Abstract
Småcellet lungekreft (SCLC) er aggressiv, med rask vekst og hyppig beinmetastaser; Imidlertid må det detaljerte molekylære mekanismen dårlig forstått. Her rapporterer vi den kritiske rollen tidlig vekstfaktor 4 (EGR4), en DNA-bindende, sink-finger transkripsjonsfaktor, i celle spredning av SCLC. EGR4 overekspresjon i HEK293T celler dratt betydelig oppregulering av bestemte spleisevarianter av parathyroid hormon-relatert protein (
PTHrP
) genet, som resulterer i forbedring av utskillelsen av PTHrP-protein, en kjent mediator av osteolytiske benmetastaser. Enda viktigere, uttømming av
EGR4
uttrykk av siRNA undertrykte betydelig vekst av SCLC cellelinjer, SBC-5, SBC-3 og NCI-H1048. På den annen side innføring av
EGR4
inn i NIH3T3-celler i betydelig grad forbedret cellevekst. Vi identifiserte fire
EGR4
målgener,
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO Hotell og
DLX5
, som var de mest signifikant downregulated gener ved uttømming av
EGR4
ekspresjon i alle de SCLC-celler som ble undersøkt, og demonstrerte den direkte rekruttering av EGR4 til sine promotorer av Chip og luciferase reporter analyse. Spesielt, knockdown av ekspresjonen av disse gener ved siRNA bemerkelsesverdig undertrykket vekst av alle SCLC celler. Til sammen våre funn tyder på at EGR4 sannsynlig regulerer beinmetastase og spredning av SCLC celler via transkripsjonsregulering av flere mål gener, og kan derfor være et lovende mål for utvikling av kreft narkotika for SCLC pasienter.
Citation : Matsuo T, Dat LT, Komatsu M, Yoshimaru T, Daizumoto K, Sone S, et al. (2014) Tidlig Vekst Response 4 er involvert i celle spredning av småcellet lungekreft gjennom Transkripsjonell Aktivering av nedstrøms gener. PLoS ONE 9 (11): e113606. doi: 10,1371 /journal.pone.0113606
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 04.08.2014; Godkjent: 27 oktober 2014; Publisert: 20.11.2014
Copyright: © 2014 Matsuo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av fremtidig avansert forskning fra Universitetet i Tokushima. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de mest vanlige kreftformer, og dens forekomst er økende verdensomspennende [1]. Den høye dødelighet og dårlig prognose for lungekreft skyldes vansker med tidlig diagnose og sin høye metastatisk potensial. Lungekreft er klassifisert i to hovedtyper, henholdsvis småcellet lungekreft (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som står for ca 25% og 75% av tilfellene,. SCLC presenterer med aggressiv klinisk atferd preget av rask vekst og hyppige metastaser til hjernen, lunge, lever og bein [2]. Spesielt forårsaker benmetastase alvorlige komplikasjoner i SCLC og kan føre til skjelettsmerter, patologiske frakturer, hyperkalsemi, ryggmargskompresjon og andre nervekompresjonssyndrom [3], [4], og det er ofte forbundet med høy morbiditet og dårlig prognose. Dagens behandling er generelt palliativ. Derfor er det svært viktig å forebygge og behandle osteolytiske benmetastaser
Bone metastase er generelt klassifisert som osteolytic, fører til bein ødeleggelse.; osteoblastisk, som fører til ny beindannelse; eller blandet basert på den primære mekanismen for interferens med normal benremodellering. Den balanserte aktivitet av osteolytiske og osteoblastiske faktorer er antatt å regulere benmetastase [4], [5]. Nylig har flere molekyler blitt rapportert å spille viktige roller som osteoblastiske faktorer involvert i osteoformation [4] – [6]. Men de nøyaktige mekanismene som er ansvarlig for tumorvekst i bein forbli uutforsket.
Omfattende transcriptomics gi en presis karakterisering av enkelte kreftformer som skal hjelpe til å forbedre kliniske strategier for neoplastiske sykdommer gjennom utvikling av nye legemidler. Derfor «omics» teknologi tilnærminger er effektive for å identifisere målet molekyler som er involvert i kreftfremkallende og metastatisk trasé, inkludert beinmetastaser. For dette formål er det på genom transcriptomics av humane SCLC engasjert i organ-preferansemetastaser i mus ble analysert, og flere gener som potensielt er involvert i beinmetastaser ble funnet [7]. I denne studien har vi fokusert på tidlig vekstrespons 4 (
EGR4
), som er betydelig oppregulert i bein metastatiske svulster sammenlignet med andre organmetastaser (lunge, nyre og lever) avledet fra humane SCLC celler [7].
