Abstract
E74-lignende faktor 5 (Elf5) har vært assosiert med tumor undertrykkelse i brystkreft. Imidlertid er dens rolle i urothelial kreft (UC) helt ukjent. Immunhistokjemi (IHC) og metylering spesifikk PCR (MSP) ble gjort for å påvise Elf5 uttrykk nivå og dens promoter metylering. Resultatene viste at lav uttrykk for Elf5 på protein og mRNA nivåer var assosiert med tumorprogresjon, tidlig tilbakefall og dårlig overlevelse. In vitro, kan nedregulering av Elf5 øke epitelial-mesenkymale overgang (EMT). Avvikende Elf5 metylering ble identifisert som viktig mekanisme for Elf5 genet stillhet. Følgelig restaurering av Elf5 av infeksjon eller demethylating behandling effektivt reverseres EMT prosesser. I konklusjonen, identifiserte vi Elf5 som en roman biomarkør av UC på flere biologiske nivåer og etablert en årsakssammenheng mellom Elf5 og EMT i UC
Citation. Wu B, Cao X, Liang X, Zhang X, Zhang W Sun G, et al. (2015) epigenetisk regulering av Elf5 er assosiert med epithelial-Mesenchymale Overgang i uroteliale Cancer. PLoS ONE 10 (1): e0117510. doi: 10,1371 /journal.pone.0117510
Academic Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 1 august 2014; Godkjent: 29 desember 2014; Publisert: 28 januar 2015
Copyright: © 2015 Wu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Våre data er faktisk hentet fra tredjepart (Tianjin Institute of Urology), men de er kun tilgjengelig på forespørsel på grunn av etiske restriksjoner fra The Second Hospital of Tianjin Medical University. Leserne kan kontakte Dongwen Wang ([email protected]) for å be om data
Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
EMT påvirker kritiske trinn av markerte endringer i celle adhesjon, polaritet og vandrende av interconverting epitelceller i celler med mesenchymale /stamcelle (SC) state [1, 2,3]. EMT og dens omvendt program, mesenchymale-epitelial overgang (MET), ble aktivert i tumorceller og denne fremgangen gjør at disse cellene til å erverve cellulære trekk forbundet med høy klasse, invasivitet og tilbakefall [3,4,5]. På grunn av kompleksiteten og dynamikken i EMT, er det umulig å bli opprettholdt ved en enkelt signalveien. TGF-β, Wnt, Notch, Sonic Hedgehog, EGF og FGF trasé har vist seg å være viktig for styrende disse overgangene i kreftutvikling og progresjon [2,3,6,7]. Mer nylig, epigenetiske modifikasjoner så som metylering /demetylering har også blitt vist å være involvert i EMT [8,9,10]. Men signalmekanismer som induserer og opprettholde denne mesenchymale /SC tilstand fortsatt uklart.
Elf5 er medlem av Epitel bestemt undergruppe av den store E-tjueseks (ETS) transkripsjonsfaktor familien. Det har vist seg som en nøkkel transcriptional determinant av brystkreft avstamning ved å undertrykke østrogen følsomhet i luminal celler og øke basal egenskaper i basalbrystkreftceller [11]. Nyere studier viser Elf5 er ikke bare som en nøkkel celle avstamning regulator, men også som en suppressor av EMT ved undertrykke transkripsjon av Snail2 [12]. I tillegg er Elf5 genet Slå utløst av dynamisk promoter hypermethylation i prosesser av menneskelig placenta utvikling og embryonale celle avstamning dannelse [13,14]. Men rollene til Elf5 i urothelial kreft (UC) utvikling og progresjon forblir udefinert.
