative revers transkripsjon polymerase kjedereaksjoner, testet vi ti kandidat mirnas i et treningssett (30 CRC vs 30 kontroller). Risk score analyse ble anvendt for å evaluere den diagnostiske verdien av serum miRNA profileringssystem. Andre uavhengige utvalg, inkludert 83 CRC og 59 kontroller, ble brukt til å validere diagnostisk modell. I treningssettet, seks serum mirnas (MIR-21, la 7g, MIR-31, MIR-92a, MIR-181b, og MIR-203) hadde signifikant forskjellige uttrykk nivåer mellom CRC og friske kontroller. Risk score analyse viste at den seks-miRNA basert biomarkør signatur hadde høy sensitivitet og spesifisitet for å skille CRC prøver fra kreft-frie kontroller. Arealene under mottakeren opererer karakteristikk (ROC) kurve av de seks-miRNA signatur profiler var 0,900 og 0,923 for de to sett av serumprøver, respektivt. Men for de samme serumprøver, områdene under ROC-kurven brukes av tumormarkører carcinoembryonic antigen (CEA) og karbohydrater antigen 19-9 (CA19-9) var henholdsvis bare 0,649 og 0,598,. Uttrykket nivåer av de seks serum mirnas ble også korrelert med CRC progresjon. Dermed kan den identifiserte seks miRNA signatur brukes som en ikke-invasiv biomarkør for diagnostisering av CRC, med relativt høy sensitivitet og spesifisitet
Citation. Wang J, Huang Sk, Zhao M, Yang M, Zhong Jl , Gu Yy, et al. (2014) Identifisering av en Sirkulasjons mikroRNA signatur for tykktarmskreft Detection. PLoS ONE 9 (4): e87451. doi: 10,1371 /journal.pone.0087451
Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Frankrike
mottatt: Oktober 30, 2013, Godkjent: 28 desember 2013; Publisert: 07.04.2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Key Basic Research Program of China (2007CB914700). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftformen i verden. Det står for nesten 50 000 dødsfall hvert år, og er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall [1], [2]. Det ble anslått at hvert år, ville en og en halv million nye CRC tilfeller diagnostisert i verden [2]. En studie som er registrert i National Cancer Institute overvåkings epidemiologi og sluttresultatet (SEER) database, ble utført med 119,363 personer diagnostisert med kolon adenokarsinom mellom 1991 og 2000. Denne studien fant at de observerte fem-års overlevelse var knyttet til den fasen av sykdom ved diagnose; for pasienter diagnostisert i I /IIa scenen overlevelse var mye bedre enn for pasienter diagnostisert i senere stadier [3]. Selv kvalifiserte omsorgs og screeningprogrammer spiller viktige roller i overlevelse av pasienter med CRC, kirurgisk reseksjon i tidlig stadium er den mest effektive behandlingen og forlenger overlevelsen av pasienter. Dessverre, tidlig stadium CRC er vanskelige å oppdage på grunn av færre symptomer.
Foreløpig er endoskopi og fekal okkult blod tester (FOBT) ofte brukt i klinikker for å diagnostisere CRC pasienter. Men det er ikke bare tilfeldig biopsi en invasiv prosedyre, men mulige utvalgsfeil kan forekomme, noe som ytterligere begrenser deres effekt. I mellomtiden, selv om FOBT er enkel, billig og ikke-invasiv, presenterer det særlig dårlig sensitivitet for påvisning av tidlig stadium CRC [4], [5]. Proteomet av sirkulerende blod er også blitt anvendt for å detektere biomarkører for CRC for eksempel karsinoembryonisk antigen (CEA) og karbohydratantigenet 19-9 (CA19-9), men dens sensitivitet og spesifisitet, særlig for tidlig fase kolorektal kreft, synes å være utilstrekkelig [6]. Derfor er nye metoder og nye diagnostiske biomarkører presserende behov for masseundersøkelser av tidlige hendelser av CRC.