EGR4
genet tilhører den tidlige vekstrespons familie av umiddelbare tidlige gener som koder for fire DNA-bindende, sink-finger transkripsjonsfaktorer (
EGR1
til
EGR4
) [8]. Dette genet (
pAT133
,
NGFI-C
) ble først identifisert som et sink-finger-proteinet umiddelbart indusert ved mitogen stimulering i T-lymfocytter og fibroblaster [9], [10]. Det har blitt rapportert at
EGR4
-null mus har mannlig ufruktbarhet på grunn av arrestert sædcelle men ingen kvinnelig infertilitet er observert [11], [12], noe som tyder på at EGR4 spiller en avgjørende rolle i enkelte typer menneskelig idiopatisk mannlig infertilitet. Videre er EGR4 kjent for å ha en neural-spesifikk ekspresjon mønsteret hos rotter [13] og regulere hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF) -mediert neuron-spesifikk kaliumklorid kotransporter 2 (KCC2) transkripsjon via ERK1 /2-signalveien i umoden nerveceller [14]. Imidlertid er patofysiologisk rolle av EGR4 i karsinogenese i SCLC, er ikke blitt klarlagt. I denne studien rapporterer vi at EGR4 fungerer som en transkripsjonen aktivator via regulering av spesifikke nedstrøms gener i SCLC celleproliferasjon.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Den menneskelige SCLC cellelinjer SBC-3 og SBC-5 ble vennlig levert av legene. M. Tanimoto og K. Kiura av Okayama University [15]. Den NSCLC cellelinje PC14PE6 ble vennlig levert av Dr. I. J. Fidler av M. D. Anderson Cancer Center [16]. Den humane SCLC-cellelinje NCI-H1048 og humane NSCLC cellelinjer A549 og NCI-H1048 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Det humane ACC-LC319 /bone2 cellelinjen ble etablert som tidligere beskrevet [17]. Den MC3T3-E1 murine osteoblastisk kloning 4 cellelinjen ble vennlig levert av Chugai Pharmaceutical Co., Ltd (Tokyo, Japan). Det humane små luftveier epitelcellelinje (SAEC) ble innkjøpt fra Lonza (Walkersville, MD, USA). Alle celler ble dyrket under egnede forhold.
Plasmid konstruerer
Hele kodende sekvens av humant
EGR4 plakater (NM_001965) ble forsterket av PCR hjelp KOD pluss DNA polymerase (Toyobo, Osaka, Japan). PCR-produktet ble satt inn i
Eco
RI og
Xho
I områder av pCAGGSn3FH vektor som inneholder en N-terminal FLAG tag. For luciferase reporter plasmider, DNA-fragmenter fra 5′-flankerende områder av
PTHrP-V3 Hotell og
V4 plakater (NM_198964.1 og NM_198966.1, henholdsvis),
SAMD5
(NM_001030060.2),
RAB15 plakater (NM_198686.2),
SYNPO plakater (NM_007286.5) og
DLX5 plakater (NM_005221.5), som inkluderer potensial EGR bindende steder som forutsagt av programmet MatInspector (Genomatix, https://www.genomatix.de/matinspector.html), ble amplifisert ved PCR og satt inn i de passende restriksjonsenzymseter i pGL3-enhancer-vektor (Promega, Madison, WI , USA). PCR primersett brukt i denne studien er vist i tabell S1. DNA-sekvensene av alle konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensering (ABI 3500xL sequencer, Life Technologies, Foster City, CA, USA).
RNA ekstraksjon, revers transkripsjon, semi-kvantitativ PCR og real-time PCR
Total RNA ekstraksjon, revers-transkripsjon, semi-kvantitativ RT-PCR og real-time PCR eksperimenter ble utført som tidligere beskrevet [18]. Uttrykket nivåer i hver prøve ble normalisert til
β
aktin mRNA innhold. Sekvensene i hvert primersett er oppført i Tabell S2.
