Abstract
Molekylær biomarkører for å fastslå effekten av målrettet terapi i kreftbehandling har vært i omfattende bruk i tykk- og endetarmskreft (CRC), men de å forutsi kjemoterapi følsomhet fortsatt dårlig definert. Vi testet vår hypotese om at KRAS mutasjon kan være en prediktor for oksaliplatin følsomhet i CRC. KRAS var slått ned i KRAS-mutant CRC celler (DLD-en
G13D og SW480
G12V) av små interfererende RNA (siRNA) og overuttrykt i KRAS-villtype CRC celler (COLO320DM) av KRAS-mutant vektorer å generere paret CRC celler. Disse sammenkoblede CRC-celler ble testet ved oksaliplatin, irinotekan og 5-FU for å bestemme endringen i medikamentsensitivitet av MTT-analysen og flowcytometri. Grunner for følsomhet endring ble videre bestemt av western blot og sanntids kvantitativ revers transkriptase polymerase chain reaction (QRT -PCR). I KRAS-villtype CRC celler (COLO320DM), KRAS overekspresjon av mutant vektorer forårsaket excision reparasjon kryss-komplemente gruppe 1 (ERCC1) downregulation på protein og mRNA nivåer, og forbedret oksaliplatin følsomhet. I motsetning til i KRAS-mutant CRC celler (DLD-en
G13D og SW480
G12V), KRAS slått ned av KRAS-siRNA førte til ERCC1 oppregulering og økt oksaliplatin motstand. Sensitiviteten av irinotecan og 5-FU hadde ikke endret seg i de sammenkoblede CRC celler. For å validere ERCC1 som en prediktor for følsomhet for oksaliplatin ble ERCC1 slått ned av siRNA i KRAS-villtype CRC celler, som restaurerte oksaliplatin følsomhet. I motsetning til dette ble ERCC1 overuttrykt ved ERCC1-uttrykkende vektorer i KRAS-mutant CRC-celler, og forårsaket oksaliplatin motstand. Samlet sett våre funn tyder på at KRAS mutasjon er en prediktor for oksaliplatin følsomhet i tykktarm kreft celler ved mekanismen av ERCC1 downregulation
Citation. Lin YL, Liau JY, Yu SC, Ou DL, Lin LI, Tseng LH , et al. (2012) KRAS mutasjon en Predictor av oksaliplatin følsomhet i tykktarm kreft celler. PLoS ONE 7 (11): e50701. doi: 10,1371 /journal.pone.0050701
Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, USA
mottatt: 8. mai 2012; Godkjent: 25 oktober 2012; Publisert: 28.11.2012
Copyright: © 2012 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av et stipend fra Department of Health Executive Yuan (DOH100-TD-C-111-001), Taipei, Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
biomarkører for å fastslå behandlingseffekten er undersøkt i tradisjonell kjemoterapi æra, men bare et begrenset antall av biomarkører har blitt funnet så langt. Eksempler er excision reparasjon kryss-komplementering gruppe 1 (ERCC1) uttrykk for å forutsi motstanden av oksaliplatin [1], og tymidylatsyntase (TS) uttrykk for å bestemme 5FU følsomhet [2]. Dette konseptet har utviklet seg og blitt mer relevant mens behandling har avansert til molekylær målrettede æra. De fleste molekylære målrettede midler har forhåndsdefinerte mål, som letter forutsi effekten av behandlingen eller prognose av sykdommer. Gode eksempler er epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) mutasjon for å forutsi effektiviteten av EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer (TKI) i lunge adenokarsinom [3], så vel som KRAS mutasjon for å forutsi den ikke-responsivitet av EGFR-monoklonale antistoff i kolorektal cancer (CRC) [ ,,,0],4]. Selv om omfattende studier har blitt gjennomført for å identifisere nye prediktorer fra kjente signalveier eller microarray-baserte studier [5], [6], biomarkører for å forutsi kjemoterapi følsomhet fortsatt dårlig definert.
