Abstract
Bakgrunn
Den aktuelle studien ble gjennomført for å karakterisere effekten av anti-metabolitter på indusere CXCL8 alarm og avgjøre om det konstituerende og /eller legemiddelindusert CXCL8 signalisering i metastatisk prostatakreft kreft (CAP) celler modulerer deres følsomhet for denne klassen av agent.
Metoder
responsen metastatiske Cap celler til 5-Fluorouracil (5-FU), ble Pemetrexed eller Tomudex bestemmes ved hjelp av mobiltelefon telle analyser, flowcytometri og PARP cleavage analyse. Kvantitativ-PCR, ELISA og immunoblot ble ansatt for å fastslå effekten av narkotika eller CXCL8 administrasjon på target gen /protein uttrykk.
Resultater
Administrasjon av 5-FU, men ikke pemetrexed forsterkes CXCL8 sekresjon og økt CXCR1 og CXCR2 genuttrykk i metastatiske PC3 celler. I samsvar med dette, inhibering av CXCL8 signalering ved hjelp av en CXCR2-antagonist, AZ10397767, øket cytotoksisiteten av 5-FU med 4 ganger (P 0,001), og økt 5-FU-indusert apoptose i PC3-celler (P 0,01). I motsetning til dette, mens administrasjon av AZ10397767 hadde ingen effekt på følsomheten av pemetreksed, den CXCR2 antagonist som utøves størst effekt i å øke følsomheten av PC3-celler til Tomudex, en rettet tymidylatsyntase (TS) inhibitor. Senere forsøk bekreftet at administrering av rekombinant humant CXCL8 økt TS uttrykk, en respons mediert delvis av den CXCR2 reseptoren. Videre siRNA-mediert knockdown av CXCL8-målet genet Bcl-2 økte følsomheten PC3 celler til 5-FU.
Konklusjoner
CXCL8 signalering gir en selektiv motstand av metastatisk prostata kreft celler til spesifikke anti-metabolitter ved å fremme en target-forbundet motstand, i tillegg til å underbygge en unndragelse av behandling-indusert apoptose
Citation. Wilson C, Maxwell PJ, Longley DB, Wilson RH, Johnston PG, Waugh DJJ (2012) Constitutive og behandling-Induced CXCL8-Signale selektivt modulerer Effekt av anti-metabolitter Therapeutics i metastatisk prostatakreft. PLoS ONE 7 (5): e36545. doi: 10,1371 /journal.pone.0036545
Redaktør: Kin Mang Lau, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 20 desember 2011; Godkjent: 10 april 2012; Publisert: 09.05.2012
Copyright: © 2012 Wilson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forsknings var støttet av en ubegrenset forskningsstipend fra Ulster Cancer Foundation (DJJW og PGJ) og en PhD stipend award (CW) fra Institutt for sysselsetting og læring, Nord-Irland. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Behandling av avansert kastrering resistent prostatakreft (CRPC) er fortsatt en betydelig klinisk udekket behov. Den nylige godkjenning av abiraterone-acetat som et andrelinjebehandling i CRPC er et stort fremskritt, men denne agenten som retter seg mot androgen synteseveien har bare et begrenset forbedring i total overlevelse og bare pasienter med god allmenntilstand dra nytte av den bestemmelsen [1], [2]. Mange pasienter vil ikke møte fortrinnsrett funksjonstilstand som er optimal for respons på abiraterone. Videre vil mange tumorer være motstandsdyktig mot abirateron i andre linjebehandling. Derfor mandater dette at arbeidet med å utvide arsenalet av agenter tilgjengelig for klinikere som behandler CRPC er ikke avslappet. Slike forsøk bør ikke være begrenset utelukkende til oppdagelsen av nye midler, men bør utnytte vår videre kjennskap til sykdommen biologi for å definere resistensmekanismer og identifisere nye midler som kan utnyttes for å forbedre effektiviteten av eksisterende kjemoterapeutiske midler.