Western blot-analyse
Western blot-analyse ble utført som tidligere beskrevet [18]. Etter SDS-PAGE, ble membraner utslettet med proteiner inkubert med anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, F3165) eller anti-β-aktin (AC-15, Sigma-Aldrich, A-5441) mus monoklonale antistoffer fortynnet 1:5000. Membranene ble deretter inkubert med et pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff i 1 time, og proteinbånd ble visualisert med forbedret Chemiluminescence (ECL) påvisningsreagenser (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA).
Måling av PTHrP sekresjon
HEK293T celler (1,5 × 10
5 celler /12-brønns plate) ble transfektert med pCAGGSn3FH-EGR4 eller håne (ingen insert) plasmider ved hjelp Fugene 6 (Promega). Ved 48 timer etter transfeksjon, ble kulturmediet oppsamlet og sentrifugert ved 4 ° C ved 15.000 rpm. Proteinkonsentrasjonen i det kondisjonerte medium PTHrP ble bestemt av en immunoradiometric (IRMA) assay (SRL Inc., Tokyo, Japan).
Effekt av kondisjonert medium avledet fra EGR4-overekspresjon HEK293T celler på
RANLK
,
IL-6 Hotell og
IL-8
uttrykk
HEK293T celler (2,6 × 10
6 celler /10 cm plate) ble transient transfektert med pCAGGSn3FH-EGR4 eller mock-vektoren i 48 timer, og kulturmediet ble deretter erstattet med DMEM pluss 0,1% FBS i ytterligere 48 timer. Dyrkningsmediet ble deretter oppsamlet, og det kondisjonerte medium ble overført til murine MC3T3-E1 osteoblastceller som var pre-dyrket med differensiering medium inneholdende askorbinsyre (100 ug /ml) i 5 dager. Etter 48 timer, uttrykket nivåer av murine
RANKL
,
IL-6
, og
IL-8
ble analysert ved real-time PCR som beskrevet ovenfor.
Chromatin immunoprecipitation (chip) assay
HEK293T celler (2,5 × 10
6 celler /10 cm parabol) ble transfektert med 8 mikrogram av pCAGGSn3FH-EGR4 eller håne vektor i 48 timer og deretter chip-analyser ble utført ved anvendelse av EZ-chip-kit (Millipore, Billerica, MA, USA) som tidligere beskrevet [19]. PCR primer sett å oppdage EGR-bindingssteder som brukes er oppført i tabell S3.
Luciferase assay
HEK293T celler (2,5 × 10
4 celler /48-brønners skål) var ko-transfektert med enten 100 ng av pGL3-enhancer-promoter-vektoren som beskrevet ovenfor, eller mock vektor i kombinasjon med 100 ng av pCAGGSn3FH-EGR4 eller håne vektor (100 ng). PRL-TK ble anvendt som en intern kontroll. Etter 48 timer ble cellene høstet og analysert for
Firefly
luciferase og
Renilla
luciferase-aktivitet ved hjelp av den doble luciferase reporter-analyse (Promega) som tidligere beskrevet [19]. Data ble uttrykt som fold økning mock-transfekterte celler (satt til 1,0) og representert som gjennomsnitt ± SE av to uavhengige eksperimenter.
NIH3T3 celleproliferasjonsanalyse
NIH3T3 celler (0,5 × 10
5 celler /6-brønns parabol) ble transient transfektert med 3 ug pCAGGSn3FH-EGR4 eller håne vektor bruker Fugene 6 (Promega). Celle-proliferasjon ble utført ved 48, 72 og 96 timer etter transfeksjon, henholdsvis, ved hjelp av celletelling leder-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) som tidligere beskrevet [18]. Disse eksperimentene ble utført i tre eksemplarer. Western blot analyse ble utført som beskrevet ovenfor.
genet Slå effekter av siRNA behandling
Vi brukte siRNA oligonukleotider (Sigma-Aldrich Japan KK, Japan) for å slå ned
EGR4
DLX5, SYNPO SAMD5 Hotell og
RAB15
uttrykk i SBC-5, SBC-3, NCI-H1048 eller PC14PE6. Sekvensene rettet mot hvert gen er oppført i tabell S4. Cellene ble sådd ut i 12-brønners retter (SBC-5 og PC14PE6, 1,5 × 10
4 celler /brønn, SBC-3, 2,5 × 10
4 celler /brønn, NCI-H1048, 5,0 × 10
4 celler /brønn). Transfeksjon av 100 nM siRNA til SBC-5 og PC14PE6 celler ble utført ved hjelp Lipofectamine 2000 reagens (Life Technologies) som beskrevet tidligere [20]. SBC-3 og NCI-H1048-celler ble transfektert med 50 nm sirnas bruker Lipofectamine RNAi Max transfeksjon reagens (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. På 48, 96 eller 120 timer etter transfeksjon, total RNA ekstraksjon, ble real-time PCR og celleproliferasjonsprosesser analyser utført som beskrevet ovenfor.