(A) KRAS-slått ned DLD-1
G13D celler var mer resistente overfor oksaliplatin, men har samme følsomhet for irinotecan, 5-FU, og doksorubicin enn foreldre DLD-1
G13D celler, som vist ved MTT-analyse. (B) Proteininnholdet av ERCC1, men ikke de av TOPO1 eller TS, ble oppregulert etter DLD-1
G13D celler ble slått ned av KRAS siRNA. (C) Den mRNA nivået av ERCC1, men ikke de av TOPO1 eller TS, ble oppregulert etter DLD-1
G13D celler ble slått ned av KRAS siRNA. ***:
p
0,001
Flere post hoc analyser av nyere randomiserte studier på CRC antydet at KRAS genmutasjon status kan forutsi effekten av cytostatika, spesielt. for oxaliplatin-baserte regimer. OPUS [7] og PRIME [8] studier, som begge ble utformet for pasienter å motta førstelinje oksaliplatin /5FU /folinsyre med /uten EGFR monoklonale antistoffer, er gode eksempler. Primært fokus på kjemoterapi-eneste gruppen i disse 2 studier viser at førstelinje progresjonsfri overlevelse (PFS) i KRAS mutant gruppen varte lenger enn det som i vill-type gruppe, med 8,6 versus 7,2 måneder i OPUS studien, og 8,8 versus 8,0 måneder i PRIME studien. I motsetning i CRYSTAL studien [9], som er designet for pasienter som fikk førstelinje irinotecan /5FU /folinsyre med /uten EGFR monoklonalt antistoff, ble et lignende fenomen ikke observert. Median førstelinje PFS i KRAS-mutant og villtype pasienter var 7,7 og 8,4 måneder, henholdsvis.
Ifølge disse observasjonene vi en hypotese om at KRAS mutasjon kan være en prediktor for oksaliplatin følsomhet i CRC. Først KRAS ble slått ned i KRAS-mutant CRC celler og overexpressed i KRAS-villtype CRC celler. Disse sammenkoblede CRC-celler ble testet ved oksaliplatin, irinotekan og 5-FU for å evaluere endringer i medikamentsensitivitet. Grunner for følsomhet endring ble videre bestemt av western blot og sanntids kvantitativ revers transkriptase polymerase chain reaction (QRT -PCR). Til slutt ble målet ansvarlig for følsomhet endring validert ved å slå ned og overekspresjon målet.
(A) KRAS-slått ned SW480
G12V celler var mer resistente overfor oksaliplatin, men ha den samme følsomhet til irinotecan, 5-FU og doxorubicin enn foreldre SW480
G12V celler, som demonstrert av MTT-analyse. (B) Proteininnholdet av ERCC1, men ikke de av TOPO1 eller TS, ble oppregulert etter SW480
G12V celler ble slått ned av KRAS siRNA. (C) Den mRNA nivået av ERCC1, men ikke de av TOPO1 eller TS, ble oppregulert etter SW480
G12V celler ble slått ned av KRAS siRNA. ***:.
p
0,001
Materialer og metoder
Cell Kultur og reagenser
Menneskelig CRC cellelinjer COLO320DM (KRAS -wild-type), DLD-en
G13D (KRAS G13D-mutasjon), og SW480
G12V (KRAS G12V mutasjon) ble alle hentet fra American Type Culture Collection. Celler ble alle opprettholdt i RPMI-1640 inneholdende 10% føtalt bovint serum, 2 mmol /liter L-glutamin (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), og PSA (10.000 enheter /ml penicillin, 10 mg /ml streptomycin , og 25 ug /ml amfotericin B; Biological Industries, Kibbutz Beit HaEmek, Israel) og dyrket ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO2. Oksaliplatin (Eloxatin® injeksjon 5 mg /ml) ble hentet fra Sanofi-Aventis Co., Ltd (Taipei, Taiwan). Irinotecan, 5-FU og doksorubicin ble alle kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Kanin antistoffer for western blot mot ERCC1 og KRAS ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA). Muse antistoffer mot TS, topoisomerase I (TOPO I), og β-aktin ble oppnådd fra Millipore (Bedford, MA, USA), BD Biosciences (San Jose, CA, USA) og Cell Biolabs, Inc. (San Diego, CA, USA), respektivt.
(A) KRAS
G13D-DDK-myc-COLO320DM cellene mer følsomme for oksaliplatin, men har samme følsomhet for irinotecan, 5-FU, og doksorubicin enn foreldre COLO320DM celler, så vist ved MTT-analyse. (B) Proteininnholdet av ERCC1, men ikke de av TOPO1 eller TS, ble nedregulert etter COLO320DM-celler ble transfektert med KRAS
G13D mutant vektor. (C) Et mRNA-nivået av ERCC1, men ikke de av TOPO1 eller TS, ble nedregulert etter COLO320DM-celler ble transfektert med KRAS
G13D mutant vektor. **:.