mikroRNA (miRNA) er en ~22-nt lange ikke-kodende RNA, som spiller en negativ rolle i genuttrykk [7], [8]. Endret ekspresjon av mirnas har vært forbundet med forskjellige sykdommer, spesielt cancer. Mirnas har vist seg å kunne skille ulike kreftformer og forutsi resultater i både faste og hematologiske maligniteter [7]. Nyere studier har vist at det er store mengder mirnas i sirkulasjon. Disse sirkulerende mirnas er i stand til å tåle ugunstige fysiologiske tilstander, slik som ekstreme variasjoner i pH, temperatur, og flere fryse /tine-sykluser [9], [10]. Videre har en del forskere påpekt at profilene til sirkulerende miRNA viste konsekvent uttrykk nivåer over fysiologisk friske individer [11]. Fordi serum og plasma er relativt lett tilgjengelige, sirkulerende miRNA er en av de mest lovende kandidater for diagnostisering av kreft. Mange studier har vist at uttrykket mønstre av serum mirnas potensielt kan identifisere forskjellige typer kreft, inkludert lungekreft, prostatakreft, brystkreft, eggstokk-kreft, leverkreft og [12], [13]. Derfor identifisere en unik serum miRNA uttrykket profil for CRC vil være nyttig i diagnostisering og oppfølging behandling av svulster.
For å styrke den diagnostiske effektiviteten av sirkulasjon miRNAs, nye metoder for å heve deres diagnostisk verdi for CRC Er pålagt. Mange forskere funnet at kombinasjonen av flere mirnas som en biomarkør kan forbedre den diagnostiske effektivitet [14], [15]. Men disse studiene fokuserer hovedsakelig på oppregulert miRNAs. I denne studien ønsket vi å kombinere både opp- og ned-regulert mirnas, for å bygge en diagnostisk modell for CRC. Vi først validert ti mirnas tidligere rapportert å være assosiert med CRC, nemlig MIR-21, MIR-31, MIR-203, MIR-92a, MIR-181b, MIR-145, MIR-143, MIR-30c, MIR-17, og la 7g. Så, ved statistisk analyse, identifiserte vi en profil som kombinert seks serum mirnas, som kan tjene som en roman invasiv biomarkør for CRC diagnose.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og friske frivillige før studien, og alle prøvene ble samlet inn i henhold til protokoller godkjent av klinisk forskningsetiske komité for Cancer Institute og Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences.
studie~~POS=TRUNC og pasienter
for å identifisere en surrogat biomarkør for CRC, ble en flertrinns case-control studie designet for å identifisere en diagnostisk serum miRNA profil (se figur 1). Totalt 113 pasienter med primær CRC (Stages I-IV) og 89 kontrollpersoner ble rekruttert til studien. Alle 113 kreftpasienter ble rekruttert fra Cancer Institute og Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences mellom 2008 og 2010. Pasienter med en tidligere historie av ondartede svulster, arvelig non-polypose CRC eller familiær adenomatøs polypose, ble ekskludert. Serumprøver ble samlet før enhver tumorreseksjon slik som kirurgi, kjemoterapi og /eller radioterapi. Hver pasient hadde en histologisk bekreftet diagnose, og svulsten stadium ble bestemt i hovedsak basert på kirurgi funn, eller på biopsi og bildeteknologi når svulsten var ikke egnet for kirurgisk behandling. Friske kontroller uten kjent malignitet eller aktiv inflammatorisk tilstand ble matchet til pasienter basert på alder, kjønn og etnisitet. TNM klassifiseringssystemet ble brukt til å vurdere tumorstadium i henhold til svulsten-node-metastaser iscenesettelse system av den sjette utgaven av det amerikanske Joint Commission. Demografi og kliniske trekk studiekohorten er oppført i Tabell 1.
I biomarkør utvalget scenen, et panel av ti kandidat mirnas (MIR-21, la 7g, speil 31, MIR-92a, MIR-181b, MIR-203, MIR-17, MIR-30c, MIR-143, og MIR-145) ble valgt for etterforskning i serumprøver basert på tidligere vurderinger på tykktarmskreft [13], [ ,,,0],16]. For treningssettet, vi tilfeldig valgt 30 CRC og 30 friske kontroller og utført kvantitative revers transkripsjon polymerase kjedereaksjoner (QRT-PCR) for å velge kandidat miRNAs. Deretter validering ble utført ved hjelp av de resterende 83 CRC og 59 friske donorprøver (valideringssettet).