konvensjonell kjemoterapi har vært stort sett ineffektive ved behandling av CRPC; docetaxel forblir den eneste kjemoterapimiddel for å ha fått godkjennelse for CRPC, på basis av en begrenset forbedring i total overlevelse [3]. Den anti-metabolitten 5-FU har vært en bærebjelke i solid svulst kjemoterapi i over fem tiår; ved å skrive inn i cellen, er 5-FU konvertert til tre aktive metabolitter, fluorouridin trifosfat (FUTP), flurodeoxyuridine trifosfat (FdUTP) og flurodeoxyuridine monofosfat (FdUMP), som er mis-innlemmet i RNA, fremme DNA-skade, eller bidra til hemming av enzymet tymidylatsyntase, henholdsvis [4]. Siste fase II-studier av 5-FU og dens oral analog kapecitabin har vist seg å være trygg i andrelinjebehandling ved metastatisk CRPC, med beskjedne responser observert når det gis i kombinasjon med docetaxel eller oksaliplatin [5], [6]. Selv om disse tydelig forbli sub-optimale responser, kapasitet til å målrette raskt prolifererende celler hetten ved å indusere et S-fase blokk og deretter apoptose-induksjon forblir en attraktiv terapeutisk situasjon, spesielt i tumorer som er blitt motstandsdyktige overfor anti-androgen behandling.
prostata kreft celler er underlagt en uttalt autokrint CXCL8 signale stimulus, som øker med stadium av sykdommen og er maksimal i kastrering-resistent sykdom [7], [8]. Størrelsen av CXCL8 signalering forsterkes av miljøfaktorer slik som hypoksi [9] og kjemisk-induserte påkjenninger, inkludert eksponering til kjemoterapi [10], [11], som samtidig regulerer ekspresjonen av liganden og reseptorene gjennom hvilke det medierer dens biologiske effekter, dvs. CXCR1 og CXCR2. CXCL8 fremmer progresjon til kastrering-motstand ved ligand-uavhengig aktivering av androgenreseptoren (AR) [12], [13] og induserer proliferasjon av metastatiske prostatakreftceller [7], [14] (). Videre har vi vist at stress-indusert CXCL8 signale svekker følsomheten av prostata kreftceller til å gjennomgå apoptose i respons til DNA-skadende midler [9], [10], HSP90-rettede inhibitorer [15], død reseptor agonister (TRAIL) [11] og AR-målrettet terapi som bicalutimide (Casodex) [13].
Formålet med denne studien var å finne ut hvordan egenverdi og /eller behandling-indusert CXCL8 signale modulerer responsen CRPC celler til anti -metabolites.
Materialer og metoder
Kjemisk og reagenser
Alle kjemikalier var kilde fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri) med mindre annet er oppgitt. 5-FU ble hentet fra Bridgewater Kjemoterapi Suite, Belfast City Hospital. Pemetrexed var en slags gave fra Dr Dean Fennell (CCRCB, QUB, Belfast, UK). AZ10397767 ble vennlig levert av Dr. Simon T. Barry og Dr. David Blakey (Astrazeneca, Alderley Park, Cheshire, UK).
Cell Kultur
PC3 prostata kreft celler ble dyrket som tidligere beskrevet [10]. I etterfølgende eksperimenter som undersøkte CXCL8-signalisering, ble PC3-celler inkubert i serumfritt RMPI 1640-medium i 16 timer før eksponering til 3 nM rekombinant human (RH) -CXCL8 (Peprotech, London, UK).
Cytotoksiske midler
5-FU og pemetrexed ble lagret ved 4 ° C i 10 mM stamløsninger. Serielle fortynninger ble laget opp i sterilt injeksjonsvann og legemidler ble tilsatt direkte til cellene for å gi den ønskede konsentrasjon av det cytotoksiske middel. I tilfelle av 5-FU behandling ble cellene holdt og behandlet i medium inneholdende dialysert FCS.
siRNA trans
siRNA transfeksjoner ble utført som tidligere beskrevet [11]. Celler (5 x 10
5) ble vasket to ganger i steril PBS og deretter inkubert med en transfeksjon blanding omfattende OptiMem medium, oligofectamine (Invitrogen, Paisley, UK), og den spesifikke oligonukleotid (Bcl-2 200 nM; Dharmacon Inc) i 48 timer ved 37 ° C. En ikke-targeting sekvensen ble inkludert i disse eksperimentene i samme konsentrasjon som siRNA sekvens brukes.