Blære UC er den sjette vanligste kreftformen i verden med ca 386 000 nye tilfeller i 2008 og estimerte 150.000 dødsfall [15]. Ved første diagnosen UC, nesten 80% av pasientene stede med ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC) mens restene med muskel invasiv sykdommer [16,17]. Av disse pasientene med NMIBC, 50% -70% vil ha minst ett tilbakefall i 5 år, og mer enn 20% vil vise muskler infiltrasjon [18] og føre til en dødelighet på opp til 50% innen 2 år etter diagnose [19] . Problemet forbundet med UC er deres svært uforutsigbar potensial for tilbakefall og progresjon. Derfor ønsket vi å finne ut om epigenetisk inaktivering av Elf5 er forbundet med UC progresjon og tidlig tilbakefall
Materialer og metoder
Etikk uttalelse, Pasienter og Samples
Cohort en.:
En totalt 182 formalinfiksert parafin-embedded blære UC prøver~~POS=HEADCOMP ble innhentet blant 275 pasienter på rad mellom 2004 og 2008 fra patologiavdelinger Tianjin Institute of Urology (tabell 1). 10 moderne formalinfiksert parafin-embedded normal urothelium (NU) ble også oppnådd. Blant de analyserte pasienter, 115 primær blærer UCS gikk transurethral reseksjon av blære tumor (TURBT) (
Cohort 1A
) og de forble 67 pasienter gjennomgikk radikal cystektomi (
Cohort 1B
). Ingen av de primære pasientene mottok noen preoperativ anticancer-behandling. Oppfølging informasjonen ble hentet fra journalene til pasienter som oppfylte studieinklusjonskriteriene. I korte trekk, pasienter presenteres postoperativt hver 3. måned for de første 2 årene etter terapi og halvårlig etterpå. Gjentagelse ble definert som en ny tumor observert i blæren etter TURBT. Tilbakefall overlevelse (RFS) ble beregnet som tiden fra TURBT til dato for gjentakelse. Sykdomsspesifikk overlevelse (DSS) ble beregnet som tiden fra radikal cystektomi til dødsdato fra UC. Gjennomsnittlig oppfølgings var 49,4 måneder (spredning 6-90) og 56,4 måneder (6-106) i
Cohort 1A Hotell og
Cohort 1B
hhv.
Cohort 2:
En serie med 10 NU og 50 UC vev ble hentet fra retrospektiv registrering av Tianjin Institute of Urology. Disse vev ble flash-frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C mellom 2010 og 2013. Det var ingen bekreftet tilbakefall og død i studien.
De patologiske diagnoser og klinikken-patologiske faktorer av to kohorter ble fastsatt på grunnlag av generell retningslinje for primær blærekreft som definert av 2002 TNM klassifisering og 1973 WHO karaktersystem av erfarne patologer. Studien protokollen ble godkjent av etisk komité Second Hospital of Tianjin Medical University, og skriftlig informert samtykke til bruk av prøvene fra hver pasient innrullert ble oppnådd tilsvarende. Alle vevsprøver og medisinske registrere data ble anonymisert før tilgang til og analyse av forskerne.
Cellekultur og behandling
Den menneskelige blære cellelinjer UROtsa, RT112, HT1376, J82 og T24 var opprinnelig erholdt fra ATCC. Cellelinjen EJ var en gave fra Dr. Ruifa Han (Tianjin Medical University, Kina. Han fikk cellelinjen fra ATCC). UROtsa ble dyrket i DMEM (Gibco, Shanghai). HT1376 var dyrket i Eagle er Minimum Essential Medium (EMEM, ATCC). Andre cellelinjer ble holdt i RPMI 1640 (Gibco, Shanghai). Alle dyrkningsmedier ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco, Melbourne) og 1% penicillin /streptomycin. Mycoplasma infeksjon ble jevnlig testet med PlasmoTest
TM (InvivoGen, San Diego, California). Når det er nødvendig, ble cellene behandlet med 5 uM 5-aza-2′-deoksycytidin (5-AZA, Invivogen) i henhold til på forhånd bestemt konsentrasjon i 6 dager inkubasjon [20,21].
RNA-ekstraksjon og kvantitative RT -PCR
RNA ble isolert ved hjelp av GenElute (Sigma-Aldrich, Shanghai) i henhold til produsentens instruksjoner. Reversert transkripsjon ble utført ved hjelp Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Shanghai). RT-PCR ble utført på en BioRad iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories) PCR maskin (Applied Biosystems) med SYBR Grønn Master Mix. De genspesifikke primersett ble anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 0,2 uM og deres sekvenser er listet i tabell S1. Hver prøve ble kjørt og analysert i tre eksemplarer.