Serum samling, RNA isolasjon, og QRT-PCR-analyse
Venøse blodprøver (≈5 ml ) ble samlet i serum prøverør, og fikk stå ved romtemperatur i ca. 1 time før den ble sentrifugert ved 820 g i 10 min ved 4 ° C. Det resulterende serum ble overført til nye rør, fulgt av ytterligere sentrifugering ved 16.000 x
g
i 10 minutter ved 4 ° C, for fullstendig å fjerne eventuelle cellerester. Total RNA ble isolert fra 250 ul av serum ved hjelp av Trizol LS-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ko-renseteknikk. For hver 250 ul av serum, ble faseseparasjon utført ved tilsetning av 750 ul av Trizol LS. Deretter ble 200 ul av triklormetan tilsettes for å øke den RNA-faseseparasjonsprosess. Totalt RNA ble utfelt ved hjelp av isopropanol og vasket med 75% etanol, ble deretter 30 ul RNase fritt vann tilsatt for oppløsning. Hver 250 ul av serum ga 30 pl av totalt RNA-oppløsning, som ble lagret ved -80 ° C. Tre ul av total RNA ble polyadenylert av poly (A) polymerase og revers transkribert til cDNA ved hjelp av Takara mikroRNA transkripsjon kit (Takara, Japan), etter produsentens protokoll. Omvendt transkribert produkter ble fortynnet til en femtedel med RNase-fritt vann og brukes som maler for videre PCR-analyse. PCR ble utført ved hjelp av SYBR Premiks Ex Taq II kit (Takara) i en ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) med produsenten-gitt universal primer og miRNA-spesifikke fremover primer. Primersekvensene er angitt i tabell 2. Hver reaksjon ble utført i en 20 ul volum system inneholdende 2 ul cDNA, 0,4 ul av hver primer (10 uM), 0,4 ul ROX henvisning fargestoff (50 x), 6,8 ul sterilt destillert vann, og 2 × SYBR Premiks Ex Taq II. PCR programmet var: denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering i 5 s ved 95 ° C, og forlengelse i 31 s ved 60 ° C. Ved slutten av PCR-sykluser, ble smeltekurve analyser utført for å bekrefte spesifisiteten av det forventede PCR-produkt. Hver reaksjon ble utført i triplikat, og cDNA-fortynningen ble brukt som templat for den negative kontroll.
Endogene MIR-16 ble anvendt som den normalisereren for å sirkulere miRNA kvantifisering. De relative uttrykk nivåer av miRNAs ble beregnet ved sammenlignende 2-
ΔΔCT metode som beskrevet tidligere [17], [18].
Serum CA19-9 og CEA analyse
tumor markører CEA og CA-199 ble analysert med en Elecsys immunoassay analysator (Roche, Basil, Sveits). De øvre normale grenser for tumormarkører var 6,5 ng /ml for CEA og 39 U /ml for CA-199.
Statistisk analyse
Sammenligning av demografiske og kliniske funksjoner mellom CRC pasienter og friske kontroller ble bestemt av t-test, enveis variansanalyse (ANOVA), eller chi-squared test.
Risk poengsum analyse ble utført for å evaluere sammenhengen mellom CRC prøvene og miRNA uttrykk nivåer. Risikoen score på hvert miRNA i treningssettet ble betegnet som
s
. For oppregulert mirnas, ble risikoen poengsum satt som en hvis uttrykket nivået var høyere i CRC prøvene enn den øvre 95% referanseintervall for tilsvarende miRNA nivå i kontrollene, og for de nedregulert mirnas, risikoscore var angitt som -1 om ekspresjonsnivået var lavere i CRC-prøvene enn den nedre 95% referanseintervall i kontrollene; ellers poengsummen ble angitt som 0. For korrelasjonen av hver miRNA med CRC risiko, ble hver pasient tildelt en risikoscore funksjon (RSF) basert på en lineær kombinasjon av uttrykk nivåer av miRNAs. Ved hjelp av informasjon fra seks mirnas, RSF for prøve
i
er som følger: I ligningen ovenfor,
sij
er risikoen score for miRNA
j
på prøven
i
, og W
j
er vekten av risiko score på miRNA
j
. For å bestemme Ws ble seks univariate logis regresjonsmodeller utstyrt med sykdomsstatus med hver av risiko score. Regresjonen koeffisient av hver risiko resultatet ble anvendt som vekt for å indikere bidraget fra hver miRNA til RSF. Frekvenstabellen og mottaker som opererer karakteristiske (ROC) kurver ble deretter benyttet for å evaluere de diagnostiske virkningene av profilering og for å finne en passende cutoff-punkt. Validering av prosedyren og cutoffs ble utført på valideringssettet.
