Abstract
Vi har evaluert potensialet i en eksperimentell histone metylering reversering agent, 3-deazaneplanocin A (DZNep), i å forbedre kjemosensitivitet for kreft i bukspyttkjertelen til nukleosidanaloger (dvs. gemcitabin). DZNep brakt forsinket, men selektiv cytotoksisitet til kreft i bukspyttkjertelen celler uten å påvirke normale menneskelige bukspyttkjertelen ductal epitel (HPDE) celler. Co-eksponering av DZNep og gemcitabin indusert cytotoksiske additivity eller synergisme i begge brønn og dårlig differensierte bukspyttkjertelen cellelinjer ved økt apoptose. I motsetning til dette, DZNep utøves antagonisme med gemcitabin mot HPDE-celler med betydelig reduksjon av cytotoksisitet sammenliknet med gemcitabin-regimer alene. DZNep marginalt avhengig av purin-nukleosid transportører for sin cytotoksisitet, men transporten avhengighet ble omgått ved acyl derivatisering. Drug eksponerings studier viste at en kort priming med DZNep fulgt av gemcitabin behandling i stedet for co-behandling av både agenter for å gi en maksimal chemosensitization respons i både gemcitabin-sensitive og gemcitabin-resistente kreft i bukspyttkjertelen celler. DZNep raskt og reversibelt redusert trimethylation av histon H3 lysin 27, men økt trimethylation av lysin 9 i en EZH2- og JMJD1A /2C-avhengig måte, henholdsvis. Imidlertid ble DZNep forsterkning av nukleosid analog chemosensitization funnet å ha en tids koblet til trimethylation endringer i lysin 27 og ikke lysin 9. Polymer nanopartikler konstruert for å kronologisk slipp DZNep fulgt av gemcitabin produsert uttales chemosensitization og dosesenkende effekt. Sammen våre resultater identifisere at en optimalisert DZNep eksponering kan presensitize kreft i bukspyttkjertelen celler til antikreft nukleosidanaloger gjennom reversering av histone metylering, med vekt på de lovende kliniske verktøy av epigenetiske reversering midler i fremtidige bukspyttkjertelkreft kombinasjonsterapier
Citation.: Hung SW, Mody H, Marrache S, Bhutia YD, Davis F, Cho JH et al. (2013) Farmakologisk Tilbakeføring av Histone Metylering Presensitizes kreft i bukspyttkjertelen celler til Nukleosidnaive Drugs:
In Vitro
optimalisering og Novel nanopartikkel Levering Studies. PLoS ONE åtte (8): e71196. doi: 10,1371 /journal.pone.0071196
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 13 februar 2013; Godkjent: 27 juni 2013; Publisert: 6. august 2013
Copyright: © 2013 Hung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [Grant P30GM092378] (SD), National Cancer Institute [Grant 1R03CA161832-01] (RG), Georgia Cancer Coalition (RG), og OVPR av The University of Georgia (SD). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Polycomb gruppe proteiner (PCGS) kan fornye kromatin ved å påvirke graden av komprimering, som fører til epigenetisk genet demping. Polycomb Undertrykkende Kompleks 2 (PRC2), en av de to klasser av PCGS, induserer histon-metyltransferase-aktivitet i første rekke ved trimethylating histon H3 lysin 27 (H3K27me3), mediere stanse av tumorsuppressorgener. Den katalytiske subenhet av PRC2 er Enhancer av Zeste homolog 2 (EZH2), hvor SET domenet utgjør det aktive setet for histon H3K27 metylering [1]. Studier støtter EZH2 som en sentral aktør i utvikling og progresjon av svulster på grunn av sin evne til å endre genekspresjon inkludert de som er involvert i cellesykluskontroll, cellemigrasjon, og DNA-reparasjon [2]. EZH2 er avgjørende i kromatin kontroll av genetisk omprogrammering av kreft stamcelle selvfornyelse og differensiering som har vært implisert i chemoresistance [3] – [6]
Som en markør av avansert og metastatisk sykdom i mange faststoff. tumorer, har EZH2 overekspresjon er rapportert i bukspyttkjertel kreft, spesielt de som er dårlig differensiert [6], [7]. EZH2 ble funnet å være oppregulert ved onkogene RAS gjennom MEK-ERK signalering, som fører til nedregulering av tumor-suppressorer som RUNX3 og p27 (Kip1) [6], [8], [9]. EZH2 uttømming ført til cellesyklus-stans ved G1 /S overgang, noe som tyder på at proteinet kan undertrykke tumor undertrykke p27-genet [10]. Tilsvarende knockdown av EZH2 resulterte i en signifikant reduksjon i celleformering og invasivitet [6], [7], [11] og sensibilisert kreft i bukspyttkjertelen celler til doksorubicin og gemcitabin, avslører potensialet for en EZH2 inhibitor-kjemoterapeutiske kombinasjonsterapi [6] .