Bisulfite-modifikasjon og MSP
Genomisk DNA ble hentet fra vevsprøver ved hjelp DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) etter produsentens protokoll. Det ekstraherte DNA ble behandlet med bisulfit for å omdanne unmethylated cytosines til uraciler før metylering-spesifikke polymerase kjedereaksjon (MSP) ved anvendelse av EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) ifølge fremstillingen instruksjon. Modifisert DNA ble forsterket ved hjelp av MSP primere (S1 Table), som spesifikt anerkjente enten unmethylated (produktstørrelse 258 bp) eller denaturert (258 bp) Elf5 promotersekvens etter bisulfitt konvertering. Normal DNA fra menneske vedlegg vermiformis ble behandlet in vitro med SSSI metyltransferase (New England Biolabs, Beverly, MA) for å generere en positiv kontroll for denaturert alleler [22].
IHC farging
parafin- innebygde deler (4 um) ble deparaffinized og hydrert i xylen etterfulgt av gradert alkoholer til vann. Antigen gjenfinning ble utført i 0,01 M citrat for to ganger 10 minutter i en mikrobølgeovn, etterfulgt av en 60-minutters avkjøles. Slides ble deretter inkubert med ulike primære antistoffer etterfulgt av Envision-plus merket polymer-konjugert pepperrot peroksidase og DAB overvåking farging (Zhong Shan gull bro, Beijing). Deretter lysbilder ble kontra og dehydrert for visning og bildebehandling. Antistoffer var:. Anti-Elf5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-E-cadherin (Abcam, Cambridge, MA), anti-N-cadherin (Abcam), anti-vimentin (Abcam)
Scoring av IHC farging
Elf5 poengsum: hele avsnittet ble evaluert av to respektive observatører å være uvitende om de kliniske data. Tumorcellene ble bestemt positiv når en klart synlig farging ble påvist i kjernen. NU vev ble tatt for å være som interne kontroller. Prosent av farging positiv celle ble gradert som 1% til 100% med en 5% intervall. Telles prosentene ble avrundet til nærmeste tannhjul. En cut-off verdi på 10% ble bestemt vilkårlig, og i henhold til denne verdien, to grupper (lav og høy Elf5 flekker) ble tildelt
vimentin og E-cadherin poengsum. Fem tilfeldige lav forstørrelse felt ble valgt da andelen av positive region ble bestemt ved ImageJ program. Cut-off-verdier ble bestemt av medianen, ifølge som to grupper (lav og høy uttrykk) ble tildelt.
Molekylær kloning og virusinfeksjon
Plex plasmider (Åpne Biosystems) som inneholder utfyllende DNA-er for kontroll GFP og Elf5 ble samlet ved rutine molekylære kloningsteknikker. HA-merket WT Elf5 cDNA ble subklonet fra pCMV-HA vektor til Plex plasmider ved hjelp BamH1-Not1 restriksjonsenzymer. Lentivirus produksjon ble utført i det vesentlige som tidligere beskrevet [23]. Virusinfiserte celler ble valgt med puromycin.
siRNA knockdown
For knockdown eksperimenter, siRNA rettet mot Elf5 genet (5′-AGCCCTGAGATACTACTATAA-3 «, katalognummer GS2001) og siRNA negativ kontroll ble kjøpt fra Qiagen. Deretter transfections ble utført ved bruk av Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).
Immunoblotting
Protein ble ekstrahert med RIPA lysebuffer. Protein lysatene ble løst på 10% Bis-Tris Gel, overført til PVDF membraner, probet med HRP-koblede sekundære antistoffer (GE Healthcare), og visualisert med ECL-reagens (Thermo Scientific). Antistoffer var: anti-Elf5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-E-cadherin (Abcam, Cambridge, MA), anti-N-cadherin (Abcam), anti-vimentin (Abcam), anti-Snail ( Cell Signaling Technology, Beverly, MA), anti-ZEB1 (Abcam).