En uavhengige utvalg t-test ble brukt for å sammenligne serum miRNA konsentrasjoner mellom kreft og sunne prøver. På grunn av størrelsen og omfanget av relative miRNA uttrykk nivåer som ble observert, resultatene data ble log-transformeres for analyse (log
2). Alle testene var to-sidig og et signifikansnivå på p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle de statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS 16.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) og grafer ble generert med Graphpad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA). Data er presentert som gjennomsnittet. For klyngeanalyse, ble hierarkisk clustering utført ved hjelp Cluster 3.0 (Berkeley, CA, USA) med hele sammenhengen metoden.
Resultater
Beskrivelse av pasientene
All 113 pasienter deltok i studien hadde klinisk og patologisk diagnose av CRC. Som vist i tabell 1, var det ingen signifikant forskjell i fordelingen av alder, kjønn og andre sykdommer, slik som hjertesvikt eller nevrologisk sykdom, mellom CRC-pasienter og friske kontroller under opplærings og valideringssett. Forhøyede nivåer av CEA ( 6,5 ng /ml) og CA19-9 ( 39 U /ml) ble funnet i 40 og 26 pasienter henholdsvis
Evaluering av miRNA ekspresjon i CRC-pasienter og friske kontroller. av real-time QRT-PCR-analyse
En case-control test to fase er designet for å identifisere serum mirnas som kandidat biomarkører for CRC diagnose. Vi valgte ti søker mirnas rapportert i tidligere studier, og brukes QRT-PCR-analyser for å bekrefte deres uttrykk i de 30 CRC tilfeller og 30 alders- og kjønnstilpassede friske kontroller i treningssettet. MiR-16 ekspresjon ble brukt til å normalisere QRT-PCR-data. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i nivåene av MIR-17, MIR-145, MIR-143, MIR-30c mellom CRC og kontrollprøver (data ikke vist). Men uttrykket nivåer av seks av de mirnas var signifikant forskjellig mellom CRC og kontrollprøver; to mirnas, MIR-21 og la 7g, ble oppregulert, og fire mirnas, MIR-31, MIR-92A, MIR-181B, og MIR-203, ble nedregulert (Tabell 3). Konsentrasjonene av de seks forskjellig uttrykt mirnas ble undersøkt ved QRT-PCR i 83 CRC pasienter og 59 kontrollpersoner i valideringssettet. De endringer i miRNA uttrykk mønstre observert i valideringssettet var i samsvar med de som finnes i treningssettet. Den differensielle ekspresjonen av de seks mirnas i 113 CRC tilfeller i forhold til de 89 kontrollene er vist i figur 2. Således er dette to-fase-test og analyseprosessen genereres en profil av seks serum mirnas som tjente som en potensiell biomarkør for CRC. De seks kandidat biomarkører ble deretter utsatt for ytterligere tester og analyser.
serum uttrykk nivåer av de seks utvalgte mirnas ble målt i 113 CRC tilfeller og 89 friske kontrollpersoner (både treningssettet og valideringssettet) ved hjelp av en SYBR basert QRT-PCR-analyse. Hver reaksjon ble utført i tre eksemplarer.
