Abstract
bukspyttkjertelen og duodenal homeobox-en (PDX-1) er en transkripsjonsfaktor som regulerer insulin uttrykk og holme vedlikehold i voksen bukspyttkjertelen. Våre nyere studier viser at PDX-en er et onkogen for kreft i bukspyttkjertelen og er overuttrykt i bukspyttkjertelkreft. Hensikten med denne studien var å demonstrere at PDX-1 er et terapeutisk mål for både hormonelle symptomer og tumorvolum i musemodeller for kreft i bukspyttkjertelen, insulinoma og holmen neoplasi. Immunhistokjemi av menneskelige bukspyttkjertelen og holme neoplasi prøver åpenbart merket PDX-en overekspresjon, noe som tyder PDX-en som en «drugable» target innenfor disse sykdommene. For å gjøre dette, en roman RNA interferens effektor plattform, bifunctional shRNA
PDX-1, ble utviklet og studert i mus og humane cellelinjer så vel som i mus modeller av kreft i bukspyttkjertelen, insulinoma og holmen neoplasi. Systemisk levering av bi-shRNA
humanPDX-1 lipoplexes resulterte i markert reduksjon av tumorvolum og forbedret overlevelse i en menneskelig kreft i bukspyttkjertelen xenograft mus modell. bi-shRNA
mousePDX-1 lipoplexes forhindret død av hyperinsulinemi og hypoglykemi i en insulinom musemodell. shRNA
mousePDX-1 lipoplexes reverseres hyperinsulinemi og hypoglykemi i en immun-kompetente mus modell av holmen neoplasi. PDX-en ble overexpressed i bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster og nesidioblastosis. Disse data viser at PDX-en RNAi terapi styrer hormonelle symptomer og tumorvolum i musemodeller for kreft i bukspyttkjertelen, insulinoma og holme neoplasi derfor PDX-1 er et potensielt terapeutisk mål for disse bukspyttkjertelsykdommer
Citation.: Liu SH, Rao DD, Nemunaitis J, Senzer N, Zhou G, Dawson D, et al. (2012) PDX-1 er en terapeutisk mål for kreft i bukspyttkjertelen, Insulinom og Islet neoplasi Ved hjelp av en Novel RNA interferens Platform. PLoS ONE 7 (8): e40452. doi: 10,1371 /journal.pone.0040452
Redaktør: John J. Rossi, Beckman Research Institute of the City of Hope, USA
mottatt: May 15, 2012; Godkjent: 07.06.2012; Publisert: 08.08.2012
Copyright: © Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av stipend R01-DK46441 fra National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer; Tilskuddet R01-CA095731 fra National Cancer Institute; den Alkek Foundation; Vivian L. Smith Foundation; MD Anderson Foundation; og generøsitet av Bill og Olivia Heintz familie. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. D. Rao, N. Senzer, Z. Wang og N. Templeton er ansatt av Gradalis, Inc. følgende forfattere er aksjonærer i Gradalis, Inc .: N. Senzer, FC Brunicardi, D. Rao og J. Nemunaitis. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
bukspyttkjertelen og duodenal homeobox-en (PDX -1) er en transkripsjonsfaktor som spiller en kritisk rolle i å regulere embryologic bukspyttkjertel utvikling, så vel som i insulin uttrykk og islet vedlikehold i voksen bukspyttkjertel [1], [2], [3], [4]. PDX-en knockout er dødelig i mus og mutasjon av PDX-1 fører til modne inntreden av diabetes i unge (Mody subtype IV) i mus og humane pasienter [5], [6]. Vedvarende overekspresjon av PDX-1 fører til acinar til ductal celle metaplasi i mus [7]. Overekspresjon av PDX-1 i cellelinjer resulterer i transformasjon av ikke-insulin-produserende celler i insulinproduserende celler ved GLP-1-stimulus [8], [9], [10], [11], [12], [13 ]. PDX-1 er kjent som en viktig regulator for mange pankreatiske endokrine gener som insulin [1], [2], [3], [4], glukokinase [14], islet amyloid polypeptid [15], [16], [17], glukosetransportør type 2 [GLUT2] [18], [19], pankreatisk polypeptid [20] og somatostatin [21], [22], og har derfor en avgjørende rolle i å opprettholde glukosehomeostase.