Celleviabilitet assay
indikerte celler ble sådd i 24-brønns plater ved en densitet på 5000 per brønn i medium som inneholdt 10% FBS. På det angitte tidspunkt ble mediet fjernet og serumfritt medium inneholdende 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT; 0,5 mg /ml; Sigma) ble deretter tilsatt til hvert godt. Fire timer etter inkubering ved 37 ° C, ble celle formazanfremstilling produkt oppløses med sur isopropanol, og absorbansen ved 570 nm ble målt ved spektrofotometri (Beckman Du640B). Seks replikere brønner ble anvendt for hver prøve ved hvert tidspunkt.
migrering assays
tjuefem tusen celler ble sådd inn i 24-brønn cellekultur innsatser med 8 mm porer (BD Falcon). Etter 24-48 timer ble cellene på den øvre overflate av filtrene fjernes med en bomullsdott. For visualisering, ble cellene på nedre filterflater fiksert og farget med toluidin blå. Hele felt av filteret ble talt opp. Data er presentert som migrerte celler per felt
Sphere assay
Analyser ble utført som tidligere beskrevet med modifikasjoner [24].: 1000 celler /brønn ble sådd ut i 6-brønns ultra-lav vedheft plater (Costar) i MEGM medium inneholdende 10% serum erstatning (KnockOut) supplementert med 1 x MEM ikke-essensiell aminosyre (Gibco), 20 ng /ml EGF (R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Elf5 mRNA uttrykk er redusert i human blære urothelial kreft
Relative Elf5 nivåer i svulstvev fra 50 UC-pasienter ble bestemt ved QRT-PCR som spenner over 90 bp, normalisert ved GAPDH, og ble sammenlignet med den midlere av 10 normale vev kontrollprøver (fig. 1a). Relativ Elf5 ekspresjon i normalt vev var variabel innenfor et område på 0,39 til 10,56-fold median nivåer. Tumorprøver viste en reduksjon i Elf5 nivåene innenfor et område på 0,03 til 2,02 ganger sammenlignet med den samme kontroll som normalt vev, med en median på 0,40 ganger lavere ekspresjon (Fig. 1a). For å avgjøre om Elf5 nivå viste noen signifikant forskjell mellom ulike kreft etapper, ble ganger endring i Elf5 uttrykk beregnes. Intermediate reduksjon av Elf5 mRNA ble påvist i NMIBC og lav risiko UC, mens svært betydelig tap av Elf5 mRNA uttrykk ble observert i invasiv (pT2-4,
P
. 0,01, fig 1b) og høy risiko UC (Høy klasse PTA, CIS og invasiv UC,
P
. 0,01, fig 1c), sammenlignet med henholdsvis NMIBC og lav risiko UC (lav karakter PTA),. Basert på disse resultatene, redusert Elf5 uttrykk synes å være en viktig begivenhet i UC utvikling og progresjon.
a, er Elf5 mRNA uttrykk undersøkt i 50 UC og 10 prøver NU vev av Real-time PCR. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). b og c, Boksplott viser signifikant nedregulert Elf5 mRNA i både invasive (pT2-4) og høyrisiko UCS (Hg-r). Horisontale linjer: gruppert medianverdier. Bokser: 25-75% kvartiler. Vertikale linjer: minimum og maksimum; NS: ikke signifikant, *
P
0,05, **
P
0,01. Lav risiko UC (Lw-r): lav karakter PTA; Hg-r UC: Høy klasse PTA, CIS og invasiv UC. Resultatene som vises er fra to eller tre uavhengige eksperimenter.
Elf5 protein er redusert i urothelial Kreft og forbundet med tumorprogresjon
Deretter analyserer immunhistokjemi av menneskelige NU og UC prøvene ble utført å verifisere om Elf5 uttrykk redusert i UC på proteinnivå. IHC-farging ble kvantifisert ved å telle andel av positiv-farget kjernen. I tråd med mRNA-data, fant vi Elf5 protein ble farget i de fleste normale uroteliale epitelceller (Fig. 2a). I kontrast, ble Elf5 uttrykk fremtredende redusert i UC vev (fig. 2b) og nesten helt borte i invasive svulster (Fig. 2c). Deretter ble Elf5 uttrykket kvantifisert i henhold til tumorstadier. Sterk Elf5 farging ble påvist i NU prøver med et gjennomsnitt på 34,10 ± 10,21 positiv rate, mens moderat og svak Elf5 farging ble observert i PTA (19,36 ± 1,77,
P
0,05) og invasive UCS (11,03 ± 2.56,
P
. 0,01, figur 2d), henholdsvis. Dette antydet at Elf5 lyddemping kan bidra til UC invasivitet. Vi evaluerte videre den prognostiske verdien av Elf5 i to kliniske databaser (
Cohort 1A og Cohort 1B
) av UC ved univariate Kaplan-Meier analyse. Cohort 1A var sammensatt av pasient med NMIBC, som fikk behandling av TURBT. Pasienter fra denne gruppen er sjelden konfrontert med døden, men alltid sykdommen tilbakefall, så RFS ble brukt. Vi fant at pasienter med høyt Elf5 uttrykk har en tendens til å ha bedre RFS (HR = 0,34,
P
= 0,001, fig. 2e). I motsetning til pasienter fra kohort 1B tendens til å bli konfrontert med døden, slik at DSS ble valgt. Resultatet viste også signifikant trend mot gunstig prognose for Elf5 høye pasienter (HR = 0,49,
P
= 0,04, Fig. 2f). I tillegg stilles ble resultatene basert på cut-offs av 5% og 15% også gjennomført (S1 fig.). De samme trender med lignende resultater ble oppnådd, selv om en ikke-signifikant høyere DSS ble detektert i pasienter med Elf5 uttrykk mer enn 15%. Totalt sett, våre kliniske data støtter den antatte rolle som Elf5 kan fungere for å motsette blærekreft progresjon.