Separasjon av CRC saker og friske kontroller av risikoscore analyse
For å evaluere den diagnostiske verdien av en miRNA uttrykk signatur bestående av seks identifiserte mirnas, utførte vi en risiko poengsum analyse for å skille mellom de CRC-serumprøver og serumprøver fra friske kontroller. Først ble risiko poengsum for hver av mirnas i treningssettet beregnet ved anvendelse av risikoen stillingen formel. På den optimale cutoff prediktiv verdi på 9,595 for risikoscore funksjon, når sensitivitet og spesifisitet var på sitt høyeste, ble serumprøver delt inn i en lav-risikogruppe og en høyrisikogruppe som representerer de friske donorer og CRC tilfeller, henholdsvis . Deretter brukte vi verdi cutoff til analysen de 142 prøvene i valideringssettet. Som vist i tabell 4, er positiv prediktiv verdi og negativ prediktiv verdi av den seks-miRNA signatur i treningssettet var 0,96 og 0,85 henholdsvis, og i valideringssettet de positive og negative prediktiv verdi var 0,95 og 0,92 henholdsvis. Vi har også konstruert ROC-kurver for å beregne følsomheten og spesifisiteten til de miRNA-baserte biomarkører. Arealene under kurven (AUC) var 0,900 og 0,923 for treningssettet og valideringssett, henholdsvis (figur 3A og 3B). Bruke samme serumprøver, vi sammenlignet med AUC for seks-miRNA signatur med AUC for tumor markører CEA og CA19-9, som i dag brukes i klinikker for CRC deteksjon. AUC-verdier for seks-miRNA signatur var markert høyere enn AUC for CEA (0,649) og CA19-9 (0,598) (Figur 3C og 3D). Disse resultatene indikerer at den seks-miRNA signatur er en mer nøyaktig biomarkør enn CEA og CA19-9 for CRC diagnose.
(A) ROC-kurve analyse for profilen av seks- miRNA signatur i treningssettet gitt AUC verdi på 0,900 (95% KI: 0,812 til 0,988) med 83,3% sensitivitet og 96,7% spesifisitet (cut-off verdi = 9,595). (B) ROC-kurve analyse for profilen av den seks-miRNA signatur i valideringssettet ga en AUC-verdi på 0,923 (95% CI: 0,869 til 0,976) med 96,4% sensitivitet og 88,1% spesifisitet (cut-off-verdi = 9,595) . (C) carcinoembryonic antigen (CEA) ga en AUC verdi på 0,649 (95% CI): 0,574 til 0,724) med 35,4% sensitivitet og 94,4% spesifisitet og (D) karbohydrat antigen 19-9 (CA19-9) ga en AUC-verdien av 0,598 (95% KI: 0,521 til 0,676). med 23% sensitivitet og 96,6% spesifisitet, for de samme serumprøver
Association med demografiske og kliniske faktorer
for å finne ut hvilken rolle de seks miRNA-baserte tumormarkører i CRC utvikling ble CRC tilfeller ytterligere stratifisert basert på deres TNM staging. I denne analysen ble CRC-prøver fra treningssettet, og valideringssettet kombinert og uttrykket nivåer av de seks mirnas ble korrelert med tumorstadium av CRC pasientene. Vi fant at risikoscore verdiene var annerledes blant CRC tilfeller på ulike kreft stadier (se figur S1 A). Gjennomsnittlig risikoscore for CRC tilfeller på senere stadier (IIb, III og IV) var betydelig høyere enn resultatet på tidligere stadier (I og IIa). Det var ingen signifikant sammenheng mellom de seks mirnas og kjønn, alder, lymfeknutestatus, og tumor invasiv dybde (se Figur S1B-E).
Unsupervised klyngeanalyse
For å analysere differensial uttrykk for de mirnas mellom CRC og kontrollserumprøver, gjennomførte vi en unsupervised clustering prosess som var blind for de kliniske merknader. Dendrogrammet viser en klar separasjon av CRC prøver fra kontrollprøvene basert på den seks- miRNA signatur profil (se fig S2). I treningssettet, ingen av 30 CRC prøver og bare fire av 30 kontrollprøver ble feilklassifisert (figur S2A). I valideringssettet, ble de 83 CRC tilfeller og 59 kontroller klassifisert i to hovedkategorier; bare en CRC saken og tre kontroller ble feilklassifisert (figur S2B)
Diskusjoner
Mange studier har funnet at miRNA uttrykket er avvikende i CRC utvikling.; men de fleste av disse studiene fokusert på ekspresjon av mirnas i tumor vev og celler. Selv vev mirnas kan gi en nøyaktig diagnose av ulike typer kreft, vanskeligheten i å samle inn vevsprøver begrenser sin søknad for påvisning av kreft biomarkører. Anskaffelse av vevsprøver er en invasiv prosedyre og avhenger av kirurgiske seksjoner etter første kliniske klassifisering. Jakten på ikke-invasiv verktøy for diagnostisering av kreft har lenge vært et mål for mange forskere, og mye av interessen har vært på sirkulasjon av nukleinsyrer i plasma og serum. Sammenlignet med DNA og mRNA, sirkulerende mirnas viser bemerkelsesverdig stabilitet etter forlenget inkubasjon ved romtemperatur og /eller flere fryse-tineprosesser. Imidlertid er den beskyttende mekanisme av sirkulerende mirnas fortsatt ukjent. Noen forskere rapportert at sirkulerer mirnas var i form av argonaute 2 (Ago2) -miRNA komplekser som kunne unngå RNase-fordøyelse [19]. Mirnas i plasma kan bli utskilt fra celler og frigjøring prosessen kan være en selektiv mekanisme som er korrelert med malignitet [20]. Det er mange fordeler ved å bruke sirkulerende mirnas for CRC deteksjon. Prøvetaking er enkel og rimelig, og viktigere, er et forholdsvis ikke-invasiv prosedyre som kan brukes lett i screening og overvåking av kreftpasienter. Videre mirnas profiler er i hovedsak konsistent blant friske individer og er veldig stabil i blodet.