Vårt nylige studier viser at PDX-1 er et onkogen [23], [24]. Det er markant overuttrykt i bukspyttkjertelkreft [23], [25], [26], [27] og regulerer spredning og invasjon av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro Hotell og
in vivo
i mus [23]. PDX-1 overekspresjon i benigne og maligne celler resulterte i økt tumordannelse når disse cellene blir implantert i mus [24]. Systemisk levering av shRNA
humanPDX-1 lipoplexes medførte en markant reduksjon av tumorvolum og forlenget overlevelse i en menneskelig kreft i bukspyttkjertelen xenograft mus modell [23].
Vårt team har utviklet en ny bifunctional RNA interferens plattform hvor oversettelse av målet mRNA er undertrykt via både cleavage uavhengig og cleavage avhengig RISC lasting veier, noe som resulterer i differensial Argonaut innlemmelse og separate, men koordinerte, målrette inaktive mekanismer [28].
i denne studien, en roman RNAi effektor plattformmålretting PDX-1 ble utviklet og studert i humane og musecellelinjer, så vel som i musemodeller for kreft i bukspyttkjertelen, insulinoma og holmen neoplasi for å bestemme hvorvidt PDX-1 er et potensielt terapeutisk mål for kontroll av både hormonelle symptomer og tumorvolumet i disse bukspyttkjertel sykdommer.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
SCID mus ble plassert i et BL-4 anlegg og ivaretatt i samsvar med retningslinjene i
Stell og bruk av forsøksdyr
utarbeidet av institutt for laboratorie Animal Resources, Commission on Life Science, National Research Council og forsøksdyr~~POS=TRUNC for Baylor College of Medicine. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk på Baylor College of Medicine. (Permit Number: AN 2404)
Menneskelige prøvene ble mottatt under en menneskelig protokoll som ble godkjent av Institutional Review Board ( IRB) fra Baylor College of Medicine (Permit Number: H 14054); Prøvene ble behandlet strengt i henhold til de prosedyrer som diktert av nevnte protokoll. Alle menneskelige bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster og nesidioblastosis prøver ble avidentifisert prøver tatt med IRB samtykke (H 14054) og informert skriftlig samtykke.
Cellelinjer, vektorer, og antistoffer
Mus βTC-6 og human bukspyttkjertelkreft cellelinje cellelinjer PANC-1 ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) og tidligere rapportert [29]. Menneske pankreas nevroendokrine svulster prøver og menneskelige nesidioblastosis prøvene ble vennlig levert av Dr. David Dawson fra Avdeling for patologi ved UCLA og Dr. Milton Finegold ved Institutt for patologi ved Texas barnesykehus, henholdsvis. Mouse PDX-en shRNA (shRNA
mousePDX-1) er designet som tidligere beskrevet [23]. Bi-funksjonell mus (bi-shRNA
mousePDX-1) og human PDX-en (bi-shRNA
humanPDX-1) ble innhentet fra Gradalis Inc (Dallas, TX). Prip-mCherry_CMV-EGFP og Prip-mCherry _CMVeGFP_H1-shRNA
mousePDX-en ble subklonet basert på den overordnede vektor RIP-mCherry-NLS-mCherry som ble gitt av Dr. Michael Mancini fra Baylor College of Medicine. Geit-anti-kanin-antiserum og sau anti-mus antiserum konjugert med pepperrot-peroksydase ble ervervet fra Amersham (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL). Kanin anti-geit IgG ble hentet fra Zymed (Zymed Laboratories, Inc. South San Francisco, CA, USA).
Transfeksjon og reporter analysen
β TC-6 eller PANC-1 celler ble platet inn i 10 cm cellekulturplater ved 1 x 10
6 celler pr tallerken eller 24-brønners plater ved 1 x 10
5-celler /brønn og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Transfeksjon analysene ble utført ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Fluorescens signaler ble observert og telt ved bruk av fluorescens mikroskopi som tidligere beskrevet [23] for å bestemme reporter aktiviteter.
analysen Celleproliferering
in vitro
Celleproliferering ble bestemt av MTS assay (Promega, Madison, WI) og BrdU innlemme assay (kolorimetrisk) (Roche Diagnosistics GmbH, Mannherim, Tyskland) ved 12, 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon. Absorbans ble avlest i et Multiskan EX plateleser (Thermo Electronic Corp, Franklin, MA) ved 492 nm for MTS og 500 nm for BrdU-analyse og nivåer av proliferasjon ble beregnet som tidligere beskrevet.