a, representant sterk Elf5 IHC flekker i epitelceller NU (85%). Skala barer, 100mm. b, representant moderat Elf5 flekker i ikke-invasive PTA svulster (30%). c, representant svake flekker i invasiv NU (mindre enn 5%). d, viser Box plot Elf5 IHC flekker i NU (n = 10), PTA-1 (n = 146) og invasive UCS (n = 36). Horisontale linjer: gruppert medianverdier. Bokser: 25-75% kvartiler. Vertikale linjer: minimum og maksimum; *
P
0,05, **
P
0,01. e, Kaplan-Meier-kurver av tilbakefall overlevelse (RFS) i henhold til Elf5 flekker nivå i grunnskolen NMIBC behandlet av TURBT. f, Kaplan-Meier-kurver av sykdomsspesifikk overlevelse (DSS) i henhold til Elf5 flekker nivå i UC pasienter etter radikal cystektomi.
Elf5 knockdown i epitel-lignende HT1376 celler induserer EMT
Tidligere bevis har vist en mekanisme for å inhibere Elf5 EMT i brystkreft [12]. For å undersøke om Elf5 kan også regulerer EMT i sammenheng med UC, testet vi Elf5 ekspresjonsmønstre i et panel av urothelial cellelinjer. Betydelig lavt nivå av Elf5 ble lagt merke til i cellelinjer som kjennetegnes av mesenchymale markører (EJ og T24), mesenchymale-lignende celler, noe som tyder på en potensiell inhiberende rolle Elf5 i EMT (fig. 3a). I epitel-lignende UROtsa, RT112 og HT1376-celler (identifisert med høy ekspresjon av epitel-markører), ble høye nivå av ekspresjon Elf5 påvist (fig. 3a). For å teste den mulige sammenhengen mellom Elf5 og EMT, short inter RNA (siRNAs) ble brukt til å slå ned Elf5 i epitel-lignende HT1376 celler. I motsetning til de epiteliale øya dannende, foreldrecellene, siRNA-behandlede celler besto av front-to-back polariserte, enkeltceller (Fig. 3b). I likhet med tidligere rapporterte EMT-celler [6,12], siRNA-behandlede celler uttrykt reduksjon av E-cadherin og økning av N-cadherin, vimentin, så vel som EMT fremmende transkripsjonsfaktorer (f.eks. Sneglen og ZEB1) (fig. 3c) .
a, er Elf5 og EMT markører oppdaget av Western blot analyse i uroteliale cellelinjer. b, Bright-fase mikros: T24 celler transduced med vektor eller HA-Elf5 og HT1376 celler behandlet med kontroll eller Elf5 siRNA. c, analyser Western blot av Elf5 og EMT markører i T24 celler transduced med vektor eller HA-Elf5 og HT1376 celler behandlet med kontroll eller Elf5 siRNA. d og e, Sphere analysen (n = 6) og migrasjon analysen (n = 3): lyse-fase mikroskopi bilder og kvantifisering av foreldre T24, T24-vektor, T24-Elf5, og foreldre HT1376 samt kontroll og Elf5-siRNA behandlede HT1376 celler. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM, **
P
0.01.f og g, ble cellelevedyktigheten bestemt ved anvendelse av MTT-analysen. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM. Det ble utført seks duplikate brønner for hver prøve ved hvert tidspunkt.