Cell Count Analysis
Cells (1 × 10
5 celler /brønn) ble tillatt å følge over natten. Mediet ble erstattet med friskt RPMI 1640 medium og behandlet med en rekke konsentrasjoner av 5-FU eller pemetrexed i fravær eller nærvær av AZ10397767 (20 nM). Celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære i 72 timer, deretter trypsinert og telt ved bruk av en COULTER® Z
TM Series partikkelantall og størrelse analysator (Beckman Coulter, Miami, FL) som tidligere beskrevet [10]. Celleantall ble normalisert til kontrollverdier og statistisk analyse av data utføres ved hjelp av GraphPad PRISM 3,0 programvare.
Flow Cytometry
Cell-syklusanalyse ble evaluert ved propidiumjodidfarging av celler som tidligere beskrevet [ ,,,0],10].
Immunoblotting
Hele cellelysater ble forberedt, løst og utslettet som beskrevet tidligere [7]. Membranene ble vasket i Tris-bufret saltvann /0,1% Tween-20 (TBS-T) og deretter blokkert i 1 time ved romtemperatur i 5% bovint serumalbumin /TBS-T (BSA /TBS-T). Membraner ble probet med primære antistoffer mot BCL2 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), TS (Rockland immunochemicals Inc., Gilberts, PA) eller PARP (eBiosciences Inc., San Diego, CA, USA). Membranene ble vasket tre ganger i TBS-T, og deretter inkubert med et pepperrot-peroksydase (HRP) -merket sekundært antistoff (GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK). Etter tre vaskinger i TBS-T bandene ble oppdaget ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL pluss reagenser, Amersham Biosciences). Membraner ble re-analysert med GAPDH antistoff for å sikre lik belastning (Biogenesis, Dorset, UK).
Kvantitativ real time PCR (qPCR)
RNA ble høstet som tidligere beskrevet [9]. For real-time PCR, 1 ug total RNA var oligo (dT) revers transkribert ved hjelp MMLV-RT (Invitrogen, Paisley, UK) i henhold til produsentens instruksjoner. 50 ng cDNA ble blandet med primere (2 Nm), sterilt vann og SYBR Grønn PCR Mastermix (Roche Diagnostics, Sussex, UK). Primersekvensene var som tidligere rapportert [9]. Sanntids PCR ble utført i en 96-brønns plate ved anvendelse av en LC480 lys cycler instrument (Roche Diagnostics). Terskelen syklusen (C
P) ble beregnet for hver reaksjon ved LC480 systemet. Ukjent uttrykk nivåer ble bestemt ved hjelp av relativt standardkurve metode og normalisert mot 18S.
ELISA
Hvor mye skilles CXCL8 påvist i mediet av prostata kreft celler ble bestemt ved hjelp av en ELISA-analyse i henhold til produsentens instruksjoner (Pelikine Compact CXCL8 ELISA kit, Beckman Coulter, High Wycombe, UK) som tidligere beskrevet [9]. Den CXCL8 konsentrasjon i hver prøve ble beregnet ved sammenligning med en standardkurve utviklet fra et lager ampulle med CXCL8.
Resultatene
5-FU potenserer kjemokin signalisering i metastatiske celler Cap
Den PC3-cellelinjen ble opprinnelig isolert fra en beinmetastasering av hetten og derfor anses å være en klinisk relevant modell system for å studere avansert netting [16]. Siden tidligere studier har vist kjemoterapeutiske midler induserer CXCL8 syntese, våre innledende eksperimenter fokusert på å karakterisere virkningene av administrering av anti-metabolitter ved utskillelsen av denne kjemokin. I tillegg til anvendelse av 5-FU, ble våre innledende forsøk også utført ved bruk av pemetreksed, en multi-målrettede antifolat som inhiberer tymidylatsyntase (TS), dihydrofolat reduktase (DHFR), og glycinamid ribonukleotid formyltransferase (GARFT), alle enzymer som er involvert i
de novo
biosyntese av tymidin og purinnukleotider [17]. En spesifikk ELISA ble brukt til å kvantifisere CXCL8 sekresjon fra PC3 celler over en 8 timers tidsforløpet, sammenligne tidskontrollpersoner fra 5-FU-behandlet eller pemetrexed-behandlede celler. Administrering av 5-FU fremmet en betydelig økning i CXCL8 sekresjon fra PC3-celler (P 0,05) (figur 1A). Imidlertid har ikke administrering av pemetrexed hadde ubetydelig effekt på CXCL8 sekresjon (figur 1B). For å bekrefte våre observasjoner, ble forsøkene gjentatt i LNCaP prostatakreft cellelinje; tilsetning av 1 uM 5-FU også økte nivåer av CXCL8 utskilles fra denne cellelinjen (figur 1C).