In vivo
, undertrykke EZH2 redusert tumorigenicity og hemmet kreft i bukspyttkjertelen metastase [7]. Klinisk, har positive korrelasjoner observert mellom EZH2 uttrykk og avansert kreft i bukspyttkjertelen stadium og grad hos pasienter [11]. I mange tilfeller, ble høye nivåer av EZH2 i kreft også signifikant assosiert med redusert E-cadherin ekspresjon og sterkt aggressiv sykdom. I gemcitabin-behandlede pasienter ble betydelig lengre overlevelse hos pasienter med lav enn høy EZH2 uttrykk [12]. Følgelig kan EZH2 være en betydelig prognostisk verdi for total overlevelse på bukspyttkjertel kreftpasienter [13].
Nylig har det blitt vist at en potent kjemisk inhibitor av S-adenosylhomocystein hydrolase, 3-deazaneplanocin A (DZNep) , modulerer kromatin ved indirekte (det vil si reduksjon av metylgruppe tilgjengelighet) hemning av histon metyltransferaser inkludert EZH2 [14], [15]. DZNep, en karbosyklisk analog av adenosin, utarmer cellulære nivåer av PRC2 komponentene mens hemme tilhørende H3K27me3 [16]. Selv om mekanismene og effekten av DZNep har blitt studert i en rekke faste tumorer og leukemi [2], [3], [14], [15], [17] – [21], mindre er kjent om potensialet i denne forbindelse for kreft i bukspyttkjertelen behandling. Likevel, dagens potensial for å redusere EZH2 nivåer, gå tilbake epitelial til mesenchymale overgang (EMT), og forebygge tumorprogresjon, gjør det til et svært lovende antimetastatic agenten [5]. Det terapeutiske potensialet for DZNep i kombinasjon med andre midler, slik som polyfenoler og histondeacetylase inhibitorer, har begynt å dukke opp med oppmuntrende resultater [14], [15]. Siden økende bevis tyder på at fremtidig kreftbehandling vil dra nytte av synergieffekter oppnås fra forskjellige kombinasjoner av epigenetisk reversering og konvensjonelle antitumormidler [22] undersøkte vi potensialet i DZNep-gemcitabin kombinasjon for å forbedre kreft aktivitet i bukspyttkjertelkreft. Våre resultater identifisert som histone metylering reversering av DZNep presensitizes kreft i bukspyttkjertelen celler til gemcitabin. Optimalisering av legemiddelkombinasjonen gjennom dosering og leveringsmetoder ble ytterligere gjennomført.
Materialer og metoder
Reagenser
Radiomerket (
3H) gemcitabin, adenosin, tymidin, og guanosin ble innhentet fra Moravek Biochemicals og radiochemicals (Brea, California), mens kald gemcitabin var fra ChemieTek (Indianapolis, IN). Adenosin og guanosin ble vennlig levert av Dr. Chung K. Chu (University of Georgia). Tymidin, uridin, nitrobenzyl merkaptopurin-ribosid (NBMPR), og 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Dimetylsulfoksid (DMSO) ble kjøpt fra Macron Chemicals (Center Valley, PA), og bicinchoninic syre (BCA) protein assay reagens var fra Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL). Plast og varer til cellekultur ble hentet fra Corning (Corning, New York).
Cell Culture
bukspyttkjertelkreft cellelinjer (ASPC-1, BxPC-3, CAPAN-en, MIA PaCa- 2, og PANC-1) og MCF-10A-celler ble mottatt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) cellebank. Disse cellelinjer ble formert, ekspandert og frosset umiddelbart etter ankomst. Cellene gjenopplivet fra den frosne lager ble anvendt innen 10-20 passasjer, som ikke overstiger en periode på 2-3 måneder. ATCC benytter morfologiske, cytogenetisk og DNA-profilanalyse for karakterisering av cellelinjer. Menneske pancreatic ductal epitel (HPDE) celler [23] ble vennlig mottatt fra Dr. Ming Tsao av Ontario Cancer Institute (Toronto, Canada). Den L3.6pl cellelinje [24] ble vennlig mottatt fra Dr. Isiah D. Fidler ved The University of Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, Texas). De HPDE og L3.6pl cellelinjer ble behandlet som andre cellelinjer og ble genotypet ved DNA fingerprinting (PowerPlex 16, Promega, Inc.) i henhold til produsentens instruksjoner. Den 293T cellelinjen ble vennlig mottatt fra Dr. J. Michael Thomson fra The University of Georgia (Athens, Georgia). Vekstbetingelser cellelinjer ble utført som beskrevet tidligere [25].