sfære assay måler forankrings-uavhengig proliferasjon ved klonal tetthet in vitro har vært forbundet med nærværet av epiteliale-mesenchymale tilstand [6]. Vi har derfor undersøkt kule dannende evner HT1376 celler til å måle sin status av EMT. I forhold til foreldre og kontroll siRNA (siRNA Ctrl) celler, stanse av Elf5 var tre ganger beriket i sfæren dannende celler (Fig. 3d). For å teste en annen funksjonell kjennetegn på mesenchymale staten, gjennomførte vi in vitro invasive tester. Elf5-knockdown-celler var mer invasive (18-ganger sammenlignet med foreldre og kontrollcellene, fig. 3e). Videre celleviabilitet analyser av MTT bekreftet at virkningen av Elf5 stillhet på sfære-dannende evne og invasivitet ikke er en følge av øket celletall (fig. 3f og 3g). Sammen våre observasjoner tyder på at Elf5 er en hemmer av EMT i UC celler.
Elf5 fremmer MET i mesenkymale-liknende T24 celler
I mellomtiden, forholdet mellom Elf5 og EMT ble bekreftet av stabil overekspresjon av Elf5 i mesenkymale lignende T24-celler, som ikke uttrykker detekterbar endogene Elf5 (fig. 3a). Vi fant Elf5 overekspresjon effektivt økt dannelse av epitel øya i T24 celler (fig. 3b). I tillegg vil redusert Elf5 overekspresjon ekspresjonsnivået av flere mesenchymale cellemarkører, slik som N-cadherin og vimentin, og økt ekspresjon av E-cadherin (fig. 3c). Videre reduserte EMT-relaterte transkripsjonsfaktorer ble også påvist i Elf5-overuttrykt T24-celler (Fig. 3c). Funksjonelt, ble 5-fold sfæren dannende evner og fire ganger invasivitet redusert etter stabil håndheves-uttrykk for Elf5 i T24 celler sammenligne med tomt plasmid gruppe (Fig. 3d og 3e). Elf5-indusert MET ble ytterligere bekreftet i PC3-celler, en mesenchymale lignende prostatakreft-cellelinje med kraftig invasivitet (data ikke vist). Kollektivt, våre observasjoner tyder på at Elf5 er en håndhever av MET i UC celler.
Elf5 er forbundet med E-cadherin og vimentin uttrykk i menneskelig UC
For å bekrefte in vitro finne at Elf5 er en hemmer av EMT og en håndhever av MET i UC celler, vi analysert uttrykket nivåer av Elf5, E-cadherin og vimentin av IHC i
Kohort 1
pasientprøver (fig. 4a). Lav uttrykk for Elf5 (f.eks tilfellet 2) er oppdaget i 56,6% (103 av 182) av prøvene og betydelig forbundet med lav E-cadherin uttrykk (
P
0,05) og høy vimentin uttrykk (
P
0,05, figur 4b).. Disse dataene antyder at Elf5 er omvendt assosiert med mesenchymale fenotype hos pasienter med UC.
a og b, IHC farging av E-cadherin og vimentin i representative tilfeller med høy (case 1) og lav Elf5 uttrykk prøven ( case 2). Skala barer, 100mm. b, korrelasjonsanalyse av Elf5 og EMT markører E-cadherin /vimentin.