(A) bar graf som plotter nivået av CXCL8-sekresjon etter behandling av PC3-celler med 1 uM 5- FU. Verdiene som er vist er plottet i forhold til en tids-matchet kontroll og representerer gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter. (B) Som A, med unntagelse av at cellene ble behandlet med 1 pM pemetrexed. Forskjeller i CXCL8 uttrykk mellom tids matchet kontrollgruppe og medikamentbehandlede prøvene ble analysert ved en tosidig t-test; *, P 0,05. (C) Bar kurve som viser nivåene av CXCL8-sekresjon etter behandling av LNCaP-celler med 1 uM 5-FU. Verdiene som er vist er plottet i forhold til en tids-matchet kontroll og representerer gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter.
Effekten av 5-FU og pemetrexed administrasjon ved uttrykk for CXCL8 reseptorene ble også studert ved hjelp av kvantitativ PCR-analyse. Administrasjon av 5-FU hadde uttalt og vedvarende effekter på genekspresjon av både CXCR1 (figur 2A, venstre panel) og CXCR2 (figur 2B, venstre panel), øker transkripsjonsnivåer av faktorer av henholdsvis 8- og 15-fold,. I motsetning til dette administrering av pemetrexed hadde en forbigående og minimal virkning på genekspresjon av enten reseptoren. Ytterligere eksperimenter bekreftet at 5-FU administrasjon også økt CXCR1 og CXCR2 transkripsjonsnivåer i LNCaP celler (Figur 2A /B, høyre panel), men responsen var markert mer selektiv for CXCR2 i denne cellelinjen.
(A ) Søylediagrammets presentere den tidsavhengige endring i CXCR1 transkripsjonsnivåer i PC3-celler (venstre panel) og LNCaP-celler (høyre panel) som påvist ved qPCR-analyse etter behandling med 1 uM 5-FU (svarte søyler) eller 1 uM Pemetreksed (åpen barer – PC3 celler bare). Expression er presentert som en fold-endring i forhold til genuttrykk nivåer påvist i ubehandlede celler. (B) Som A, bortsett fra at dataene viser genekspresjonen nivå detektert for CXCR2. Viste data er gjennomsnitt ± SEM av fire uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikante forskjeller ble bestemt ved hjelp av en Studenter tosidige t-test (*, p 0,05).
Hemming av CXCL8 signale potenserer 5-FU effekt hos pasienter med metastatisk Cap celler
celletall analyser ble brukt for å karakterisere den relative cytotoksisitet av 5-FU eller pemetrexed i PC3 celler og for å avgjøre om legemiddelindusert eller iboende CXCL8 signale påvirket følsomhet for disse midlene. Inhibering av CXCL8 signalering ble utført ved anvendelse av en selektiv CXCR2-reseptor-antagonist, AZ10397767. PC3-celler var kun følsom for 5-FU ved konsentrasjoner som overstiger 1 pM (figur 3A). Tilsetningen av AZ10397767, anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 20 nM for å utøve sin selektivitet for CXCR2-reseptoren øket styrken av 5-FU-indusert cytotoksisitet i PC3-celler. Ikke-lineær regresjonsanalyse av dataene bekreftet at inhiberingen av CXCR2 signaler forbedret potens av 5-FU med 3,8 ganger, noe som øker den beregnede IC
30 verdi fra 4,2 pM til 1,1 pM (n = 4). Videre analyse av dataene fastslått at tilsetningen av AZ10397767 til 5-FU var synergistisk med en beregnet RI verdi på 1,2, mens ANOVA-analyse bekreftet en sterk synergistisk interaksjon mellom 5-FU og AZ10397767 (P 0,0001). Tilsvarende administrering av AZ10397767 øket følsomheten av LNCaP-celler til 5-FU. Undertrykkelse av CXCR2-signalering ikke hadde noen virkning i å øke den maksimale respons av 5-FU terapi i begge cellelinje. I motsetning til dette ble administreringen av CXCR2 antagonist ikke øke styrken eller den maksimale respons av pemetrexed i PC3-celler (figur Tilsetnings S1). Styrken på pemetrexed i disse analysene ble beregnet som 0,27 mikrometer.