Western blot-analyser
Førtiåtte åtte~~POS=HEADCOMP timer etter transfeksjon, som tidligere beskrevet [23], βTC-6-celler ble samlet og lysert i RIPA buffer. Tjue (20) ug av cellelysater ble påført SDS-PAGE-gel for elektroforese. Proteinet ble deretter overført til membraner for å bli probet med forskjellige antistoffer mot PDX-1, cyclin D1, cyklin E, Cdk2, Cdk4, og p27. Immunkomplekser ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens (ECL) deteksjon ved hjelp av pepperrot konjugert sekundære antistoffer.
Dyr og shRNA levering
SCID-mus ble plassert i et BL-4 anlegg og omsorg i samsvar med retningslinjer i
Stell og bruk av forsøksdyr
utarbeidet av institutt for laboratorie Animal Resources, Commission on Life Science, National Research Council og forsøksdyr~~POS=TRUNC for Baylor College of Medicine. DNA-doser ble bestemt ved å møte kriteriene på mindre enn 10% mus døde etter injeksjon av liposomal shRNA-kompleks i vanlige SCID-mus. Hannmus, i alderen 8 til 10 uker gamle, ble inokulert med 1 × 10
6 beta TC-6 eller PANC-1 celler per mus via intraperitoneal (ip) injeksjon. To uker senere, enten beta TC-6 eller PANC-1 mus ble tilfeldig gruppert (30 mus per gruppe), og den første syklusen av shRNA
mousePDX-en eller bi-shRNA
mousePDX-en eller bi-shRNA
humanPDX-1, respektivt, ble gitt via haleveneinjeksjon. Dette regimet ble på dag 14 og 28 for totalt tre injeksjoner. Den samme protokollen ble brukt til SSTR
1/5
– /- mus bruker 3 sykluser med 35 mikrogram shRNA
mousePDX-en. De shRNA lipoplexes ble fremstilt som tidligere beskrevet [23].
Insulin og glukosemålinger
På dagene 7, 21, 35 og 120 etter hver genavlevering, 50 pl fullblodprøver ble oppsamlet og sentrifugert for å separere serumet. Glukosenivåer ble målt ved anvendelse av et Beckman-Coulter Glucose Analyzer 2 (Coulter-Beckman, Fullerton, CA), og presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. i mg /dl. Insulinnivået ble bestemt ved hjelp av en mus insulin ELISA kit fra Mercodia (Linco Research, St. Charles, MO) og presentert som gjennomsnitt ± SEM . I mikrogram /l
Intraperitoneal glukosetoleransetest (IPGTT)
SSTR
1/5
– /- mus på dager 7 og 150 etter første leveranse av shRNA
mousePDX-en ble fastet over natten før innsamling av blodprøver som T
0. Grupperte mus fikk deretter 1,2 g glukose /kg kroppsvekt via ip injeksjon, etterfulgt av samling av blodprøver ved 15, 30, 60 og 120 min etter injeksjon av glukose. Glukose og insulinnivåer ble målt som beskrevet ovenfor.
Nekropsi, vev innsamling, immunhistokjemi og TUNEL assay
De identifiserte humane pankreatiske neuroendokrin tumor og nesidioblastosis prøver ble oppnådd fra Dr. David Dawson og fra Dr. William Fisher for IHC. Muse pankreas, holmer og prøver tumorvev ble oppnådd på dagene 0, 7, 21, 35, og ende tid etter den innledende genavlevering. Peritoneale tumorer ble makroskopisk og mikroskopisk undersøkt og den større (A) og (B) mindre diametere målt og registrert. Tumorvolum (V; en rotasjons ellipsoide) ble beregnet i henhold til formelen: V (mm
3) = A (mm) x B
2 (mm)
2/2. Totalt tumorvolumet ble beregnet ved å sette alle tumorer sammen. Mus ble bedømt i henhold til tilstedeværelse eller fravær av tumor. IHC ble utført som tidligere beskrevet. Anti- PDX-1, insulin, PP, cyklin E, p27, Cdk4 eller PCNA antistoffer ble påført på objektglass med 1:100 fortynning fulgt av inkubering over natten ved 4 ° C. Glassene ble inkubert med Cy3 eller FITC-konjugert anti-kanin, geit eller mus sekundært antistoff avhengig avledning av primære antistoffer for en time, og montert med dekkglass. TUNEL analysen (FragEL ™ DNA fragmentering Detection Kit, Colorimetric-TdT Enzyme, Calbiochem, La Jolla, CA) ble utført i henhold til produsentens protokoll. Frekvensen av apoptose ble uttrykt som forholdet mellom apoptotiske kreftceller til det totale antall endotelceller i 10 felt på x 100 forstørrelse.