MTT Cvtotoksisitetsmålinq
Celler ble sådd ut ved en tetthet på 3 x 10
3 celler /brønn i en 96 -godt mikrotiterplate og dyrket til 90-95% konfluens. Etter behandling, ble 50 ul av MTT-løsning (5 mg /ml i PBS) tilsatt hver brønn, og platene ble inkubert i 2 timer. MTT formazankrystaller ble oppløst i 100 ul /brønn av DMSO ved å riste platene på en gyngende plattform. En 96-brønners skanner ble anvendt for å måle spektrofotometrisk absorbans ved 490 nm. Absorbansen ved 650 nm ble anvendt for bakgrunns subtraksjon. Den 50% inhiberende konsentrasjon (IC
50) ble bestemt ved å anvende GraphPad Prism programvare 5.0.
Caspase 3 Assay
Apoptose ble målt ved bruk av fluorimetriske Caspase 3 Assay Kit fra Sigma-Aldrich ( Cat. No. CASP3F) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, 10
4 celler /brønn i en 96-brønners plate ble behandlet med DZNep og /eller gemcitabin i 72 timer. Cellene ble deretter lysert og inkubert på is i 15-20 min. Etter tilsetning av analysebuffer inneholdende Ac-DEVD-AMC substrat, ble prøver overført til en sort 96-brønners plate, og fluorescens ble avlest hvert 10 min i 1 time ved romtemperatur (360 nm eksitasjon, 460 nm emisjon). Den passende tomt (reaksjonsblandingen), positiv kontroll (caspase 3), og negativ kontroll (caspase 3+ caspase 3-hemmer) ble også gjennomført.
.
interaksjonsstudier
kombinasjonen indeks tomter for DZNep og gemcitabin ble estimert ved hjelp av metode utviklet av Chou og Talalay og CalcuSyn programvare [26].
Nukleosid- opptak i celler og
Xenopus
oocytter
Disse prosedyrene ble utført som tidligere beskrevet [27], [28].
generasjon av
Xenopus
Oocyte Expression konstruerer
De helaftens IMAGE cDNA kloner av transportørene (hENT1: klone ID 3010092, tiltredelses BC008954; hENT2: klone ID 9051840, tiltredelse BC143335, hCNT1: klone ID 8991920, tiltredelse BC 126 204, hCNT3: klone ID 7939668, tiltredelse BC093823) ble oppnådd fra Open Biosystems (Huntsville, Alabama) . Subkloning av genene inn i
Xenopus
eggcelle uttrykk vektor, kopper, ble gjennomført ved hjelp av primer sett utpekt i tabell 1.
Western blotting
Western blotting var utført som tidligere beskrevet [25]. De polyklonale kanin anti-histon H3K4TM, H3K9MM, H3K9DM, H3K27MM, H3K27DM, H4K20DM, og H4K20TM var fra Millipore (Billerica, Massachusetts), så vel som polyklonale kanin anti-EED-antistoff. Også oppnådd fra Millipore var mus-monoklonale anti-histon H3K9TM, H3K27TM, og H4K20MM antistoffer, så vel som muse-monoklonalt anti-EZH2 (klon BD43) og anti-SUZ12 (klon 3C1.2) antistoffer. De kanin polyklonale anti-JMJD1A og anti-JMJD2C antistoffer ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. Musen monoklonalt anti-β-actin antistoff ble også kjøpt fra Sigma-Alrich, og HRP-konjugerte sekundære antistoffer var fra Bethyl Laboratories (Montgomery, Texas).