(A) Grafer illustrerer celler analysedata, fastsatt etter behandling av PC3 celler (venstre panel) eller LNCaP celler (panel høyre) med økende konsentrasjoner av enten 5-FU, i fravær eller nærvær av CXCR2-reseptor-antagonist, AZ10397767. AZ10397767 ble administrert ved en sluttkonsentrasjon på 20 nM. Celletall ble tatt 72 timer etter behandling med det anti-metabolitt. Legemer data ble analysert ved hjelp av ikke-lineær regresjon funksjon av GraphPad Prism, ved hjelp av en sigmoidal en-site kurvetilpasning ligning. Datapunkter som vises er gjennomsnittet ± SEM Verdien av fire uavhengige eksperimenter. (B) Bar kurve som illustrerer effekten av å bruke siRNA til knockdown CXCR1 og CXCR2 uttrykk på cytotoksisiteten av 1 uM 5-FU i PC3 (venstre panel) og LNCaP-celler (høyre panel). Datapunkter som vises er gjennomsnittet ± SEM Verdien av fire uavhengige eksperimenter. (C) Bar grafen presentere nivået av apoptotiske celler i narkotika-behandlede PC3 (venstre panel) og LNCaP (høyre panel) celle populasjoner. Dataene viser sub G0 /G1-cellepopulasjon bestemt ved strømningscytometri-analyse etter behandling med økende konsentrasjoner av 5-FU, i fravær og nærvær av CXCR2-reseptor-antagonist, AZ10397767.
Som en ytterligere validering av våre resultater oppnådd med CXCR2 antagonist, ansatt vi en siRNA-strategi for å undertrykke reseptor uttrykk. Til tross for bruk av kommersielle sekvenser som utgir seg for å være selektiv for CXCR1 og CXCR2 knockdown, påfølgende RT-PCR-analyse bestemmes betydelig nedregulering av den gjensidige reseptor i PC3 og LNCaP-celler. Uansett, nedregulering av CXCR1 og CXCR2 ekspresjon resulterte i et større tap av PC3 og LNCaP celleviabilitet i nærvær av 1 uM 5-FU (figur 3B).
Strømningscytometri-analyse bekreftet at inhiberingen av CXCR2 signale potenseres 5-FU-indusert apoptose i både PC3 og LNCaP-celler. I forhold til ubehandlede kontrollceller, en økning i konsentrasjonen av 5-FU fra 1 uM til 10 uM resultert i en økt akkumulering av celler i S-fasen av cellesyklusen (Supplementary fig S2), og deteksjon av en økning i prosentandelen av celler i under G0 /G1 fase (figur 3C). Tilsetning av AZ10397767 alene til PC3-celler hadde ingen observert effekt på en hvilken som helst fase av cellesyklusen i 72 timer endepunktet. Men når den kombineres med en uM 5-FU, redusert AZ10397767 akkumulering av cellene arrestert i S-fasen av cellesyklusen mens samtidig å øke nivået av apoptotiske celler observert (p 0,0045). (Supplerende fig S2)
CXCL8 signale fremmer en target-forbundet motstand til 5-FU
tymidylatsyntase (TS) uttrykk er en viktig faktor for 5-FU følsomhet [18], [19]. Den økte følsomheten av celler til 5-FU etter undertrykkelsen av CXCL8 signale bedt oss om å undersøke om CXCL8 signalregulert uttrykket av dette enzymet i Cap celler. PC3-celler og LNCaP-celler ble stimulert med hver 3 nM rekombinant human-CXCL8 (rh-CXCL8) for maksimalt 8 timer. TS genekspresjon ble først analysert ved kvantitativ PCR; som bekreftet en økning på mer enn 4 ganger i begge cellelinjer etter stimulering med rh-CXCL8 (figur 4A). Ekspresjon av TS enzym ble også analysert ved immunblotting. Stimulering med rhCXCL8 i løpet av en kort tid-kurs bekreftet en umiddelbar økning i ekspresjonen av TS i PC3-celler (Figur 4B). Videre, i samsvar med økning i mRNA transkripsjonsnivåer, observerte vi en senere respons på CXCL8 administrering, hvor TS ekspresjonsnivåer ble vist å øke med tiden peker til 8 timer i PC3-celler (figur 4C, venstre panel) og LNCaP-celler (figur 4C, høyre panel).