Statistical Analysis
uparede Student
t
-test ble anvendt for statistisk analyse av glukosenivåer, insulinnivåer og celleproliferasjon med
P
0,05 indikerer betydning. Den χ
2 test ble brukt for prissammenligning. Rank-loggen ble brukt til mus overlevelse sammenligning. Kaplan-Meier i SPSS 15.0 for MS Windows ble brukt til å plotte overlevelseskurver.
Resultater
PDX-1 er overuttrykt i humane prøver av bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster og nesidioblastosis, samt mus Insulinom celler og en transgen holme hyperplasia musemodell
PDX-en ble overexpressed i 36 menneskelige bukspyttkjertelen og holme neoplasi prøver inkludert 26 bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster (fig. 1a) og 10 nesidioblastosis prøver (fig. 1b). PDX-en også ble overuttrykt i mus insulinom (beta TC-6) celler (Fig. 1c) og i begge holmen og akinærceller av pankreata av somatostatin reseptorsubtypene 1 og 5 knock-out mus (SSTR
1/5
– /-.) (figur 1E, f, henholdsvis) som sammenlignet med villtype mus (fig 1 D).. Disse data viser at PDX-en er betydelig overuttrykt i både human pankreatisk nevroendokrine tumorer, nesiodioblastosis og mus holme neoplasi, noe som tyder det er et potensielt mål for disse sykdommene.
farging med anti-PDX-1-antistoff viser overekspresjon av PDX-1 i humane holme neoplasi prøver (26 pankreas nevroendokrine tumorer (a), 10 nesidioblastosis prøver (b), βTC-6 tumorer (c) og 6 pankreata prøver fra SSTR1- /5
– /- mus (e, f .) PDX-1 er overuttrykt i begge holmer (e) og akinærceller (f) av SSTR1- /5
– /- mus som sammenlignet med villtype mus hvor bare øyceller uttrykt PDX-1 (d). PDX-1 positive er angitt med pilen (× 200).
Målrette PDX-en med bi-shRNA
humanPDX-1 kontroller tumor volum i et menneskelig kreft i bukspyttkjertelen xenograft mus modell
in vitro
studier.
Siden Panc-1 celler er menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler som markant overuttrykker PDX-1, ble disse cellene brukes både
in vitro
og
in vivo
studier. bi-shRNA
humanPDX-en transfeksjon av PANC-1 celler resulterte i knock down av PDX-en. Dette var forbundet med reduksjon av celleproliferasjon med 58%, 40% og 38% sammenlignet med tom vektorkontroll ved 24, 48 og 72 timer post-transfeksjon, respektivt. Det var større hemning av celleproliferasjon enn det som sees med shRNA
humanPDX-1 ved 0,6 ug og 1,2 ug /ml medium doser (fig. 2a, 2b), adressere den potensielle fordel av bi- shRNA
humanPDX- 1 i RNAi terapi for bukspyttkjertelkreft.
MTS analysen viste tidsforløpet av celleproliferasjon for PANC-1 (a) celler transfektert med bi-shRNA
mousePDX-en og bi-shRNA
humanPDX-1, respektivt. En sammenligning av celleproliferasjonsprosesser hemming prosent mellom bi-shRNA og shRNA transfeksjon i forskjellige doser er vist i Panc-1 celler (b).
In vivo
studier.