Elf5 arrangøren hypermethylation omvendt korrelerer med Elf5 mRNA uttrykk i menneskelig UC
Etter tapet uttrykk for Elf5 i menneskelig UC vev er anerkjent, vi videre gå til søket mulige årsaker. Fersk undersøkelse har vist at morkake Elf5 uttrykk er nedregulert med svangerskapslengde øker, og epigenetisk regulering ble vist seg å være som «gatekeeper» [13]. Vi testet om aktiviteten staten Elf5 i menneskelig UC er også epigenetiske kontrollert av sitt DNA metylering. Det første vi utviklet primere for MSP bruker MethPrimer [25]. MSP for sekvens av Elf5 promoter mellom -1000 bp og transkripsjon start stedet viste bare en metylering i 10 NU prøver (1/10, Fig. 5a). Deretter vi analyserte metylering status av Elf5 promoter i blærecancerprøver (
kohort 2
, n = 50) (fig. 5a), og fant en metylering frekvens på 72% (36/50). For å avgjøre om Elf5 promoter metylering bidrar til Elf5 uttrykk tap i UC, korrelert vi metylering og mRNA uttrykk nivå hos pasienter fra
Cohort 2
. Som i fig. 1a, 10 NU vev tjente som kontroll og deres median uttrykk hastighet ble satt til absolutt verdi 1,0. Sammenlignet med disse NU vev, unmethylated UC viste en nesten lik Elf5 uttrykk uten å ta hensyn tumorstadium eller Karakter (median: 0,80,
P
= 0,08, figur 5b.). I motsetning til dette, denaturert tumorvev viste et betydelig tap av Elf5 mRNA-ekspresjon (median: 0,33,
P
0,01, figur 5b.). Denne sammenhengen mellom tap av Elf5 mRNA uttrykk og Elf5 promoter metylering antyder avvik Elf5 metylering ser ut til å være en viktig mekanisme for Elf5 genet Slå i UC.
a, representant MSP resultatene av Elf5 promoter metylering i NU, PTA og invasive vevsprøver UC, så vel som i negative og positive kontroller. U og M representerer unmethylated og denaturert DNA. Bisulfitt-konvertert unmethylated genomisk er polymethylated genomisk DNA og ikke-mal brukt som kontroller. b, er Elf5 mRNA uttrykk av Real-time PCR undersøkt i henhold til Elf5 arrangøren metylering status i 10 NU og 50 prøver UC vev. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. c viser Box plot tap av Elf5 mRNA uttrykk hos pasienter med denaturert Elf5 promoter. Horisontale linjer: gruppert medianverdier. Bokser: 25-75% kvartiler. Vertikale linjer: minimum og maksimum. **
P
0.01.
Målrette promoter metylering fører til Elf5 uttrykk i UC cellelinjer
Arrangøren metylering stater i menneskeblærekreftcellelinjer ble analysert ved hjelp av MSP. De mesenchymale-lignende UC cellelinjer T24 og EJ avdekket en hypermethylation i sine promoter regioner, mens hypometylering ble påvist i lav-invasive HT1376 celler (Fig. 6a). Vi målte nivå av Elf5 mRNA-ekspresjon ved hjelp av RT-PCR-analyse. Gjør du det avdekket høyere Elf5 mRNA uttrykk i hypomethylated cellelinjer (Fig. 6b). Å bekreftet forholdet mellom arrangøren metylering status og Elf5 uttrykk, behandlet vi disse UC cellelinjer HT1376, J82, EJ og T24 med 5 pm demethylating agenten 5-AZA. Elf5 mRNA uttrykk ble betydelig restaurert etter 5-AZA behandling bortsett fra at det var i hypomethylated HT1376 (Fig. 6b). I tillegg ble Elf5 protein uttrykk også reverseres ved demetylering i T24 og EJ-cellelinjer (Fig. 6c og 6d).
a, Representative MSP resultater illustrerer Elf5 promoteren metylering status av urothelial cellelinjer. b, Kvantitativ RT-PCR-analyse uttrykk for Elf5 mRNA i foreldre UC cellelinjer og 5-AZA-behandlet HT1376, J82, EJ og T24. NS: ikke signifikant, *
P
0,05, **
P
0,01. c og d, Western blot analyser av Elf5 og EMT markører i EJ og T24 celler behandlet med eller uten 5-AZA. e og f, migrasjon analyse: kvantifisering av T24, så vel som EJ behandles med eller uten 5-AZA, n = 3 g og h, Sphere analyse: kvantifisering, n = 6. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM, **
P
0.01.