Tidlig søker etter ikke-invasiv verktøy for diagnostisering av kreft ble fokusert hovedsakelig på én eller bare noen få kreftspesifikke mirnas [9] , [21] – [23]. For eksempel, Liu et al. [21] har studert miRNA profilene i serum hos magekreftpasienter, pasienter med kolorektal kreft, og friske individer. Interessant, fant de at sirkulerende MIR-378 var knyttet til magekreft, men var ikke assosiert med andre gastrointestinale kreftformer. De rapporterte at Mir-378 uttrykk nivåer kan skille mage kreftpasienter fra friske kontroller, med 87,5% sensitivitet og 70,73% spesifisitet [21]. Serum MIR-1246 alene ga et område under ROC kurven for 0,754, med 71,3% sensitivitet og 73,9% spesifisitet for å skille esophageal kreftpasienter fra friske kontroller [23]. Selv om denne tilnærmingsmåten er enkel og tilgjengelig, spesifisiteten av biomarkører basert på en enkelt tumorspesifikt miRNA er vanligvis dårlig. Initiering og utvikling av kreft involverer mange ulike og komplekse molekylære hendelser, som vil påvirke spredning, cellesykluser og apoptose. Derfor bør en kombinasjon av flere serum mirnas være mer pålitelig for tumordeteksjon enn de konvensjonelle enkeltproteinbaserte eller karbohydrat-baserte biomarkører. I denne studien identifiserte vi to oppregulert serum mirnas (MIR-21, la-7g), og fire nedregulert mirnas (MIR-31, MIR-181B, MIR-92A, MIR-203). Så langt vi kjenner til, er dette den første studien å beskrive et serum miRNA basert signatur som ble bygget ved å kombinere over- og under uttrykt mirnas, som begge spiller viktige roller i svulsten spredning, migrasjon og invasjon. De seks-miRNA signatur kunne oppdage CRC serumprøver med en sensitivitet og spesifisitet på 93% og 91%, respektivt (se tabell S2), signifikant høyere enn en hvilken som helst enkelt-faktor biomarkør, slik som CA19-9 eller CEA. Våre resultater viste at for de samme serumprøver, følsomheten for CRC påvisning av CA19-9 og CEA var 35% og 23%, henholdsvis. Åpenbart kan den kombinerte seks-miRNA signatur med hell separere de CRC-pasienter fra kontrollene, og kan tjene som en nøyaktig biomarkør for CRC diagnose. Spesielt dette biomarkør viste et annet uttrykk profil mellom normale kontroller og CRC pasienter med bare stadium I /II kreft (Tabell S1). CRC pasienter med stadium I /II kan gjennomgå fullstendig fjerning av tumoren, og vil ha en bedre prognose. Våre data antyder sterkt at anvendelsen av de seks-miRNA signatur som en biomarkør for å definere tidlig stadium CRC kan være en effektiv måte å endre resultater og bedre prognose. Vi har funnet at miRNA ekspresjon er korrelert med tumorstadium, og serumet miRNA signaturen kan brukes til å detektere progresjon fasen av CRC. Ingen forskjeller ble funnet ved CRC sakene ble fordelt etter demografiske og kliniske faktor, slik som kjønn, alder, lymfeknutestatus, og svulst invasiv dybde; Men resultatene viser at en høy risiko poengsum var forbundet med den avanserte kliniske stadier av sykdommen (figur S1). Foreløpig er TNM staging system det viktigste verktøyet som brukes av klinikere til å estimere tumorbelastning og forutsi prognose og overlevelse. Vi foreslår at seks-miRNA signatur i serumprøver kan bli en viktig prediktiv parameter i å velge den beste kombinasjonen av behandlingsmetoder, slik som kirurgi, stråling og /eller kjemoterapi. Men