En PANC-en xenograft SCID mus modell har blitt utviklet og godt studert i vårt laboratorium; når den plasseres intraperitonealt i SCID-mus, PANC-1-celler vokste til store tumorer i løpet av to måneder. To uker etter implantering av cellene, tre sykluser av bi-shRNA
humanPDX-1 lipoplexes (35 ug /mus, administrert intravenøst på dag null, 14 og 28) betydelig redusert PANC-1 tumorvolum med bare noen få mus som har rest tumorer med gjennomsnittlig 51 mm
3 sammenlignet med 100% av kontrollmusene med tumorer med gjennomsnittlig 1199 mm
3 til 90 dager etter behandling (s 0,05, fig. 3a). Overlevelse i behandlingsgruppen var signifikant lenger enn kontrollene (115 ± 9.5d vs 85 ± 1,4 D, henholdsvis, (p = 0,001, Fig. 3b) med ingen signifikant forskjell i overlevelse mellom tom vektor-behandlede mus og ubehandlede mus (85 ± 9d vs 76 ± 8d, p = 0,981). i disse mus med gjen tumorer, tumor PDX-1-ekspresjon ble betydelig redusert fra 95 ± 11,1% til 12 ± 1,3% på dagene 0 og 90 etterbehandling, henholdsvis (fig. 3c topplaten). IHC analyse av rest svulster åpenbart redusert uttrykk for celleproliferasjonsprosesser markører, proliferativ cell nuclear antigen (PCNA) og Cyclin E, (fra 84 ± 9,6% til 15 ± 0,8% og fra 66 ± 10,2% til 9 ± 2,3% henholdsvis;… fig 3c 2
nd og 3
rd paneler), og en økning i P53 uttrykk (fig 3c 4
th panel) Merket apoptose ble sett i rest svulster på dag 90 post- behandling, hvilket antyder de gjenværende tumorene var sammensatt av apoptotiske celler som mangler PDX-1-ekspresjon. (fig. 3c nedre panel). Bemerkelsesverdig tre sykluser av bi-shRNA
humanPDX-1 lipoplexes hadde ingen effekt på systemiske glukose og insulinnivåer , og understreker viktigheten av den artsspesifikt utforming av PDX-en RNAi (fig. S1).
tumorvolum ble evaluert og sammenlignet ved 90 og 120 dager etter den første behandling mellom behandlings- og kontrollgrupper (a). Overlevelse av mus som fikk behandling og av de som mottar den tomme vektor kontroll ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meier i SPSS (b). Farging av tumor lysbilder med PDX-1, PCNA, Cyclin E, og P53 samt TUNEL-analyse ble utført og analysert (c). Den positive for hver markør er angitt med pilen (x 200).
Disse data viser at flere sykluser av systemisk bi-shRNA
humanPDX-1 lipoplexes ble godt tolerert og effektivt redusert human bukspyttkjertelkreft tumor volum og forlenget overlevelse i SCID-mus. Disse dataene viser at PDX-en er et potensielt mål ved hjelp av denne nye behandlingsplattform for den mest aggressive formen for bukspyttkjertel neoplasi.
Targeting PDX-en med bi-shRNA
mousePDX-1 kontroller dreven sekresjon av insulin fra mus insulinoma celler og i en musemodell av insulinoma
in vitro-studier
.
bi-shRNA
mousePDX-1 resulterte i signifikant større knockdown av PDX- 1 uttrykk i beta TC-6 celler i doser på 0,6 mikrogram og 1,2 mikrogram /ml medium enn shRNA
mousePDX-en og tomme vektor kontroller i både western blot (fig 4a; p. 0,05) og immunhistokjemi (IHC) analyserer (fig. 4b topplaten).
Sammenligning av effekten av bi-shRNA
mousePDX-en, shRNA
mousePDX-en eller tom vektor i hemming av PDX-1 uttrykk i β TC-6 cellene er vist ved hjelp av western blot (a) og celle-immunfarging (øvre panel, b som angitt med pil). Insulin ekspresjon og glukosestimulert sekresjon i respons til knockdown av PDX-1 er vist ved celle immunfarging (bunnfelt, b som angitt med pil) (x 200) og ELISA-assay (d), henholdsvis. Hvert eksperiment ble gjentatt fem ganger. PDX-1 og insulin-ekspresjon i immunostained p TC-6-celler kvantifiseres (c). PDX-1 uttrykk påvirket RIP-rettet reporter uttrykk (RIP-mCherry) i βTC-6 celler (e og f). Cellene som uttrykker mCherry (rød) og GFP (grønt) ble visualisert og fotografert ved hjelp av fluorescensmikroskopi (e og f). (× 200).
bi-shRNA
mousePDX-en resulterte i betydelig større hemming av insulin uttrykk og PDX-1 uttrykk enn det som sees med shRNA
mousePDX-en og tom vektor kontrollceller, henholdsvis (figur 4c, p. 0,05, og fig 4b.). Transfeksjon med bi-shRNA
mousePDX-en resulterte i betydelig større hemming av glukosestimulert insulinsekresjon fra β TC-6 celler
in vitro
i forhold til det som ble sett med shRNA
mousePDX-en og tom vektorkontroll ved glukosekonsentrasjoner på 5 og 11 mM (p 0,05), henholdsvis (figur 4d.). Disse funnene tyder på at bi-shRNA
mousePDX-1 hemmer insulin uttrykk og sekresjon via PDX-en knockdown, og gjør det i større grad enn vanlig shRNA
mousePDX-1 i mus Insulinom celler.