Identifikasjon av EGR4 nedstrøms gener ved DNA microarray
SBC- 5 celler (1 x 10
6 celler /35 mm fatet i 24 timer) ble transfektert med 10 nM siRNA rettet mot EGR4 (EGR4-2) eller EGFP (siEGFP, en kontroll) ved hjelp Lipofectamine RNAi Max transfeksjon reagens (Life Technologies ). Total RNA ble ekstrahert fra hver prøve ved 48 og 72 timer etter transfeksjon av siRNA. De DNA microarray og dataanalyser ble utført ved hjelp av Agilent Whole Human Genome Mikromatrise (4 × 44K, G4110F, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) og GeneSpring programvare (versjon 11.5, Agilent Technologies) som beskrevet tidligere [21]. En korrigert
P
verdi ble beregnet med Benjamini Hochberg falske funnrate (FDR) analyse, og
P
0,05 ble betraktet som signifikant. Omfanget og retningen av den differensielle ekspresjonen mellom tidspunktene (48 og 72 timer) ble bestemt ved å beregne brette endre verdier. De DNA microarray analyse av data har blitt sendt til NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database som serie GSE40558.
RNAseq dataanalyse av lungekrefttilfellene
Offentlig tilgjengelige genuttrykk data (normaliserte verdier fra Illumina RNAseq v2, nivå 3, LUAD og LUSC) fra Kreft Genome Atlas (TCGA, ble https://cancergenome.nih.gov/) ned fra TCGA matrise. Den differensielle uttrykket (ved foldendring verdi) mellom cancervev og tilstøtende normal lunge ble beregnet i henhold til den normaliserte genekspresjon verdi for hver prøve.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av Students
t
-test.
P
0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
EGR4 regulerer direkte transkripsjonen aktivitet av
PTHrP
genet
Analysis. av genomet-wide-genekspresjon profil av organ-preferansemetastase av den humane SCLC-cellelinje SBC-5 i mus identifisert tidlig i vekstrespons 4 (
EGR4
), som var signifikant oppregulert i beinmetastatiske tumorer (
p
0,001, ratio, 2,22) sammenlignet med andre organmetastaser (lunge, nyre og lever) [7]. Først, for å avklare rollen EGR4 som en transkripsjonsfaktor som er involvert i beinmetastaser, vi fokusert på parathyreoideahormon relaterte protein (
PTHrP
) genet som kandidat nedstrøms mål av EGR4 fordi
PTHrP
-genet er kjent for å være en potent aktivator av osteoklastisk benresorpsjon [4] og koder for et protein utskilt fra SBC-5-celler [22], [23]. Videre har det blitt rapportert at behandling med et anti-PTHrP-nøytraliserende antistoff hemmer produksjonen av SBC5 celle benmetastase i SCID-musemodellen [22], [23].