p
0,01
Knocking ned av KRAS og ERCC1
To typer av både KRAS og ERCC1 små interfererende RNA (siRNA) og egge uspesifikk (negativ kontroll) siRNA ble kjøpt fra Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA, USA). For KRAS genet knockdown, DLD-en
G13D og SW480
G12V celler ble først transfektert med KRAS- eller egge sirnas for en dag ved hjelp av Lipofectamine2000 transfeksjon reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner . De transfekterte celler ble deretter behandlet med oksaliplatin, irinotecan, 5-FU og doxorubicin med forskjellige konsentrasjoner av de følgende 72 timer. Proteinet lysat og mRNA av foreldrenes og KRAS knockdown DLD-en
G13D og SW480
G12V celler ble samlet inn i 24, 48, 72 og 96 timer etter transfeksjon for evaluering av KRAS knockdown omfanget av western blot. For ERCC1 genet knockdown, COLO320DM celler transfektert med to forskjellige ERCC1- eller egge sirnas ble behandlet med oksaliplatin i 72 timer. Proteinet lysat og mRNA av foreldrenes og ERCC-slått ned COLO320DM celler ble samlet inn i 24, 48, 72 og 96 timer etter transfeksjon for å vurdere ERCC1 knockdown effekten av western blot og QRT-PCR.
( A) KRAS
G12V-DDK-myc-COLO320DM cellene mer følsomme for oksaliplatin, men har samme følsomhet for irinotecan, 5-FU og doxorubicin enn foreldre COLO320DM celler, som demonstrert av MTT-analyse. (B) Proteininnholdet av ERCC1, men ikke de av TOPO1 eller TS, ble nedregulert etter COLO320DM-celler ble transfektert med KRAS
G12V mutant vektor. (C) Et mRNA-nivået av ERCC1, men ikke de av TOPO1 eller TS, ble nedregulert etter COLO320DM-celler ble transfektert med KRAS
G12V mutant vektor. **:
p
0,01. (D) Økt andel av apoptose, fra 22,5% ± 0,2% til 39,1% ± 0,2% av apoptose (P 0,001), er blitt demonstrert når KRAS
WT-DDK-myc-COLO320DM celler, ble sammenlignet med KRAS
G12V-DDK-myc-COLO320DM celler, hvori begge ble behandlet med den samme konsentrasjon av oksaliplatin i 5 uM. *:
p
0,001
Overuttrykte KRAS og ERCC1
pCMV6-Myc-DDK-merket-KRAS vektor ble kjøpt fra OriGene Technologies (. Rockville, MD, USA). DNA-sekvens som koder KRAS G12V og G13D mutasjon ble generert ved seterettet mutagenese og klonet inn i pCMV6-Myc-DDK-merket-KRAS vektor. Sekvensene til KRAS G12V og G13D-mutasjon var som følger: 5′-GTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAATGCC-3 «; omvendt: 5»-GGCACTCTTGCCTACGCCAACAGCTCCAACTACCACAAG-3 «og fremover: 5′-GGTAGTTGGAGCTGGTGACGTAGGCAAGAGTGCC-3′; omvendt: 5»-GGCACTCTTGCCTACGTCACCAGCTCCAACTACC-3 «, henholdsvis. For KRAS overekspresjon, ble COLO320DM celler transient transfektert med pCMV6-Myc-DDK-tagget-KRAS, -KRAS
G12V, og -KRAS
G13D vektorer. Etter 24 timer av transfeksjon ble cellene behandlet med oksaliplatin, irinotecan, 5-FU og doxorubicin med ulike konsentrasjoner for de følgende 72 timer. Proteinet lysat og mRNA av COLO320DM celler transfektert med pCMV6-Myc-DDK-tagget-KRAS, -KRAS
G12V, og -KRAS
G13D vektorer var samlet på 24, 48, 72 og 96 timer for evaluering av KRAS overekspresjon omfanget av western blot. For ERCC1 overekspresjon, ble SW480
G12V celler transfektert med pCMV6-ERCC1-GFP vektor (OriGene Technologies, Rockville, MD, USA) i 24 timer, og behandles med oksaliplatin i 72 timer. Proteinet lysat av SW480
G12V-celler transfektert med den ERCC1-GFP-vektoren ble oppsamlet ved 24, 48, 72 og 96 timer for evaluering av ERCC1 overekspresjon størrelse ved western blot.
(A) ERCC1- slått ned COLO320DM cellene mer følsomme for oksaliplatin enn foreldre COLO320DM celler, som vist ved MTT-analyse. (B) Protein og mRNA nivåer av ERCC1 ble nedregulert når COLO320DM cellene ble slått ned av ERCC1 siRNA. *:
p
0,05 (C) ERCC1-GFP-SW480
G12V cellene mer motstandsdyktig mot oksaliplatin enn foreldre SW480
G12V celler. (D) Ektopisk ERCC1 ble oppregulert etter SW480
G12V celler ble transfektert med ERCC1-GFP uttrykk vektor.