for ytterligere å avgrense mekanismen som knockdown av PDX-1 hemmer insulin uttrykk og sekresjon gjennom redusert aktivering av rotte insulin promoter-en (RIP), konstruerer reporter (RIP-mCherry) med eller uten shRNA
mousePDX-en ble transfektert i beta TC-6 celler. RIP-mCherry-H1-shRNA
mousePDX-en førte til betydelig reduksjon i mCherry uttrykk i forhold til at av RIP-mCherry uten shRNA
mousePDX-en (10 ± 1,6% vs 35 ± 8,1% og 12 ± 2,1 % mot 66 ± 13,2% ved 24 timer og 48 timer henholdsvis, p 4e fig); 0,05.. Transfeksjon av RIP-mCherry-CMV-EGFP-H1 viste at 90% av cellene ble vellykket transfektert, noe som gjenspeiles av EGFP uttrykk. I tillegg er 69% av EGFP-uttrykkende celler uttrykte mCherry, og i RIP-mCherry-CMV-EGFP-H1-shRNA
mousePDX-1 transfekterte celler, 88% av cellene uttrykte EGFP; imidlertid bare 12% av cellene uttrykte mCherry (p 0,05, Fig. 4f). Redusert PDX-1 uttrykk ble bekreftet ved hjelp av western blot. Disse dataene antyder at aktivering av insulin arrangøren er betydelig hemmet av shRNA
mousePDX-en via knockdown av PDX-1 uttrykk.
Transfeksjon med bi-shRNA
mousePDX-en inn i β TC-6 -celler resulterte i signifikant suppresjon av celleproliferasjon ved bruk av to forskjellige assay: MTS analysen avslørte reduksjoner på 52%, 38% og 31% sammenlignet med tom vektorkontroll ved 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon, respektivt (figur 5a). og BrdU-inkorporering analysen avslørte reduksjoner på 42%, 35% og 42% ved 12, 24 og 48 timer etter transfeksjon, henholdsvis (figur 5b). (p 0,05 ved alle tidspunkter). bi-shRNA
mousePDX-en resultert i større hemming av celleproliferasjon enn shRNA
mousePDX-en ved lave doser (6 ug /10-cm dish) etter 48 h av transfeksjon (Fig. 5c). Cellesyklus protein analyse viste større nedregulering av positive regulatorer, cyklin E, Cdk2, og Cdk4, og oppregulering av negative regulatorer, p53 og p27, i bi-shRNA
mousePDX-1-behandlede celler sammenlignet tomme vektor kontroller (p 0,05, fig. 5d). Disse data viser at PDX-1 knockdown inhiberer mus insulinoma celleproliferasjon via endringer i cellesyklusproteiner.
MTS-analyse viste tidsforløpet av celleproliferasjon for β TC-6 (a) celler transfektert med bi-shRNA
mousePDX-en og bi-shRNA
humanPDX-en,. En sammenligning av prosentandelene av celleformering inhibering mellom bi-shRNA og shRNA transfeksjon i forskjellige doser er vist i p-TC-6-celler (b). Celleproliferasjon bestemt ved BrdU også er vist (c). Western blot-analyse av 20 ug lysat fra ß TC-6 celler som ble transfektert med shRNAi
mousePDX-1 etter 48 timer ble utført med anti-PDX-1, cyclin E, Cdk2, Cdk4, p53 og p27 (d).
In vivo
studier.
Tidligere vårt laboratorium utviklet en dødelig mus insulinoma modellen, som har blitt godt undersøkt. SCID-mus implantert med muse Insulinom celler og bukke for hyperinsulinemi og hypoglykemi på ca 60 dager. I denne musemodell, tre sykluser med enten intravenøs bi-shRNA
mousePDX-1 lipoplexes (25 ug /mus annenhver uke) eller shRNA
mousePDX-1 lipoplexes (35 ug /mus annenhver uke) forhindret død av hyperinsulinemi og hypoglykemi ( fig. henholdsvis 6a og b, og c og d,). Forbigående hyperglykemi og hypoinsulinemia ble observert, men nivåene gikk tilbake til utgangspunktet på dag 150 etter første behandling i begge behandlingsgruppene. I kontrollgruppen, tom vektor lipoplexes hadde ingen effekt på dødelig hyperinsulinemi og hypoglykemi, som vist i fig. 6a og b.
