Abstract
HPV-infeksjon er en kausal agent i mange epiteliale kreftformer, men vår forståelse av genetisk mottakelighet for HPV-infeksjon og resulterende kreftrisikoen er begrenset. Epidermodysplasia verruciformis er en sjelden tilstand av ekstrem følsomhet for kutan HPV-infeksjon i hovedsak tilskrives mutasjoner i
TMC6 Hotell og
TMC8
. Genetisk variasjon i
TMC6 /TMC8
regionen har vært knyttet til beta-type HPV-infeksjon og plateepitelkarsinom i huden, livmorhalskreft, HPV utholdenhet og progresjon til livmorhalskreft. Her har vi testet hypotesen om at de vanligste
TMC8
SNP rs7208422 er forbundet med høy risiko HPV infeksjon og risiko for hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC). Seropositive til HPV-L1-protein (HPV16, 18, 11, 31, 33, 35, 45, 52, 58) ble målt i 514 tilfeller og 452 populasjonsbasert kontroller. Genotype var signifikant assosiert med seropositivitet til HPV18 L1 (OR
TT vs AA = 0,48, 95% CI = 0,22 til 0,99) og border signifikant assosiert med HPV16 L1 (OR
TT vs AA = 0,58, 95% KI = 0,22 til 1,17). Det var en konsekvent invers sammenheng mellom
TMC8
genotype og infeksjon med andre HPV-typer, inkludert statistisk signifikante assosiasjoner for HPV31 og HPV52. I samsvar med disse resultatene, ble den varianten T genotype assosiert med en redusert risiko for HNSCC (OR
AT: 0,63, 95% KI 0,45 til 0,89, OR
TT: 0,54, 95% KI 0,36 til 0,81), selv blant individer var seronegative for alle HPV-typer (OR
AT: 0,71, 95% KI 0,45 til 1,11, OR
TT: 0,54, 95% KI 0,31 til 0,93). Våre data tyder på at felles genetisk variasjon i
TMC8
er forbundet med høy risiko HPV infeksjon og HNSCC etiologi
Citation. Liang C, Kelsey KT, McClean MD, Christensen BC, Marsit CJ, Karagas MR, et al. (2015) En Coding Variant i
TMC8 plakater (EVER2) er forbundet med høy risiko HPV infeksjon og Head and Neck Cancer Risk. PLoS ONE 10 (4): e0123716. doi: 10,1371 /journal.pone.0123716
Academic Redaktør: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 13 desember 2013; Godkjent: 06.03.2015; Publisert: 08.04.2015
Copyright: © 2015 Liang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Denne studien ble støttet ved følgende tilskudd: NIH R01CA118443, R01CA078609. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
null mutasjoner i
TMC6 Hotell og
TMC8
konferere ekstrem mottakelighet for infeksjoner med kutan (beta-type) HPV. Disse gener koder for EVER1 og EVER2 som danner en heterodimer som samhandler med sink transportør molekylet ZnT-en for å styre sink nivåer inne i cellen [1]. Den sjeldne syndrom Epidermodysplasia Verrucciformis (EV) er forbundet med mutasjon i en av disse genene, og er kjennetegnet ved et stort antall flate-lignende lesjoner infisert med HPV-beta, hovedsakelig HPV5 og HPV8 virus. Tidligere så vi at genetisk variasjon i
TMC8
var assosiert med seropositivitet til kutan (beta) HPV og økt risiko for plateepitelkreft hudkreft (SCC) [2]. Observasjonene fra EV og hud kreftpasienter tyder på at
TMC6 Hotell og
TMC8
genene kan være viktige faktorer for verten beskyttelse mot papillomavirus. Mens kompleks av EVER proteiner er kjent for å regulere sink homeostase i keratinocytter, har det nylig blitt demonstrert at
TMC6 /8
gener uttrykkes også ved høye nivåer i T-lymfocytter [3,4]. Derfor genetisk variasjon i
TMC6 /8
gener kan påvirke HPV-infeksjon og kreftrisiko, enten direkte ved å modulere HPV-infeksjon i epitelceller, eller indirekte gjennom immun overvåking.