Syntese av Parent Nukleosider og Derivater
troxacitabin og dens lipofile prodroge, som tidligere beskrevet (forbindelse 2K [29]; forbindelse 6 H [30]; C
24 H
41N
3o
5), ble oppnådd fra Dr. Chung K . Chu (University of Georgia). Syntesen av en DZNep analog begynte fra D-ribose. D-ribose ble behandlet med 2,2-dimetoksypropan i nærvær av en katalytisk mengde av
p
-toluensulfonsyre for å gi en isopropyliden-derivat, etterfulgt av beskyttelse av den primære alkohol med trifenylmetylklorid. Det beskyttede laktol ble deretter omsatt med vinylmagnesiumbromid for å gi en enkelt diastereomericdiol, som deretter ble beskyttet med TBDMS bare ved den allyliske hydroksylgruppen stilling, hvorved man silyldienol. For å innlemme en annen dobbeltbinding for ringlukningsmetatese reaksjonen ble det beskyttede sekundære alkohol oksyderes til et keton ved Swern oksydasjon, etterfulgt av en Wittig-reaksjon med metyltrifenylfosfoniumbromid og n-BuLi for å gi dien. Silylgruppen fra dienet ble fjernet med TBAF for å gi en mindre sterisk krevende dienol, som deretter ble omdannet til cyclopentenol med en andre-generasjons Grubbs katalysator i godt utbytte. For å utføre Mitsunobu-kobling, bis-Boc-3-deaza-adenin ble fremstilt. Mitsunobu-kobling ga den ønskede N-9-isomeren som et hovedprodukt. Fjerning av beskyttelsesgrupper som bruker 2 N HCl i metanol produsert DZNep. Tre alkoholgrupper DZNep var beskyttet med TBS som ble byttet ut til de to amid forløpere (karbonkjeder av C6-C8) ved acylering av N
6-NH
2-gruppen. Forbindelsen ble endelig fullt avbeskyttet ved TBAF å gi DZNep prodrug 1 (C
20H
29ClN
4O
4) og DZNep Prodrog 2 (C
18H
24N
4O
4). Syntesene prosedyrer og fysiokjemiske karakterisering av forbindelsene skal brukes i andre sammenhenger.
Nanopartikkel Formulering
Alle kjemikalier ble innkjøpt fra Sigma Aldrich og anvendt uten ytterligere rensing med mindre annet er angitt. PLGA-COOH med en grenseviskositet på 0,18 dl /g ble innkjøpt fra Lactel. Den (5-karboksypentyl) trifenylfosfoniumbromid (TPP) kation ble syntetisert i henhold til metoder innen litteraturen [31]. HO-PEG-OH med en molekylvekt på 3350 g /mol ble kjøpt fra Sigma Aldrich. DSPE-PEG-COOH med en molekylvekt på 2000 g /mol ble anskaffet fra Avanti Polar Lipids. Polyvinylalkohol (PVA) med en gjennomsnittlig molekylvekt på 10,000-26,000 ble kjøpt fra Alfa Aesar. Destillert vann ble renset ved passasje gjennom en Millipore Milli-Q Biocel vannrensesystem (18.2 Megohm) med et 0,22 um filter. HPLC-analyser ble utført ved hjelp av en Agilent 1200-serien instrument. Størrelse og zeta potensialet målinger ble utført på en Malvern Zetasizer Nanoseries instrument. Gelpermeasjonskromatografi (GPC) data ble oppsamlet på et Shimadzu LC20-AD Prominens væske chromatographer. Alle NMR-spektra ble registrert på et Varian MHz NMR-400. TEM bildene ble tatt på en Tecnai 20 FEM mikroskop. Ultralyd ble utført på en Misonix S-4000 Ultralyd væske prosessor.
Syntese av PLGA-
b
-PEG-OH
Syntese av PLGA-PEG-
b
-OH ble utført som tidligere beskrevet [32].
Syntese av PLGA-
b
-PEG-TPP
Syntese av PLGA-PEG-
b
-TPP ble utført som tidligere beskrevet [32].
Syntese av gemcitabin Encapsulated Nanopartikler (Gem-PLGA-
b
-PEG-OH-NPs)
Gemcitabin (10 mg /ml i nanorent H
2o) ble emulgert med PLGA-
b
-PEG-OH (5 mg i CH
2 Cl
2) ved hjelp av sonde sonikering i ett minutt (Amplitude: 40% av 600 W effekt, Puls: 1 sek på, 1 sek av). Den primære emulsjonen ble emulgert igjen ved tilsetning av vann-i-olje-emulsjonen til 2 ml nanorent vann inneholdende 0,5% polyby 8 ml nanorent vann inneholdende 0,05% PVA og sonikert ved anvendelse av betingelsene nevnt ovenfor. Organiske løsningsmiddel ble fjernet ved å vaske tre ganger ved anvendelse av en Amicon filtreringsmembran med et 100 kDa cut-off. NPS ble resuspendert i nanorent vann, og lagret ved 4 ° C inntil videre anvendelse. Dynamisk lysspredning (DLS) målinger ble utført for å bestemme størrelse, polydispersitetsindeks (PDI), og zeta-potensialet av NPS. NPs ble karakterisert ved hjelp av TEM på en akselerasjon spenning på 200 kV. TEM Prøvene ble fremstilt ved å avsette 8 mL av NPS (5 mg /ml) på et 200-mesh karbonbelagt kobbergitter. Prøvene ble strøket bort etter 15 min og nett ble negativt farget med steril 2% (w /v) uranylacetat vandig oppløsning i 15 min.