(A) Søylediagrammets presentere den tidsavhengige endring i TS transkripsjonsnivåer i PC3-celler (venstre panel) og LNCaP-celler (høyre panel) som påvist ved qPCR-analyse etter behandling med 3 nM rhCXCL8. Expression er presentert som en fold-endring i forhold til genuttrykk nivåer påvist i ubehandlede celler. (B) Immunoblot som viser virkningen av administrering av 3 nM rhCXCL8 av nivået av TS-ekspresjon i PC3-celler, påvises inntil en time etter stimulering av cellene. (C) Immunoblot som illustrerer nivået for TS ekspresjon detektert i PC3-celler (venstre panel) og LNCaP-celler (høyre panel) opp til 8 timer etter stimulering av cellene med rhCXCL8. Lik protein lasting i hver av de representative blottene er vist i (B) og (C) ble bekreftet ved å gjen sondering av membraner for å detektere ekspresjon av GAPDH. Statistisk signifikante forskjeller ble bestemt ved hjelp av en Studenter tosidige t-test (***, p 0,001).
Vi neste undersøkt hvordan hemming av CXCR2 signale påvirket TS uttrykk. Tilsetningen av AZ10397767 til PC3-celler svekkes den CXCL8-induserte økning i TS gen-transkripsjonsnivåer (figur 5A) og reduserte CXCL8-promo økning i TS-protein (figur 5B). Gitt sammenslutning av CXCL8 og CXCR2 til regulering av TS uttrykk, undersøkte vi effekten av CXCL8 signale på effekten av Tomudex (TDX), en potent hemmer og TS-rettet terapeutisk. PC3-celler ble markant ufølsom for TDX selv ved høye konsentrasjoner av medikamentet. Men som observert med 5-FU, styrken av TDX ble betydelig økt ved samtidig bruk av CXCR2 antagonist AZ10397767 (figur 5C, venstre panel). Ikke-lineær regresjonsanalyse av celletelledata bekreftet at styrken (IC30) av TDX ble økt med 37-ganger, fra 1,1 uM til 30 nM i nærvær av AZ10397767. Samspillet mellom AZ10397767 og TDX var sterkt synergistisk, bestemmes ved hjelp av to metoder for statistisk analyse (RI = 1.4, ANOVA P 0,0001). Våre data viser også at den maksimale responsen til TDX er marginalt øket i nærvær av CXCR2 antagonist. I motsetning til dette, LNCaP-celler var mye mer følsomme for TDX alene, og følgelig følsomheten kunne ikke bli ytterligere forbedret ved tilsetning av CXCR2 antagonist (figur 5C, høyre panel).
(A) søylegraf som illustrerer virkningen av CXCR2-inhibitoren på den CXCL8-promo økning i TS transkripsjonsnivåer i PC3-celler som detektert ved qPCR-analyse. Inhibitoren ble tilsatt over natten og celler stimulert med 3 nM rhCXCL8 i 8 timer. (B) En representativ immunoblot som viser virkningen av CXCR2 inhibitoren AZ10397767 ved ekspresjon av TS i ustimulerte og CXCL8-stimulerte betingelser. AZ10397767 ble tilsatt over natten og celler stimulert med 3 nM rhCXCL8 i 8 timer. (C) Diagram som illustrerer celler analysedata, bestemt etter behandling av PC3-celler (venstre panel) og LNCaP-celler (høyre panel) med økende konsentrasjoner av Tomudex, i fravær eller nærvær av CXCR2-reseptor-antagonist, AZ10397767. Celletall ble tatt 72 timer etter behandling med det anti-metabolitt. Legemer data ble analysert ved hjelp av ikke-lineær regresjon funksjon av GraphPad Prism, ved hjelp av en sigmoidal en-site kurvetilpasning ligning. AZ10397767 ble administrert ved en sluttkonsentrasjon på 20 nM i alle forsøk. Datapunkter som vises er gjennomsnittet ± SEM Verdien av tre uavhengige eksperimenter; * P 0,05; ** P. 0,01
Hemming av Bcl-2, sensitizes en nedstrøms CXCL8-transcriptional mål cap celler til 5-FU
CXCL8 signalering øker uttrykket av flere anti-apoptotiske gener inkludert Bcl-2 [10]. En liten-interfererende RNA (siRNA) strategi ble anvendt for å inhibere ekspresjon av Bcl-2. Immunoblotting bekreftet et høyt nivå av endogen Bcl-2-ekspresjon i PC3-celler. Transfeksjon av cellene med en endelig konsentrasjon på 50 nM Bcl-2-målrettede oligonukleotid (Bcl-2-T) redusert, men ikke eliminere Bcl-2-ekspresjon i ubehandlede eller 5-FU-behandlede cellepopulasjoner. Interessant, eksponering for 5-FU i seg selv ble vist å øke BCL-2-ekspresjon i PC3-celler (figur 6A). Nedregulere BCL-2 alene hadde en markant effekt i å fremme apoptose i PC3 celler (økende til 8,5% og P . 0.001 i forhold til egge kontroll (SC) Mens 1fiM 5-FU hadde begrenset effekt i å indusere apoptose, den kombinerte behandlingen med 1 uM 5-FU og Bcl-2 siRNA-oligonukleotider øker andelen av apoptotiske celler til en middelverdi på 10,7%, (P 0,01 i forhold til 5-FU-behandling alene). (figur 6B) den økte nivåer av apoptose indusert ved nedregulering av Bcl-2 i fravær og nærvær av 5-FU ble bekreftet ved påvisning av øket PARP spalting i immunoblottingforsøk eksperimenter (figur 6C).