Selv om felles genetisk variasjon i
TMC8
har vært forbundet med beta-HPV-infeksjon, er det også mulig at
TMC8
genetisk variasjon bidrar til høyrisiko HPV infeksjon og tilhørende kreftrisiko (cervical, andre anogenital, og hodet og hals malignitet). Faktisk arbeid av Wang et al [5] med tett genotyping metodikk identifisert en sjelden SNP i
TMC6 Twitter /
TMC8
genet region som blir assosiert med HPV16 utholdenhet. En nyere studie av Castro et al [6], viste at to vanlige SNP’er i TMC6 /TMC8 genet var forbundet med cervical cancer (i fravær av andre HPV-målinger). Enten vanlig variasjon i dette genet regionen overfører mottakelighet for høyrisiko HPV-infeksjon er fortsatt ufullstendig forstått. I tillegg rollen til dette genet i andre HPV-relatert kreft, slik som kreft i munnhule og svelg (rev i [7]), har ikke blitt testet. Her søkte vi å finne ut om de felles SNP rs7208422 i
TMC8
er forbundet med seropositive til høyrisiko HPV-typer og risiko for HNSCC.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Studie protokoller og materialer for rekruttering av saker og kontroller ble godkjent av Institutional Review Boards på ni medisinske fasiliteter og Brown University. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle forsøkspersonene.
forsøkspersonene
Dette populasjonsbasert case-control studie ble utført i Greater Boston, MA mellom desember 1999 og desember 2003 og har tidligere blitt beskrevet [8]. Tilfeller HNSCC pasienter identifisert i hode og nakke klinikker og avdelinger av otolaryngology eller stråling på ni medisinske fasiliteter i studieområdet i løpet av studieperioden. Kvalifiserte tilfeller var beboere i studieområdet i alderen 18 år eller eldre, og med en patologisk bekreftet diagnose på HNSCC ikke mer enn 6 måneder før tiden på pasientkontakt. Pasienter med kreft
in situ
, leppe, spyttkjertel, eller nasooropharyngeal kreft eller tilbakevendende HNSCC ble ekskludert. registret Kreften ble forespurt for å sikre at alle kvalifiserte tilfeller i området ble identifisert. HNSCC tilfeller inkludert diagnosekoder 141-146, 148, 149, og 161 i henhold til International Classification of Disease, niende revisjon (ICD-9). Saker ble ytterligere klassifisert av området til muntlig (ICD-9 koder 143-145), oropharygeal (ICD-9 koder 146, 148, 149), og strupehodet (ICD-9-kode 161) sykdom. Kontrollene ble frekvens-matchet til tilfeller av alder (± 3 år), kjønn, og byen bosted identifisert fra Massachusetts byen bøker gjennom systematisk tilfeldig utvalg. Byen Boken inneholder alle beboerne mer enn 17 år oppført av gate og natteliv. En potensiell kontroll av samme kjønn og alder som tilfellet ble søkt fra denne listen, alternerende søkeretningen gjennom boken starter på saken adresse.
Påvisning av antistoffer ved multiplex serologi
Venøs blod~~POS=TRUNC prøver~~POS=HEADCOMP ble oppnådd fra kasser og kontroller. Serum ble separert innen 12-24 timer fra blodprøvetaking og prøvene ble lagret ved -80 ° C. For å påvise antistoffer mot HPV, ble et glutation S-transferase (GST) fangst enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) som brukes i kombinasjon med fluoriserende vulst teknologi, som beskrevet i detalj tidligere [9,10,11,12]. Kort sagt ble full-lengde virale proteiner smeltet sammen med et N-terminalt domene GST uttrykt i
E
.