I National Center for Biotechnology Information ( NCBI databasen),
PTHrP
genet er rapportert å ha fire transkripsjons varianter, utpekt
PTHrP
variant 1 (PTHrP-V1, GenBank tiltredelse no. NM_198965.1), variant 2 (PTHrP- V2, NM_002820.2), variant 3 (PTHrP-V3, NM_198964.1) og variant 4 (PTHrP-V4, NM_198966.1). Full-lengde cDNA av
PTHrP-V1
,
V2
,
V3 Hotell og
V4
bestå av 1331, 1881, 1862 og 1312 nukleotider som kode 177, 175, 175 og 177 aminosyrer, henholdsvis, og bestå av 5, 4, 3, og 4 eksoner, respektivt. V1 varianten mangler ekson 3, og V2 varianten mangler ekson 3 og besitter ekson 5b, som er 1027 bp lengre ved 3′-enden enn exon 5a. V3 og V4 varianter som vanligvis mangler eksoner 1 og 2, og har ekson 3, som er plassert i intron 2 med en lengde på 281 bp. V3-varianten mangler ytterligere ekson 6, og besitter ekson 5b og V2 variant. V4 varianten besitter ekson 5a og exon 6, noe som indikerer at
PTHrP-V1 /V2
og
V3 /V4
varianter har forskjellige promotorområdene (figur 1A). Påfølgende real-time RT-PCR-analyse bekreftet at
PTHrP-V3 Hotell og
V4
spleise varianter ble hovedsakelig oppregulert på transkripsjonsnivået i EGR4-overekspresjon HEK293T celler sammenlignet med mock-transfekterte celler ( Figur 1B). Følgelig, for å oppnå direkte bevis for oppregulering av
PTHrP-V3
og
V4
av EGR4, vi først søkte etter putative EGR DNA-bindingsmotiv med MatInspector program (beskrevet ovenfor), fordi det har blitt rapportert at EGR-familien, herunder EGR4 protein, fortrinnsvis binder seg til et EGR-konsensusmotiv (5′-GCGG /TGGGCG-3 «) [24] – [27]. Vi fant en potensiell EGR DNA-bindingsmotiv i
PTHrP-V3 Hotell og
V4
promoter-regionen (-515 til -499). Deretter undersøkte vi transkripsjonen aktivitet av EGR4 av en luciferase reporter analysen bruker en pGL3 luciferase plasmid som inneholder EGR4 bindende motiv i
PTHrP-V3 /V4
promoter. En betydelig økning i luciferase-aktivitet ble observert med FLAG-EGR4 transfeksjon sammenlignet med mock-kontroll vektor i HEK293T celler (figur 1C). For ytterligere å undersøke om EGR4 kan binde seg til en potensiell
PTHrP-V3 Hotell og
V4
EGR bindende motiv, utførte vi en chip analysen. Den genomisk fragment herunder potensial EGR bindende motiv (-515 til -499) av
PTHrP-V3 Hotell og
V4
ble spesifikt bundet av EGR4 protein i produkter immunoutfelt med et anti-FLAG antistoff, som tyder på at EGR4 direkte bundet til arrangøren regionen i
PTHrP-V3 Hotell og
V4
varianter (figur 1D). Samlet utgjør disse funnene tyder på at EGR4 kan direkte oppregulere
PTHrP-V3 Hotell og
V4
varianter i SCLC celler
A:. Genomisk strukturer av de fire spleisevarianter av
PTHrP
. De grå og hvite bokser indikerer kodende og ikke-kodende områder, henholdsvis. Pilene viser primersettene som brukes til å utføre RT-PCR for hvert transkript. Tallene i parentes indikerer lengden av hvert exon. B: Øvre panel: western blot analyse av HEK293T celler som uttrykker eksogent FLAG-merket EGR4 (FLAG-EGR4) eller celler transfektert med modellvektor. Nedre panel: real-time RT-PCR analyse av
PTHrP
spleisevarianter (
V1 /V2 Hotell og
V3 /V4
) i EGR4-overekspresjon HEK293T celler. C: Luciferase assay av
PTHrP-V3 Hotell og
V4 product: (
V3 /V4
) promoter regioner (n = 2, *
P
0,05). Dette eksperimentet ble utført ved hjelp av en del av de lysatene fra celler som uttrykker eksogent FLAG-EGR4 eller de transfektert med modellvektor brukes i B. D: ChIP analysen av
PTHrP-V3 /V4
promoter-regionen. Chip-analyser ble benyttet for å bestemme direkte EGR4 binding til
PTHrP-V3 /V4
promoter. PCR-produktet var -620 til -318 av regionen oppstrøms for 5′-enden av ekson 3 av
PTHrP-V3 /V4
, som ble betegnet som 1 stilling.