For å finne ut om den nylig uttrykte Elf5 protein er funksjonell, EMT stakere og EMT-relaterte transkripsjonsfaktorer ble analysert ved immunoblotting samt invasjon og sfære formasjonstester. Vi har funnet epitelcelle men da økes og mesenkymale cellemarkører ble redusert etter 5-AZA behandling i to mesenkymale lignende UC-cellelinjer (Fig. 6c og 6d). Etter 6 dagers forbehandling, 5-AZA redusert 2,4 ganger og 2,7 ganger invasivitet i T24 og EJ celler, henholdsvis (fig. 6e og 6f). For sfære formasjon, 5-aza henholdsvis innført 3,2 ganger og 4,7-ganger reduksjon i T24 og EJ-celler (fig. 6g og 6h). Det er rimelig å konkludere med at arrangøren hypermethylation bidrar til tap av Elf5 uttrykk i UC cellelinjer.
Diskusjoner
Tre viktige observasjoner ble registrert i denne studien. Først er Elf5 en prognostisk faktor hos pasienter med UC. Vi viste at Elf5 uttrykket er negativt korrelert med tumor grad og stadium. Den tidlige tilbakefall og sykdomsspesifikke død ble også observert hos pasienter med lav uttrykk for Elf5.
In vitro
, lav Elf5 uttrykk er forbundet med høy invasivitet, som kan være effektivt redusert med over-uttrykke Elf5 med vilje. Andre resultater fra IHC farging av UC prøver viste en negativ sammenheng mellom transkripsjonsfaktor Elf5 og EMT, noe som er avgjørende for å opprettholde cellulære trekk forbundet med høy klasse, invasivitet og gjentakelse. Videre ble denne observasjonen demonstrert i cellelinjer ved kunstig regulering av Elf5 uttrykk. For det tredje er det Elf5 genet hypermethylated i kreftceller, slik at utvidelse av mesenchymale kammeret og påfølgende SC’er induseres og opprettholdes.
I motsetning til mus, havner det humane genet Elf5 fire typer av transkript-varianter med to alternative transkripsjon start -områder, ett som identifiserer med ortologe startsete av muse-genet, og gir opphav til Elf5-2b isoform, mens den andre er dekket i intron av Elf5-2b frembringer en lengre variant Elf5-2a. En annen avskrift variant er spleiset isoform av Elf5-2b med ets konsensus motiv beholdt mangler av koding eksoner 3 og 4 (SAM /Pointed domene), en utbredt domene i signale og nukleære proteiner [13]. I nyere studie ble Elf5-2b variant kjennetegnes som en viktig form for Elf5 uttrykt i mennesker, så denne isoformen ble valgt i vårt studium, så vel som i et annet papir, der Elf5 ble vist å være en inhibitor av EMT i brystkreft [12].
Flere studier har vist at epigenetisk regulering av Elf5 genet er en avstamning gatekeeper mellom embryonale og trophoblast avstamning avdelinger, samt mellom basal og luminal epitelceller [14,26]. Her viser vi at DNA metylering fungerer som en barriere av EMT i UC celler. Den Elf5 promoter er CpG rik, men ikke tilfredsstiller kriteriene for en CpG island (https://cpgislands.usc.edu). Detaljert karakterisering av Elf5 promoteren metylering profil ved bisulfitt-sekvensanalyse avslørte at det store flertall av CpG-rester i 1-kb oppstrøms region ble metylert i celler med tap av Elf5 uttrykk [14,26]. Så ble primere kresne sekvens innenfor dette området utformet i denne studien. I ytterligere dataanalyse, fant vi at tapet av Elf5 uttrykk ikke bare var begrenset til pasienter med hypermethylation i Elf5 genet promoter. Det er tydelig fra de data som promotor metylering ikke er den eneste bestemmende faktor for Elf5 ekspresjon i UC-celler. Tidligere studier har vist hormon som et effektivt stimuli som kan indusere Elf5 uttrykk i luminal epitelceller, selv om mekanismene bak disse effektene er fortsatt ikke klarlagt [27,28]. I tillegg kan enkelte transkripsjon repressorer som østrogenreseptor (ER) undertrykke Elf5 ekspresjon i fravær av promoteren metylering, fordi vi har funnet at Elf5 er dominant uttrykt i ER negative luminale epitel-celler [29], og en potensiell DNA bindingssete for ER har blitt identifisert nær Elf5 genet [30].
Klinisk plagsom problem i forhold til NMIBC er uforutsigbarheten tilbakefall og progresjon i en muskel invasiv sykdom, så det er nødvendig å se etter effektive prognostiske biomarkører for pasienter ved høy risiko.