coli
bakterier. Glutation tverrbundet til kasein ble koblet til fluorescens-merkede polystyrenkuler (SeroMAP Sfærer, Luminex Corp., Austin, TX) og GST-fusjonsproteiner var
in situ
affinitetsrenset på perlene direkte i en en- trinns prosedyre. Hver fusjonsprotein var bundet til et spektralt tydelig perlesett. Fusjonsproteinbelastede kulesett ble blandet og inkubert med humane sera. Antistoffer bundet til kulene via de virale antigener ble påvist med biotinylert geite-anti-humant IgG (H + L) sekundært antistoff og streptavidin-R-fykoerytrin. En Luminex 100 analysator (Luminex Corp., Austin, TX) ble anvendt for å identifisere den indre fargen av de enkelte perler og for å kvantifisere deres reporter fluorescens (uttrykt som midlere fluorescensintensitet (MFI) på minst 100 perler per sett per serum).
MFI verdier ble dikotomisert som antistoff positive eller negative. En standardisert cut-off for HPV16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 og 58 L1-antistoffer ble definert tidligere, [13] og anvendt her. Seropositive avskjær for HPV16 tidlige proteiner ble bestemt ved hjelp av en lignende algoritme for serumprøver av 117 kvinnelige, HPV DNA negative, selvrapporterte jomfruer fra en tverrsnittsundersøkelse blant koreanske studenter [13]. Den midlere pluss 5 standardavvik ble beregnet, og den resulterende enkelt cut-off ble doblet til strengt skille seropositive og-negative reaksjoner (HPV 16 E6, 484 MFI; HPV 16 E7, 1096 MFI) [14]
TMC8 genotype deteksjon
Vi har samlet data på en (A T) koding SNP i ekson 8, kodon 306 av
TMC8
genet (rs7208422), noe som resulterer i en endring fra asparagin til isoleucin. DNA ble ekstrahert fra buffy coat å bruke Qiagen-genomisk DNA-ekstraksjon kits. Genotyping av
TMC8
polymorfisme ble gjort ved hjelp av Taqman alleliske diskriminering teknikk (Applied Biosystems, Foster City, CA), som tidligere publisert [2]. Kjente genotypen kontroller ble inkludert for hver genotyping analyse. For kvalitetsvurdering, hver tiende prøve var en innebygd duplikat, og det var 100% samstemmighet blant QA genotyper.
Statistisk analyse
Dataanalyse ble begrenset til kaukasiske pasienter med både
TMC8
genotype og HPV serologiske data. For å estimere sammenhengen mellom
TMC8
genotype og HNSCC, vi beregnet odds ratio (ORS) og 95% konfidensintervall (CIS) fra ubetinget logis regresjonsmodeller. Modeller inkluderte studien sams faktorer kjønn og alder, men den tredje matchende parameter, byen du bor i, ble ikke inkludert i disse ubetinget regresjonsmodeller gitt antall byene representert. Risikomodeller ble også justert for røyking (pakke-år) og drikke (gjennomsnittlig drinker per uke). Vi i tillegg utført analysen stratifisert etter svulststedet samt av HPV16 serologi status. For å undersøke sammenhengen mellom
TMC8
genotype og HPV serologiske markører, brukte vi logistisk regresjon med positiv serologi som responsvariabelen og
TMC8
genotype som en uavhengig variabel. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SAS9.1, og alle statistiske testene var tosidig.
Resultater
Blant de 775 forsøkspersoner, 361 var tilfeller med HNSCC (148 munnhule kreft, 148 orofaryngeal kreft, 65 strupehodet kreft) og 414 var kontrollpersoner (tabell 1). Det var ingen signifikante forskjeller i fordelingen av alder og kjønn mellom saker og kontroller (tabell 1). De fleste fag var menn (74%). Sammenlignet med kontroller, HNSCC tilfeller var mer sannsynlig å røyke (P 0,001) og drikke tungt (P 0,001), og hadde en høyere forekomst av seropositive til HPV16 (P 0,0001), HPV18 (p 0,04), HPV11 (p 0,01), HPV35 (p 0,001), HPV52 (p 0,0003) og HPV58 (p. 0,003) (tabell 1)
Vi har evaluert assosiasjonen mellom genotype HPV og serologi (tabell 2); gitt svært lav seroprevalence blant kontrollene (Tabell 1), var det nødvendig å teste denne tilknytningen ved hjelp av data fra alle fag.