(A) Immunoblot presentere ekspresjonsnivået av anti-apoptotiske protein Bcl-2 i PC3-celler transfektert med et ikke-målsøkende oligonukleotid (Sc) eller et gen målrettet oligonukleotid (BCL2-T). Alle oligonukleotider ble anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 50 nM. Ekspresjon av Bcl-2- er presentert i fravær eller nærvær av 1 uM 5-FU. (B) Søylediagram som presenterer apoptotisk cellepopulasjon bestemt ved strømningscytometri-analyse i PC3-celler transfektert med et ikke-målsøkende oligonukleotid (Sc) eller et gen målrettet oligonukleotid (BCL2 -T) ved en sluttkonsentrasjon på 50 nM, i fravær eller nærvær av 1 uM 5-FU. Statistisk signifikante forskjeller i apoptose nivåer ble bestemt ved å gjennomføre tosidige t-test analyse; *, P 0,05; **, P 0,01. (C) Immunoblot presentere ekspresjon og spaltningsprodukt av PARP i PC3-celler transfektert med et ikke-målsøkende oligonukleotid (Sc) eller et gen målrettet oligonukleotid (BCL2-T), ble brukt ved en sluttkonsentrasjon på 50 nM, i fravær eller tilstedeværelsen av en pM 5-FU. Lik protein lasting i immunoblotter vist i (A) og (C) ble bekreftet ved re-sondering membraner for uttrykk av GAPDH.
Diskusjoner
CRPC er for tiden en uhelbredelig sykdom. Selv om fremveksten av en ny generasjon av androgen signalveien hemmere (f.eks abiraterone-acetat og MDV3100) for bruk i CRPC pasienter vil bidra til bedre utfall for mange pasienter, er det klart at en mer informert bruk av konvensjonell kjemoterapi vil være nødvendig å forbedre kliniske utfall for pasienter hvor disse nye stoffene ikke klarer å jobbe. 5-FU og dens oral analog kapecitabin har blitt rapportert å være trygg, en andrelinjebehandling ved metastatisk kastrering-resistente Cap, med beskjedne responser observert når det gis i kombinasjon med docetaxel eller oksaliplatin i liten fase II-studier [5], [6 ]. Økende responsen på andre kjemoterapi er av avgjørende betydning i å utvide total overlevelse og kvaliteten på levetiden for pasienter med avansert sykdom.
I denne studien har vi vist betydningen av CXCL8 signalering for å underbygge en roman mode of target-forbundet motstand som reduserer følsomheten av metastatiske celler Cap til 5-FU. CXCL8 uttrykk er opprinnelig forhøyet i metastatisk eller CRPC løpet av normal eller godartet prostatavevet [7], [8], [20]. Videre har vi bekreftet at eksponering for 5-FU forsterker dette nivået av CXCL8 signalering ved samtidig å indusere CXCL8 sekresjon og opp regulerende CXCR1 og CXCR2 genuttrykk i metastatisk prostata kreft celler. Viktigere, hemming av den indre og medikament-indusert CXCL8 signalering ved hjelp av et lite molekyl CXCR2-reseptor-antagonist førte til en statistisk signifikant økning i følsomheten av CRPC celler til 5-FU. Mens vi har utelukkende studert hvilken rolle CXCL8 i moduler dette svaret, våre observasjoner ved hjelp av CXCR2 inhibitor tyder på at stress-indusert økning i de ekstra CXC-kjemokiner som også aktiverer CXCR2 reseptor inkludert CXCL1 og CXCL5 vil også trolig bidra til terapeutisk motstand.