Blodsukkeret A og C tilsvarer insulin nivåer B og D ble kjøpt fra β TC-6 mus behandlet med bi-shRNAi
mousePDX-en eller shRNAi
mousePDX-en hhv. I hver figur a-d, representerer stiplet linje kontrollgruppen data og stiplet linje representerer behandling gruppedata. Øyceller uttrykker PDX-1, insulin, PP, PCNA, p27, cyklin E og CDK4 ble vist ved IHC og islet celle apoptose ble vist ved TUNEL assay, som vist ved pilene (x 200) (e). Mus overlevelse etter tre behandlingssykler med enten tom vektor eller bi-shRNAi
mousePDX-en og tom vektor eller shRNAi
mousePDX-en ble evaluert og sammenlignet ved hjelp av Kaplan-Meier i SPSS (f).
Total overlevelse i bi-shRNA
mousePDX-en og shRNA
mousePDX-1 behandlingsgruppene var signifikant lengre enn for kontroller (106 ± 7.8d vs 53 ± 1.4D og 146 ± 9.5d vs 53 ± 1.4D, henholdsvis p 0,05 vs kontroller, fig 6f, fig S2)… Det skal bemerkes at ubetydelig forskjell i overlevelse mellom de to behandlingsgruppene var på grunn av tilsiktet oppofrende av den bi-shRNA
mousePDX-en gruppe mus på et tidligere tidspunkt (Fig. S2f). Disse dataene viser at PDX-en knockdown ved hjelp av systemiske bi-shRNA
mousePDX-1 lipoplexes forhindrer effektivt hyperinsulinemiske, hypoglycemic død i en insulinom SCID mus modell; derfor behandlingene kontrollere overdreven hormonutskillelse i forbindelse med denne formen for holmen neoplasi.
Bemerkelsesverdig, systemisk bi-shRNA
mousePDX-en og shRNA
mousePDX-1 lipoplexes føre time hyperglykemi, som representerer en forutsigbar off-target virkning på mus holmer, ettersom PDX-1 er den dominerende regulator av insulin uttrykk. Etter behandling med bi-shRNA
mousePDX-en,
in situ
holmen PDX-1 uttrykk ble redusert i en behandling avhengig måte, fra 88 ± 10,1% på dag 0-71 ± 8,6%, 49 ± 9,7% og 23 ± 6,6% på dagene 7, 21, 35 etter behandlingene, henholdsvis, og vendte tilbake til 83 ± 12,4% på dag 120 etter behandlinger, som vist i fig. 6e, topp panel. Insulin ekspresjon ble også signifikant redusert fra 92 ± 8,3% på dag 0-61 ± 9,8%, 32 ± 5,3%, og 12 ± 1,9% på dag 7, 21, 35 etter behandlingene, henholdsvis, og vendte tilbake til 89 ± 15,3% på dag 120 etter behandlinger, slik som vist i fig. 6e, 2
nd panel. Expression nivåer av PP også sunket betraktelig på de samme tidspunkter etter behandling (Fig. 6e, 3
rd panel). Markører for holme celleproliferasjon, cellesyklusproteiner og apoptose ble også studert før og etter behandling. Holme PCNA ekspresjon signifikant redusert fra 16 ± 1,4% til 10 ± 0,8%, 7 ± 0,6%, 5 ± 0,2% og 14 ± 2,0% på dag 0, 7, 21, 35 og 120 etter behandling, henholdsvis (fig. 6e, 4
th panel). Både IHC og western blot analyser av pankreas seksjoner demonstrerte økende p27 uttrykk og minkende uttrykk for protein nivåer i cyclin E og Cdk4 følgende tre behandlingssykluser (Fig. 6e,
th 5,
th 6 og 7
th paneler, og fig. S3, henholdsvis). bi-shRNA
mousePDX-1 resulterte i en signifikant økning i apoptose av mus øyer fra 1 ± 0,2% på dag 0, til 14 ± 2,4%, 24 ± 3,6%, 42 ± 5,5%, og 10 ± 1,1% i dager 7, 21, 35 og 120 etter behandlinger, henholdsvis (fig. 6e nederst panel). Tom vektorkontrollterapi hadde ingen effekt på islet PDX-1, insulin, PP uttrykk, cellesyklusproteiner og apoptose. Disse dataene er i samsvar med funn sett følgende PDX-en knockdown i muse Insulinom celler
in vitro
. De foreslår også at systemisk bi-shRNA
PDX-1 lipoplexes resultere i tidsmessig, mild hyperglykemi som stråler ut fra undertrykkelse av PDX-en i løpet av de Langerhanske øyer med etterfølgende undertrykkelse av insulin og PP uttrykk, å korrelere med endringer i islet cellesyklusproteiner og økt holme apoptose.