TMC8
genotype ble assosiert med HPV18 seropositive (OR
AT: 0,65, 95% KI 0,38 til 1,11, OR
TT: 0,48, 95% KI 0,24 til 0,99), med tilsvarende ikke-signifikant trender observert for HPV16 (OR
AT: 0,91, 95% KI 0,54 til 1,55, OR
TT: 0,58, 95% KI 0,22 til 1,17), HPV31 (OR
AT: 0,60, 95% KI 0,33 -1,09, OR
TT: 0,48, 95% KI 0,22 til 1,04), og HPV52 (OR
AT: 0,25, 95% KI 0,09 til 0,67, OR
TT: 0,36, 95% KI 0.11- 1.13). Vi videre undersøkte sammenhengen mellom genotype og serologi blant orofaryngeal kreft tilfeller; tilsvarende eller er observert, men med statistisk unøyaktighet (data ikke vist).
TMC8
genotype ble også assosiert med en redusert risiko for alle typer HNSCC (tabell 3). Sammenlignet med
TMC8
AA genotype, AT og TT-genotyper ble omvendt assosiert med HNSCC (OR = 0,63; 95% KI: 0,45 til 0,89 og OR = 0,4954; 95% KI: 0,36 til 0,81 henholdsvis). Disse funnene var konsistente på tvers av anatomiske områder av HNSCC (Tabell 3). For å avgjøre om genotypen foreningen var uavhengig av HPV serologi, gjennomførte vi subgruppeanalyse blant deltakere var seronegative for HPV16 så vel som de seronegative for alle testede HPV-typer (tabell 4). I samsvar med tidligere analyser
TMC8
genotype ble omvendt assosiert med HNSCC blant de seronegative for HPV16 (OR
AT = 0,67; 95% KI: 0,45 til 1,03, ELLER
TT = 0,58; 95% KI: 0,34 til 1,00); dette forholdet forble for de negative for alle HPV-typer (OR
AT = 0,713; 95% CI: 0,45 til 1,11, ELLER
TT = 0,54; 95% KI: 0,31 til 0,93). Subgruppeanalyse begrenset til de seropositive var ikke mulig gitt den lave forekomsten av seropositive blant kontroller (tabell 1).
Diskusjoner
I vårt case-control studie av hodet og hals kreft, finner vi bevis for at genetisk variasjon i
TMC8
er omvendt assosiert med seropositive til høyrisiko HPV-typer. Videre
TMC8
variant genotype er omvendt forbundet med risiko for HNSCC, uavhengig av anatomisk sted, og uavhengig av HPV-status.
Vi har tidligere rapportert at denne samme genetiske variasjonen i
TMC8
var positivt assosiert med hud-type HPV-infeksjon [2]. Ved første øyekast disse påfallende forskjellige resultater mellom HPV-typer er overraskende. Men hvis vi ser på de strukturelle forskjellene i alfa- og beta HPV genomer, kommer en modell basert på viral E5 protein. En viktig forskjell mellom kutane (beta) HPV og høy risiko (alpha) typer er tilstedeværelsen av E5 protein. I høyrisiko HPV, E5 protein binder direkte til EVER /ZnT-en kompleks [15]. Som Larzarczyk forklarer, er det aldri /ZnT-1-komplekset et restriksjonspunkt for HPV-infeksjon hvorved endring av dette kompleks (og dens påfølgende feilregulering av sink) som er nødvendig for infeksjon forekommer [1]. Det er sannsynlig at
TMC8
polymorfisme endrer bindingen potensialet i HPV E5 protein til EVER /ZnT-en kompleks, og dette reduserer sannsynligheten for en produktiv HPV-infeksjon. I kontrast, gjør kutane typen HPV ikke stole på E5 for produktiv infeksjon (som kutane HPV genomet er blottet for E5). Gaud et al har vist at
TMC8
polymorfisme endrer evne EVER2 å samhandle med Tradd, og dermed endre apoptose potensiell [16]. Vi hypotese at den felles genetisk variasjon i
TMC8
påvirkninger HPV følsomhet ved to forskjellige mekanismer, avhengig av tilstedeværelsen av fravær av E5 proteinet.