Syntese av DZNep Encapsulated Nanopartikler (DZNep-PLGA-
b
-PEG-OH-NPs)
DZNep (10 mg /ml i nano H
2o) ble emulgert med PLGA-
b
-PEG-OH (5 mg i CH
2 Cl
2) ved hjelp av sonde lydbehandling i ett minutt (Amplitude 40% av 600 W effekt, Puls: 1 sek på, 1 sek av). Den primære emulsjonen ble emulgert på nytt ved tilsetning av den ovenfor dannede vann-i-olje-emulsjonen til 2 ml nanorent vann inneholdende 0,5% PVA og sonikert under anvendelse av lignende betingelser. Til slutt ble denne emulsjon re-emulgeres ved hjelp av 8 ml nanorent vann inneholdende 0,05% PVA i henhold til ultralydbehandling ved bruk av lignende betingelser som før. Organiske løsningsmiddel ble fjernet ved å vaske tre ganger ved anvendelse av en Amicon filtreringsmembran med et 100 kDa cut-off. NPS ble resuspendert i nanorent vann, og lagret ved 4 ° C inntil videre anvendelse. DLS-målinger ble utført for å bestemme størrelse, polydispersitetsindeks (PDI), og zeta-potensialet av NPS. NPs ble karakterisert ved hjelp av TEM som nevnt ovenfor.
Syntese av gemcitabin og DZNep Encapsulated NPs (Gem-DZNep-PLGA-
b
-PEG-OH-NPs)
Gemcitabin og DZNep co-innkapslet PLGA-b-PEG-OH NPS skulle følge den nøyaktige fremgangsmåten nevnt ovenfor, bortsett fra det første trinn hvor DZNep (10 mg /ml i nanorent H
2o) og Gemcitabin (10 mg /ml i nanorent H
2o) ble emulgert med PLGA-PEG-OH (5 mg i CH
2 Cl
2). Organiske løsningsmiddel ble fjernet ved å vaske tre ganger ved anvendelse av en Amicon filtreringsmembran med et 100 kDa cut-off. NPS ble resuspendert i nanorent vann, og lagret ved 4 ° C inntil videre anvendelse. DLS-målinger ble utført for å bestemme størrelse, polydispersitetsindeks (PDI), og zeta-potensialet av NPS. NPs ble karakterisert ved hjelp av TEM som nevnt ovenfor.
Syntese av Controlled Release Gem-DZNep-PLGA-
b
-PEG-TPP-NPs
gemcitabin (10 mg /ml i nano H
2o) ble emulgert med PLGA-
b
-PEG-TPP (5 mg i CH
2 Cl
2) ved hjelp av sonde lydbehandling i ett minutt (Amplitude: 40% av 600 W effekt, Puls: 1 sek på, 1 sek av). Den primære emulsjonen ble emulgert igjen ved tilsetning av vann-i-olje-emulsjonen til 2 ml nanorent vann inneholdende 0,5% PVA og sonikert under anvendelse av lignende betingelser. Endelig er denne emulsjon ble emulgert ved hjelp av 8 ml nanorent vann inneholdende 0,05% PVA og DZNep (10 mg /ml i nanorent H
2O) under ultralydbehandling ved anvendelse av betingelser som er nevnt ovenfor. Organiske løsningsmiddel ble fjernet ved å vaske tre ganger ved anvendelse av en Amicon filtreringsmembran med et 100 kDa cut-off. NPS ble resuspendert i nanorent vann, og lagret ved 4 ° C inntil videre anvendelse. DLS-målinger ble utført for å bestemme størrelse, polydispersitetsindeks (PDI), og zeta-potensialet av NPS. NPs ble karakterisert ved hjelp av TEM som nevnt ovenfor.