parakrint effekter av PTHrP utskilt fra EGR4-overekspresjon celler
det har blitt rapportert at PTHrP protein utskilt fra kreftceller regulerer uttrykk for
RANKL
,
IL-6
og
IL-8
gener, som har blitt implisert som faktorer som forbedrer osteoklastdannelse og bendestruksjon i ondartede sykdommer, [28] – [30] i osteoblastceller. Ifølge disse data og våre funn som vist i figur 1, hypotese vi at PTHrP-proteinet utskilles fra EGR4-overuttrykkende celler. Våre resultater viste at PTHrP proteinkonsentrasjonen ble betydelig økt i media klimaanlegg fra EGR4-overekspresjon HEK293T celler (14,43 ± 1,04 pmol /L) sammenlignet med kondisjonert medium fra mock-transfekterte celler (11,83 ± 0,15 pmol /L,
P
0,05, figur 2A)
A:. Utskillelse av PTHrP protein fra EGR4-overekspresjon HEK293T celler (n = 3, *
P
0,05). B: Måling ordning for parakrine effekter av kondisjonert medium fra EGR4-overekspresjon celler. C: Real-time PCR analyse av parakrine effekter på uttrykk for
RANKL, IL-6 Hotell og
IL-8
gener når mediet fra EGR4-overekspresjon HEK293T celler ble dyrket med musen MC3T3-E1 osteoblastceller (n = 2, *,
P
0,05, **,
P
0,01).
Neste, vi evaluert parakrine effektene av kondisjonert medium fra EGR4-overekspresjon HEK293T celler på osteoblastceller. Som vist i figur 2B, overføres vi kondisjonert medium fra HEK293T-celler transfektert med FLAG-EGR4 konstruere til MC3T3-E1 murine osteoblastceller og deretter utført real-time PCR for å undersøke effekten av det kondisjonerte medium på ekspresjonsnivået av
RANKL
,
IL-6 Hotell og
IL-8
gener. Alle tre gener ble signifikant oppregulert i osteoblastceller behandlet med kondisjonert medium fra HEK293T celler ectopically uttrykker FLAG-EGR4 sammenlignet med mock-transfekterte celler (Figur 2C). Sammen er disse funnene tyder på at økningen i PTHrP sekresjon fra EGR4-overekspresjon celler kan forsterke uttrykket av
RANKL
,
IL-6 Hotell og
IL-8
gener i osteoblastceller.
Effekt av
EGR4
på cellevekst
Vi først undersøkt
EGR4
uttrykk i SCLC celler ved semi-kvantitativ RT-PCR og funnet at
EGR4
ble sterkt uttrykt i SBC-3, SBC-5 og NCI-H1048-celler, men ikke i de små luftveiene epitelcellelinje SAEC (figur 3A). Ved siden av, for å vurdere hvorvidt EGR4 er vesentlig for vekst av SBC-5-celler, anvendte vi en RNA-interferens tilnærming med to forskjellige siRNA oligonukleotider. Real-time PCR-analyse viste at
EGR4
-spesifikke sirnas (siEGR4-1 og siEGR4-2) undertrykte betydelig uttrykk for EGR4 sammenlignet med siEGFP som en kontroll (figur 3B). MTT-analysen viste at innføringen av siEGR4s (siEGR4-1 og siEGR4-2) i betydelig grad undertrykkes veksten av SBC-5-celler (figur 3C), som er i samsvar med de EGR4 knockdown resultater. Vi bekreftet også betydelig veksthemmende effekter av
EGR4
knockdown i andre SCLC cellelinjer SBC-3 og NCI-H1048 overekspresjon
EGR4 plakater (Figur S1). For ytterligere å bekrefte den vekstfremmende virkning av
EGR4
, FLAG-EGR4 konstruere eller mock-vektoren ble transient transfektert inn i NIH3T3-celler, og MTT-analysen ble utført som beskrevet ovenfor. Som vist i figur 3D, FLAG-EGR4-transfekterte celler vokste betydelig raskere enn de transfektert med mock vektor. Disse funnene tyder på at overekspresjon av
EGR4
kan være involvert i veksten av SCLC celler
A:. Uttrykk for
EGR4
i SCLC og NSCLC cellelinjer ble bestemt av semi -quantitative RT-PCR. B: Effekter av
EGR4
knockdown på celleproliferasjon i SBC-5 celler. Real-time PCR av
EGR4
i siEGFP- eller siEGR4 (siEGR4-1, siEGR4-2) behandlede celler i 5 dager etter siRNA behandling (n = 2, *
P
0,05).