våre data er delvis motstridende med resultatene av noen tidligere studier; for eksempel, ble uttrykket nivåer av MIR-181b, MIR-92a, MIR-31, og MIR-203 rapportert å være forhøyet i CRC vevsprøver sammenlignet med kontroller. Denne forskjellen kan skyldes forskjellige miRNA uttrykk nivåer mellom vev og plasma. Mange studier har vist at miRNA ekspresjon i vevsprøver endret seg i motsatt retning fra deres ekspresjon i serumprøver [21], [24]. Dette kan være forårsaket av den cellulære mekanisme for utvelgelse av miRNA meldingen [20]; for eksempel kan kreftceller selektivt inneholde noe mirnas, noe som resulterer i en reduksjon av mirnas i serum. Mer interessant, ekspresjonen av disse fire nedregulert mirnas ble også funnet å bli nedregulert i noen andre typer kreft. For eksempel, MIR-31, som er lokalisert på kromosom 9p21.3, var signifikant lavere i blærekreft, [25], brystkreft [26], magekreft [27], prostatakarsinomer, [28], og CRC med hjernemetastaser [ ,,,0],29]. Mange forskere har funnet ut at Mir-31 kan hemme brystkreft metastase [26], [30], og deregulering av MIR-31 har vært forbundet med kreft progresjon og metastasering. Den høye uttrykk for MIR-92a har vært forbundet med utvikling og progresjon av mange kreftformer [31]; imidlertid, Shigoka et al. [32] fant at Mir-92a ble sterkt uttrykt i leverkreft vev, var lavere i plasma hos disse pasientene, men ble hevet i sin plasma etter kirurgisk behandling. Nilsson et al. [33] viste at lave MIR-92A nivåer i svulster var assosiert med scenen av svulsten og at dens nedregule økt celle migrasjon. MiR-181b har vist seg å fungere som en tumor suppressor gen, og ble nedregulert i menneskelige hjernesvulst [34], [35].
I sammendraget, er dette den første studien for å rapportere klinisk diagnostisk verdi av en seks-miRNA-basert biomarkør signatur i serum som inneholder både opp- og ned-regulert miRNAs. Vårt arbeid vil tjene som et grunnlag for videre etterforskning, helst store validering i kliniske studier, før serum mirnas kan brukes som en rutinemessig screening verktøy for CRC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
sammenslutning av uttrykk nivåer av de seks mirnas med demografiske og kliniske faktorer av CRC pasienter. (A) Når CRC saker ble gruppert etter deres TNM staging, var gjennomsnittlig risiko score på CRC tilfeller på senere stadier (IIb, III og IV) var signifikant høyere enn på tidligere stadier (I og IIa) (p 0,05). (B-E) Det var ingen signifikant sammenheng mellom de seks mirnas og tumor invasiv dybde, lymfeknutestatus, kjønn og alder
doi:. 10,1371 /journal.pone.0087451.s001 plakater (docx)
Figur S2.
dendrogram av unsupervised clustering resultater. Dendrogrammet viser en klar separasjon av CRC prøver fra kontrollprøvene basert på den seks-miRNA signatur i både treningssettet (A) og valideringssettet (B)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0087451. S002 product: (docx)
Tabell S1.
Forskjellig-uttrykt mirnas i stadium I /II CRC serumprøver sammenlignet med i kontrollserumprøver. De normaliserte mirnas uttrykk nivåer er presentert som gjennomsnitt ± SD
doi:. 10,1371 /journal.pone.0087451.s003 plakater (docx)
Tabell S2.
Sensitivitet og spesifisitet av fem-miRNA biomarkør signatur sammenlignet med CEA og CA19-9 markører
doi:. 10,1371 /journal.pone.0087451.s004 plakater (docx)