Syntese av Controlled Release Gem-DZNep-DSPE-PEG-OH-NPs
gemcitabin (10 mg /ml i nano H
2o) ble emulgert med PLGA-b-PEG-OH (5 mg i CH
2 Cl
2) ved hjelp av sonde lydbehandling i ett minutt (Amplitude: 40% av 600 W effekt, Puls: 1 sek på, 1 sek av) . Den primære emulsjonen ble emulgert igjen ved tilsetning av vann-i-olje-emulsjonen til 2 ml nanorent vann inneholdende 0,5% PVA og sonikert ved anvendelse av betingelsene nevnt ovenfor. Denne emulsjonen ble ytterligere emulgert ved hjelp av 8 ml nanorent vann inneholdende 0,05% PVA, 0,1% DSPE-PEG-COOH, og DZNep (10 mg /ml i nanorent H
2O) under sonikering anvendelse av de samme betingelser som nevnt ovenfor. Organiske løsningsmiddel ble fjernet ved å vaske tre ganger ved anvendelse av en Amicon filtreringsmembran med et 100 kDa cut-off. NPS ble resuspendert i nanorent vann, og lagret ved 4 ° C inntil videre anvendelse. DLS-målinger ble utført for å bestemme størrelse, polydispersitetsindeks (PDI), og zeta-potensialet av NPS. NPs ble karakterisert ved hjelp av TEM som nevnt ovenfor.
Lasting og Innkapsling Effektivitet av gemcitabin og DZNep i NPs
gemcitabin og DZNep lasting og innkapsling effektivitet (EE) ble bestemt ved å løse polymerkjerne i 0,1 M NaOH og kvantifisere mengden av terapeutisk i NPS ved hjelp av HPLC (elueringsmiddel: acetonitril med 20% H
2O og 0,1% trifluoreddiksyre, Bølgelengde anvendt.: 270 nm
Slippkinetiske studier av DZNep /gemcitabin NPS
NPs ble plassert i Slide-A-Lyzer® MINI dialyse enheter med en MW cutoff på 10.000 g /mol. Prøvene ble dialysert mot 1 x PBS (6,0 L) i en konstant temperatur shaker ved 37 ° . C og 35 opm ved en rekke forhåndsbestemte tidspunkter ble prøver fjernet og gemcitabin /DZNep innholdet~~POS=HEADCOMP ble bestemt ved å oppløse den polymere kjerne i 0,1 mmol NaOH og kvantifisering ved HPLC-analyse (mobil fase: acetonitril med 20% H
2o og 0,1% trifluoreddiksyre, Wavelength brukt: 270 nm)
Statistiske analyser
for tilfeller der bare to forholdene ble sammenlignet, ble studentens t-test som brukes til å identifisere signifikante forskjeller.. I tilfeller hvor tre eller flere betingelser ble sammenlignet, ble enveis ANOVA utført, etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest. Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger. Med mindre annet er angitt,
p
0,05 og
p
. 0,01 sammenlignet med kontrollforhold er representert med ett og to stjerner, henholdsvis
Resultater
DZNep selektivt komplementerer Gemcitabine cytotoksisitet i kreft~~POS=TRUNC men ikke normalt bukspyttkjertelen celler
Vi begynte med å studere cytotoksisitet av DZNep på normale og kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer. Behandling med økende konsentrasjoner av DZNep (0,1 nM-100 pM) viste en signifikant reduksjon i cellelevedyktigheten i alle seks bukspyttkjertelcancercellelinjene som ble testet (dvs. BxPC-3, CAPAN-1, L3.6pl, ASPC-1, MIA PaCa- 2, PANC-1) (fig. 1A). Cytotoksisitet ble observert å starte ved omtrent 0,5-1 uM DZNep, avhengig av cellelinjen, og økes gradvis ved høyere konsentrasjoner deretter. Cytotoksisitet ikke begynne før -48 timer med behandling (data ikke vist). Maksimal reduksjon i celle levedyktighet (~ 50% reduksjon med 10 mm DZNep i 72 timer) ble observert i dårlig differensiert MIA Paca-2 som bare er marginalt gemcitabin-sensitive (Fig. 1a). I subsammenflytende celler, er effekten av DZNep på MIA PACA-2 var nesten lik den til gemcitabin (Fig. 1C). DZNep viste mye lavere cytotoksisitet i godt differensiert, gemcitabin-sensitive bukspyttkjertelkreft cellelinjer (dvs. BxPC-3, CAPAN-en, L3.6pl) sammenlignet med gemcitabin (Fig. 1C). Av notatet, ble det ikke observert signifikante endringer i spredning og cellelevedyktigheten til normal human bukspyttkjertel ductal epitel (HPDE) celler (opp til 10 mikrometer DZNep i 72 timer) som er svært gemcitabin-sensitive, samt to andre normale cellelinjer ( 293T (human embryonisk nyre) og MCF-10A (human bryst epitelial)) (fig. 1A-B, S1). Disse resultatene viser at DZNep selektivt formidler cytotoksiske effekter (dårlig differensierte) kreft i bukspyttkjertelen celler uten betydelig svekkelse av spredning i normale bukspyttkjertelen epitelceller.