ACTB
ble brukt som en kvantitativ kontroll for real-time RT-PCR. C: Celleformering ble bestemt ved MTT-analyse ved 5 dager etter siRNA behandling (n = 3, ***
P
0,005). (Si-1; siEGR4-1, si-2; siEGR4-2). D: vekstfremmende effekten av eksogent EGR4 på NIH3T3 celler (*
P
0,05, **
P
0,01,
NS
, ingen betydning). Western blot-analyse ble utført ved 96 timer etter transfeksjon (venstre panel). MTT-analysen ble utført ved 48, 72 og 96 timer etter transfeksjon med FLAG-EGR4 (sort) eller mock vektor (hvit) (høyre panel). Disse eksperimentene ble utført i tre eksemplarer.
Identifikasjon av
EGR4
målgener
For å få mer innsikt i den biologiske rollen
EGR4
på cellevekst, forsøkte vi å identifisere nedstrøms gener spesifikt regulert EGR4 i SCLC celler. siEGR4 eller siEGFP (kontroll siRNA) ble transfektert inn SBC-5 celler der
EGR4
ble sterkt uttrykt (figur 3A) og endringer i genuttrykk på to tidspunkter ble overvåket av DNA microarray analyse. For å identifisere genene putatively regulert av EGR4, vi valgte gener med følgende to kriterier: (i) uttrykksnivået ble redusert med mer enn to ganger på 48 og 72 timer i celler transfektert med siEGR4 sammenlignet med celler transfektert med kontroll siEGFP, og (ii) en antatt EGR bindingsmotiv ble forutsagt å foreligge innenfor 500 bp av transkripsjonsstartsetet av MatInspector program (beskrevet ovenfor). Vi identifiserte 13 gener som ble nedregulert på knockdown av EGR4 uttrykk (tabell S5). Real-time PCR-analyse bekreftet at sju transkripsjoner ble signifikant nedregulert ved begge tidspunkter i EGR4-knockdown celler (Figur 4A). Deretter vurderte vi også oppregulering av disse genene ved eksogene EGR4 uttrykk i HEK293T celler og til slutt valgte fire EGR4 kandidat målgener, inkludert distal-mindre homeobox 5 (
DLX5
), synaptopodin (
SYNPO
), sterile alpha motiv domene som inneholder 5 (
SAMD5
), og RAB15, et medlem av RAS onkogen familien (
RAB15
), som ble signifikant oppregulert av
EGR4
overekspresjon (figur 4B). Vi bekreftet betydelig nedregulering av
DLX5
,
SYNPO Hotell og
SAMD5
gener ved
EGR4
knockdown i SBC-3 celler (figur S2).
A: real-time PCR av
EGR4 Hotell og syv nedstrøms gener (
DLX5, SYNPO, SAMD5
,
MREG, AHNAK, RAB15
, og
PTPN23
) i siEGFP- eller siEGR4 behandlet SBC-5 celler (n = 2, *,
P
0,05, **,
P
0,01, * **
P
0,005). B: Real-time PCR av
DLX5
,
SYNPO
,
SAMD5
, og
RAB15
gener i mock- eller EGR4-overekspresjon HEK293T celler (n = 2, *,
P
0,05, ***,
P
0,005). Dette eksperimentet ble utført ved hjelp av total RNA fra celler som uttrykker eksogent FLAG-merket EGR4 (FLAG-EGR4) eller de transfektert med modellvektor som brukes i Figur 1B. C: Luciferase assay av
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO Hotell og
DLX5
gener. (N = 2, *,
P
0,05, **,
P
0,01). D: Chip analyser ble benyttet for å bestemme den direkte binding av EGR4 til arrangører av
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO Hotell og
DLX5
gener .
for å få direkte bevis for trans av fire EGR4 kandidat målgener, målte vi transkripsjonen aktivitet av EGR4 av en luciferase reporter analysen. FLAG-EGR4-transfekterte celler hadde betydelig høyere luciferase aktivitet enn mock-transfekterte celler (Figur 4C). Deretter undersøkte vi rekruttering av EGR4 til hver EGR4-bindingssetet av Chip analysen. EGR4 ble vist å binde seg til den forutsagte EGR-bindende motiv innen promotorområdene for alle målgener (Figur 4D). Disse resultatene tyder på at EGR4 direkte transaktiverer
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO Hotell og
DLX5
. Deretter undersøkte vi den biologiske rolle av de fire EGR4 målgener i proliferasjonen av SCLC-celler. Innføring av de sirnas inn i SBC-5, SBC-3 og NCI-H1048-celler resulterte i en betydelig reduksjon i ekspresjonen av målgener ledsaget av betydelige undertrykkelse av celleproliferasjon (figur 5A-D, figur S3), noe som tyder på at disse genene er også sannsynlig å spille en avgjørende rolle i spredning av SCLC celler via EGR4 transcriptional aktivering.