Forhøyet uttrykk for TS er en veletablert biomarkør for redusert 5-FU effekt i tumorer [18], [19]. Administrasjon av enten 5-FU eller CXCL8 alene ble vist å øke TS gen- og proteinnivåer. Stimulering med CXCL8 ble vist å fremme to faser av regulering. Vi har observert en rask økning i TS-ekspresjon som reaksjon på CXCL8 administrering, i samsvar med våre tidligere studier som karakteriserer rollen til denne kjemokin i regulering av proteintranslasjon [14]. Dette ble etterfulgt av en senere-onset økning i protein ekspresjon, i samsvar med den CXCL8-promo økning i transkripsjon av TS-genet. Administrering av en antagonist CXCR2 ble vist å dempe CXCL8-induserte økning i TS gen og protein ekspresjonsnivåene. Derfor tyder våre data på at CXCL8 signale manifesterer en target-forbundet motstand mot 5-FU i CRPC celler ved å øke ekspresjon av TS. Denne konklusjonen er videre støttet av vår observasjon at administrasjonen av en CXCR2 antagonist hadde en dyp effekt på sensibiliserende PC3 cellene til en direkte TS-målrettede inhibitor, Tomudex.
I tillegg foreslår vi at CXCL8 signale kan i tillegg bidra en cellulær motstand mot 5-FU ved å øke anti-apoptotiske proteinekspresjon. Flowcytometri og PARP spaltningsseter analyser viste at den beskyttende virkning av CXCL8 signale ble mediert ved at cellene til å unngå kjemoterapi-indusert apoptose. Vi har tidligere vist at CXCL8 kan opp-regulere anti-apoptotiske uttrykk i Cap celler, inkludert uttrykk for BCL-2, og at samtidig administrering av AZ10397767 kan nedregulerer kjemoterapi-indusert ekspresjon av dette proteinet [10], [11] . Vi gir ytterligere bevis på at undertrykkelsen av Bcl-2 kan øke nivået av apoptose i 5-FU-behandlede celler. Derfor kan CXCL8 signale også bidra til motstanden av CRPC celler til 5-FU ved å lette en økning i ekspresjonen av kritiske inhibitorer av apoptose.
Vårt strøm studie viser en meget distinkt og medikament-spesifikke virkning av anti -metabolites på CXCL8 signalering. Selv om 5-FU inhiberer TS aktivitet, er pemetrexed en multi-målrettet inhibitor med effekter på tre folat-avhengige enzymer i tymidin og purin-nukleotid-synteseveier; TS, dihydrofolat reduktase (DHFR), og glycinamid ribonukleotid formyltransferase (GARFT) [17]. Selv om 5-FU potensieres CXCL8 sekresjon og øker CXCL8-reseptor-ekspresjon i PC3-celler, pemetrexed hadde neglisjerbare virkninger på ekspresjonen av CXCL8 eller dets reseptorer. Derfor våre observasjoner at CXCR2 antagonisten ikke hadde noen effekt på følsomheten av celler til pemetrexed kan være relatert til fraværet av et pemetrexed-indusert økning i CXCL8-signalisering og /eller reflekterer at CXCL8-signalering ikke kan regulere den bredere spekter av mål hvis aktivitet er modulert av pemetrexed. Selv PC3 celler var følsom og reagerte positivt på pemetrexed behandling, har fase II-studier hos pasienter unnlatt å gi oppmuntring til bruk av dette middelet som en ny linje kjemoterapi for metastatisk CRPC, noe som tyder på at andre resistensmekanismer som er relevante for dette stoffet er på spill i denne sykdommen innstillingen [21], [22].
CXCL8-signalering er en viktig proinflammatorisk signal i flere faste tumorer inkludert bryst og kolorektal kreft [23], [24], sykdommer i hvilke 5-FU er dag brukt eller anbefalt som standard-of-care for metastatisk sykdom.