In vitro
eksperimentene vil være nødvendig å få et endelig svar på disse spørsmålene.
Mens EVER2 uttrykk i keratinocytter har fått stor oppmerksomhet, gitt sin rolle i den nedarvede syndromet epidermodysplasia verruciformis, nyere arbeider viser at EVER2 uttrykk i T-lymfocytter overskrider det som finnes i keratinocytter. I T-celler denne høy ekspresjon av EVER2 er hurtig nedregulert på TCR-stimulering, som fører til en økning i intracellulære nivåer Zn. Vi hypotese at
TMC8
polymorfisme modulerer denne biologi, påvirker T-celle overvåkingsfunksjoner og kreftrisiko. Andre epidemiologiske studier av ikke-virale medierte kreft vil hjelpe belyse hvorvidt
TMC8
er en generalisert kreft mottakelighet faktor.
Det er flere begrensninger i dataene i denne studien. Den serologiske endepunktet som brukes er svært spesifikk for en høyrisiko HPV-infeksjon. Det må imidlertid bemerkes at serologi som et endepunkt har begrenset følsomhet, da ikke alle personer montere en serologisk respons med HPV-infeksjon. I sammenheng med vår hypotese angå
TMC8
genotype og mottakelighet for infeksjoner, dette potensialet begrensningen i følsomhet ville forspenn våre resultater til null. En annen begrensning av disse dataene er at serologisk respons vi vurderer er ikke nødvendigvis representative for en infeksjon på svulststedet, men kan i stedet gjenspeiler en høy-risiko infeksjon på et annet sted enn svulsten nettstedet. Men den lave seroprevalence av høyrisiko HPV blant ikke-syke individer (tabell 1) indikerer at dette er trolig ikke et stort feilklassifisering problem. Til slutt, på grunn av denne lave seroprevalens av høyrisiko HPV-typer i vår kontroll befolkningen kan vi ikke teste om
TMC8
genotype er assosiert med infeksjon i ikke-syke individer, og dette vil være viktig å ta i det videre arbeidet.
av interesse, en tidligere studie av livmorhalskreft ved Wang et al, ved hjelp av en GWAS tilnærming, identifisert en sjelden SNP i
TMC6 /8
region som i forbindelse med HPV16 viral utholdenhet (rs9893818, A allel frekvens 2,5%) [5], noe som indikerer at genetisk variasjon utover den felles SNP presentert her, kan være viktig for forståelsen av HPV-infeksjon. En fersk studie av Castro et al [6], rapporterte to ekstra vanlige SNPs i
TMC6 /TMC8
genet var assosiert med livmorhalskreft, men denne studien manglet tiltak på HPV (selv om det ville være implisitt blant tilfeller) . Klart en omfattende evaluering av omfang, karakter og fenotype av variasjon i
TMC6 Twitter /
TMC8
genet regionen vil tjene til mer fullstendig avgrense vår forståelse av genetisk mottakelighet for HPV-infeksjon. Til slutt, gitt vår meget sterke assosiasjoner mellom
TMC8
genotype og HNSCC i de uten tegn til HPV-infeksjon vil det være viktig å finne ut om den
TMC8
genet er en generalisert kreft mottakelighet faktor.