Effekter av
EGR4
nedstrømsgener
SAMD5 product: (A),
RAB15 product: (B),
SYNPO product: (C) og
DLX5 product: (D) på celleproliferasjon ble bestemt av siRNA knockdown i SBC-5 celler. Det venstre panelet viser real-time PCR resultater for målgener i siRNA-behandlede celler (n = 2). Høyre panel viser resultater fra celleproliferasjon analyser målt ved MTT-analyse (
SAMD5 Hotell og
RAB15
: n = 2,
DLX5 Hotell og
SYNPO
.: n = 3, *,
P
0,05, **,
P
0,01, ***,
P
0,005)
Diskusjoner
i denne studien, vårt mål var å identifisere og karakterisere molekyler eller som potensielt er involvert i kreftmetastaser, særlig bein metastasering. Gjennom et genom-wide transcriptomic analyse av organ fortrinnsrett metastasering av humane SCLC celler i mus, fant vi at
EGR4
, et medlem av en familie på fire relaterte sink-finger Cys
2-His
2 typen proteiner (
EGR1
til
EGR4
), er betydelig oppregulert i bein metastatiske svulster sammenlignet med andre organer dvs. lunge, nyre og lever [7]. EGR4 ble først identifisert som et sink-finger transkripsjonsfaktor umiddelbart indusert ved mitogen stimulering i T-lymfocytter og fibroblaster [31]. Gene targeting studier på mus har vist at EGR4 regulerer flere kritiske gener som er involvert i de tidlige stadiene av meiose og spiller en uunnværlig rolle i mannlig murine fruktbarhet [11], [12]. Videre har det blitt rapportert at EGR4 bindes til nukleære faktor aktiverte T-celler (NFAT) eller nukleær faktor kappa B (NFkB) for å øke transkripsjonen av nedstrøms gener som koder for inflammatoriske cytokiner, slik som IL-2, TNF-α og ICAM-1 [32], [33]. En tidligere rapport beskrevet at uttrykket nivået av
PTHrP
, en potent aktivator av osteoklastisk benresorpsjon, i benmetastaser en tendens til å være høyere enn i metastaser til nyrer, lever og lunger ved hjelp av et genom-wide transcriptomics av humane SCLC-celler hos mus [7]. Følgelig, i denne studien, har vi fokusert på
PTHrP
, en potent aktivator av osteoklastisk benresorpsjon, som EGR4-nedstrøms genet for å avklare patofysiologisk rolle EGR4 som en transkripsjonsfaktor i SCLC benmetastaser.
PTHrP er kjent for å være en viktig formidler av humorale hyperkalsemi malignitet og osteolytiske lungekreftmetastaser [22], [23], [34]. Omtrent 80% av pasientene med solide svulster og hyperkalsemi har økt PTHrP konsentrasjoner i deres plasma [35]. Det har blitt rapportert at PTHrP protein utskilt fra kreftceller regulerer uttrykk for
RANKL
,
IL-6 Hotell og
IL-8
gener, som har vært innblandet som faktorer som øker osteoklastdannelse og bein ødeleggelse i ondartede sykdommer [28] – [30] i osteoblastceller. Vi fant ut at EGR4 direkte transaktiverer spesifikke varianter (
V3 Hotell og
V4
) av
PTHrP
genet, og dermed muligens fremme utskillelsen av PTHrP protein i EGR4-overekspresjon celler , noe som resulterer i påfølgende trans av
RANKL
,
IL-6 Hotell og
IL-8
gener via parakrint handling av PTHrP. RANKL er kjent for å binde RANK reseptor på osteoklast forløpere og indusere osteoklastdannelse. IL-6 og IL-8 er også blitt rapportert til å være viktig for osteoclastogenesis og osteoklast aktivering, henholdsvis [30]. Derfor er disse funnene tyder på at induksjon av PTHrP av EGR4 overekspresjon kan være ansvarlig for bein metastasering av SCLC lunge kreftceller.