A. Alle kreftcellelinjer utenom normal HPDE er DZNep-responsive og redusert cellulær levedyktighet. B. DZNep og gemcitabin vises antagonistiske effekter i HPDE. C. DZNep og gemcitabin vist additive eller synergistiske virkninger i mange av kreft pankreatiske cellelinjer. Tjuefire timer etter 3 x 10
3-celler /brønn ble sådd ut i en 96-brønners plate, ble cellene behandlet med enten DZNep, gemcitabin, eller en kombinasjon av begge ved et ekvimolart forhold i 72 timer. Cellulær levedyktighet ble målt ved anvendelse av et MTT-assay. Cytotoksiske IC
50 verdiene er angitt. Betydninger mellom gemcitabin og DZNep samt DZNep + gemcitabin og DZNep ble identifisert ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Tukey post-hoc test. Kombinasjon indeks (CI) tomter (innfellinger) viser samspillet mellom de to stoffene. CI 1, antagonisme; CI = 1, additivity; CI 1, synergisme. Stolpediagrammene til høyre angir den relative caspase-3 aktivitet (RCA) for hver behandling som målt ved fluorescens intensitet. Verdier var bakgrunnen korrigert og er presentert som fold-endring fra kontrollen. Betydningen mellom et enkelt medikament mot medikamentkombinasjonen ble identifisert via enveis ANOVA etterfulgt av Tukey post-hoc analyse. Celler ble behandlet med 1 uM DZNep, 100 nM gemcitabin, eller begge deler.
Barer
, SD.
n
= 3. *
p
0,05, **
p
. 0,01
Oppmuntret av den potensielle evne DZNep for å kompensere for nukleosid-analog ildfasthet i bukspyttkjertelkreft, vi co-behandlede celler med DZNep og gemcitabin ved ekvimolare forhold og sammenlignet de cellulære viabilities med de som ble oppnådd når cellene ble behandlet med enten DZNep eller gemcitabin alene. Interessant, viste samtidig behandling betydelig høyere reduksjon i cellulære viabilities av de fleste av gemcitabin-sensitive og ufølsomme kreftceller enn når forbindelsene ble brukt som frittstående agenter (Fig. 1C). Omvendt, ko-behandling redusert cytotoksisitet (mer enn to gangers ved 100 nM konsentrasjon) i HPDE (figur 1B.), Noe som tyder på en cytobeskyttende rolle DZNep bare i normale celler
Vi beregnet kombinasjonsindeksen (. KI) tomter [26] for å identifisere hvilken type samhandling mellom DZNep og gemcitabin. Disse beregninger identifiserte en synergistisk eller additiv interaksjon mellom DZNep og gemcitabin (100 nM-10 uM) i alle bukspyttkjertelcancercellelinjer med det eneste unntak av ASPC-1, så vel som en sterk antagonistisk interaksjon i normal HPDE (Fig. 1C). Samtidig behandling av DZNep (1 nM-10 uM) med ulik gemcitabin konsentrasjoner (1-100 nM) viste at DZNep potenserer cytotoksisitet i en gemcitabin doseavhengig måte i marginalt gemcitabin-sensitive MIA PACA-2, mens en slik potensiering skjedde i en stor grad gemcitabin dose-uavhengige mote i svært gemcitabin-sensitive CAPAN-1 celler (fig. S2). HPDE forble cytotoksiske til gemcitabin, bekrefter motsetning mellom de to forbindelsene (fig. S2). Videre interaksjonsanalyse med ulike prosenter av gemcitabin: DZNep (01:01, 01:04, 04:01, 01:10, 10:01) identifisert et maksimalt synergistisk og cytotoksiske respons i MIA Paca-2 med 1:10 ratio ( fig. S3). Til slutt, for å forstå mekanismen for reduksjon av cellulær levedyktighet, gjennomførte vi caspase-3-baserte analyser apoptose. Resultatene (Fig. 1C) identifisert et betydelig induksjon av apoptose som en viktig medvirkende mekanisme for DZNep-indusert økning i gemcitabin cytotoksisitet (Fig. 1C).