uttrykk for alle holmen markører tilbake til utgangsverdien ved offer, noe som tyder på en evne til reproduksjon av murine holmer, noe som resulterer i normalisering av basal insulin og glukose nivå. Dette er i kontrast til de PANC-1-cellerest svulster som hadde lave nivåer av PDX-1 og med forhøyede apoptose, hvilket antyder en mangel på regenerering. Lignende mønstre av uttrykk for PDX-1, insulin, PP, og cellesyklusproteiner og apoptose i øyceller også ble observert etter tre sykluser med shRNA
mousePDX-1 lipoplexes (Fig. S4). Disse data viser at systemiske bi-shRNA
mousePDX-1 lipoplexes effektivt hindre hypoglykemisk død i en insulinom SCID-musemodell og resultere i
in situ
knockdown av PDX-1 innenfor holmer, som fører til undertrykkelse av insulin ekspresjon og sekresjon og påfølgende hyperglykemi. Bemerkelsesverdig, noen off-target holmen effektene var mild og tidsmessig, noe som tyder på en evne til reproduksjon av murine endokrine bukspyttkjertelen. Siden det er ingen rest Insulinom celler som finnes i denne modellen etter behandling, øyen data viser evne til systemisk levert behandling til knockdown PDX-en i denne modellen.
Systemisk shRNA
mousePDX-1 lipoplexes reversere hyperinsulinemi og hypoglykemi og påvirke glukosetoleransen i somatostatin reseptorsubtypene 1 og 5 (SSTR
1/5
– /-) knockout mus
SSTR1- /5
– /- musemodell ble anvendt som musene representere en immun-kompetente insulinoma-lignende musemodell med overekspresjon av PDX-1 i både akinærceller og øyceller, kjennetegnet med hyperinsulinemi og hypoglykemi. Vi ønsket å finne ut om multiple intravenøse behandlinger ville reversere basal hyperinsulinemi og hypoglykemi og bli tolerert i disse immun-kompetente mus. Tre runder med shRNA
mousePDX-1 lipoplexes (35 ug /mus) ble godt tolerert og betydelig reverseres basal hyperinsulinemi og hypoglykemi i SSTR
1/5
– /- mus (3 ± 0,2 ug /l og 83 ± 19,5 mg /dl på dag 0 og 0,5 ± 0,1 ug /l og 205 ± 25,9 mg /dl på dag 35 etter tre behandlinger, henholdsvis, som vist i figur 5a og b).; tomme vektor lipoplexes hadde ingen effekt på hyperinsulinemi og hypoglykemi (fig. 7a og b). Bemerkelsesverdig, systemiske glukose og insulinnivåer returnerte til basislinjen på dag 150 etter den innledende behandling, hvilket antyder en evne til reproduksjon av disse murine holmer.
Blodsukkernivåer (a) og tilsvarende insulin nivåer (b) ble målt som beskrevet i metoden delen. Farging for bukspyttkjertel lysbilder med PDX-1, ble PCNA og TUNEL analyse utført. Rød farging i toppfelt (c) viser PDX-1-ekspresjonen (pil); grønn farging i det midtre panel (c) viser PCNA uttrykket (pil). Apoptotisk tumorceller fra SSTR1- /5
– /- mus er farget brun og er vist i bunnpanelet (c) (pil) (x 200). IPGTT analysen viste glukosenivåer og insulinnivået (d) på dag 7 og blodsukkeret og insulinnivået (e) på dag 150 etter shRNA
mousePDX-en terapi. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. og P 0,05 indikerer betydning
Intraperitoneal glukosetoleransetester (IPGTT) ble utført på SSTR
1/5
– /- mus på dager 7 og 150 etter.