Nukleosidnaive Vogner Tilrettelegge Cellular Entry av DZNep
Siden DZNep er en hydrofil nukleosid analog med en log P av -1,38 [5], hypotese vi at den trer i cellene vil avhenge av uttrykk for nukleosid transportører, og derfor ville det mangel på tilstrekkelig bære uttrykk begrense cellulær aktivitet. For å teste dette, utførte vi en konkurransedyktig analyse ved å vurdere graden av hemming i cellulære transport av nukleosider med DZNep. Vi valgte PANC-1 og MIA PACA-2-cellelinjer for disse studiene, fordi de har blitt rapportert for å uttrykke flere nukleosid-transportører [33]. Transport analyse identifisert en betydelig hemming av
3H-adenosin og
3H-guanosin (puriner) transport, men ikke
3H-tymidin (pyrimidin) (Fig. 2A). Gemcitabin transport i begge celletyper ble kun inhibert ved en høyere konsentrasjon (200 uM) (Fig. 2A). Disse dataene antyder at DZNep cellular tilstrømningen er tilrettelagt av purin, men ikke pyrimidin, nukleosid transportører.
A. DZNep hindret opptak av radiomerkede purinnukleosider i PANC-en og MIA PACA-2. Tjuefire timer etter 5 x 10
4 celler /brønn ble sådd ut i en 24-brønners plate, ble cellene tillatt for opptak den indikerte radiomerkede nukleosid i nærvær av DZNep eller dens respektive umerket nukleosid. B. Hemming av adenosin transport i
Xenopus
oocytter med DZNep. C. Farmakologisk hemming av hENT1 og overflødig uridine redusert cytotoksisitet av DZNep i MIA PACA-2. Tjuefire timer etter 3 x 10
3-celler /brønn ble sådd ut i en 96-brønners plate, ble cellene behandlet med økende konsentrasjoner av DZNep i nærvær av DMSO (kontroll), 10 uM NBMPR, eller 200 uM uridin. Cellulær levedyktighet ble målt ved anvendelse av et MTT-assay. IC
50 verdiene er angitt. Signifikante forskjeller mellom kontroll og hver behandling ble bestemt ved bruk av Students t test.
Barer
, SD.
n
= 3. *
p
0,05, **
p
. 0,01
For ytterligere å karakterisere identitet purinnukleosidet transportører medier DZNep tilstrømningen, undersøkte vi muligheten for DZNep å hemme
3H-adenosin transport i
Xenopus
oocytter uttrykker enkelte transportører. En signifikant inhibering av hENT1- og hCNT3-mediert
3H-adenosin transport ble observert, mens en signifikant inhibering av hCNT2-mediert
3H-adenosin transport ble lagt merke bare ved høyere (200 pM) konsentrasjon (Fig. 2B ). Ingen signifikant reduksjon i adenosin transport av DZNep ble observert i hENT2-uttrykke eggceller.
Neste, for å studere virkningen av hENT1 og hCNT3 på DZNep-mediert cytotoksisitet i kreft i bukspyttkjertelen celler, undersøkte vi spredning av MIA PaCa- 2, i nærvær av en inhibitor av farmakologisk hENT1 (10 nM NBMPR) eller overskudd av uridin (200 uM) som kompetitivt hemmer alle entene og CNTs. Våre resultater viser at begge forholdene kan redusere DZNep cytotoksisitet av MIA PACA-2, som bedømmes av økninger i cytotoksiske IC
50 estimater (2-8 ganger) (Fig. 2C).
Acyl Derivatisering av DZNep forsterker Sensibilisering av bukspyttkjertelen celler til gemcitabin
Siden DZNep minst delvis benytter transportører for å utøve sitt fulle potensial, er det sannsynlig at transporter-mangel pasienter kan respondere dårlig på DZNep. For å omgå dette problemet, genererte vi polare acylderivater av DZNep (Fig. 3A) ved hjelp av en syntetisk prosedyren beskrevet i
Materialer og metoder
. Vi byttet DZNep på N
6-NH
2 gruppe med acyl sidekjeder å generere to lipofile forløpere (prodrug 1: C
20H
29ClN
4O
4 prodrug 2 : C
18H
24N
4O
4). De syntetiserte prodrugs ble evaluert for sin anti-proliferative aktiviteter, både alene og i kombinasjon med gemcitabin, i en normal (HPDE), gemcitabin-sensitive (CAPAN-1), og gemcitabin-resistente (MIA PACA-2) cellelinje.