Cell Livskraftig og apoptotiske Analyser
Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT; Tokyo Chemical Industry Inc., Tokyo, Japan) assay i 6 replikater. Opprinnelig ble COLO320DM, SW480
G12V, og DLD-1
G13D cellene sådd ut ved 3500, 4500, og 3000 celler per brønn i 96-brønners flatbunnede plater, henholdsvis. Etter 24 timers inkubasjon ble SW480
G12V og DLD-en
G13D celler transfektert med KRAS- og egge sirnas, og COLO320DM celler ble transfektert med pCMV6-Myc-DDK-merket KRAS, -KRAS
G12V, og -KRAS
G13D vektorer, som beskrevet. Etter KRAS-sirnas ble transfektert til DLD-en
G13D /SW480
G12V celler og KRAS-mutant vektorer til COLO320DM celler i 24 timer ble cellene behandlet med oksaliplatin, irinotecan, 5-FU og doxorubicin ved forskjellige konsentrasjoner i 10 % FBS-supplert RPMI-1640 i 72 timer. Kontrollcellene ble blandet med DMSO ved en konsentrasjon som er lik den i medikamentbehandlede celler. Celleviabilitet av disse behandlede celler ble målt ved tilsetning av 200 ul 0,5 mg /ml MTT oppløst i DMSO til hver brønn, og cellene ble inkubert i CO
2 inkubator ved 37 ° C i 2 timer etter fjerning av mediet. Absorbans ble bestemt ved 570 nm. Konsentrasjoner av forbindelser som hemmet levedyktighet med 50% (IC
50) ble bestemt ved hjelp av median effekt metoden ved å ansette CalcuSyn programvare (Biosoft, Ferguson, MO, USA).
(A) Protein uttrykk for ERCC1 i DLD-en (KRAS
G13D mutasjon) celler er oppregulert etter 5′-azacitidin (de-metyleringsmiddel) behandling i 96 timer, noe som innebar at nedregulering av ERCC1 i KRAS-mutant CRC celler kan være delvis gjennom ERCC1 hypermethylation. (B) nedregulering av ERCC1 i COLO320DM (KRAS villtype) celler transfektert med KRAS
G13D-mutant-vektor for 24 og 96 timer kan ikke bare gjenopprettes ved 5′-azacitidin i 10 mm, men også forårsaket opp- regulering av DNMT3B.
brøkdel av apoptotiske celler, etter KRAS overexpressed i COLO320DM celler, og behandles av oksaliplatin, ble vurdert av flowcytometri med Annexin V-FITC. COLO320DM celler ble sådd på 2,5 × 10
5 celler /per brønn for kryptert og KRAS
G12V-mutant-vektor transfeksjon i seks-brønns plater. Etter 6 timer etter transfeksjon, ble transfeksjon medium erstattet med det faste mediet. Oksaliplatin med den konsentrasjon på 5 uM ble gitt til transfekterte celler COLO320DM i den neste dag. Transfekterte COLO320DM Cellene ble så trypsinert og oppsamlet for analyse etter 48 timer med oksaliplatin behandling. Cellene ble sentrifugert ved 300 g i 5 minutter ved romtemperatur, og ble cellesuspensjonen farget med Annexin V-FITC (Annexin V assay kit, BD Biosciences Pharmingen) og propidiumjodid ved romtemperatur i minst 15 minutter i mørket. Cellene ble så analysert ved hjelp av FACScan strømningscytometer og celle søken program. Andelen av apoptotiske celler var andel celler farget med Annexin V-FITC.
Western Blot analyse
KRAS-overexpressed COLO320DM og KRAS-slått ned SW480
G12V og DLD- 1
G13D celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av oksaliplatin, irinotecan, og 5-FU i 72 timer i 6-cm skåler (1 x 10
5 celler pr tallerken) ble samlet og lysert med en RIPA-lysebuffer [50 mmol /L Tris-HCl (pH 8,0), 150 mmol /l NaCl, 1% NP40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS] (Sigma katalog nr. R0278). Proteinkonsentrasjoner av lysatet ble bestemt ved anvendelse av en Pierce BCA proteinanalysesett (Thermal Scientific, Odessa, Texas, USA). Ekvivalente mengder av protein fra hvert lysat ble underkastet SDS-PAGE og deretter overført til nitrocellulosemembraner for immunblotting. De transblottet Membranene ble vasket to ganger med Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 0,1% Tween 20 (TBST). Etter blokkering med TBST som inneholdt 5% fettfri melk i 40 minutter, ble membranene inkubert med det passende primære antistoff i TBST inneholdende 1% fettfri melk ved 4 ° C over natten. Alle de primære antistoffer ble fortynnet i en passende konsentrasjon av 1% fettfri melk inneholdende TBST. Etter behandling med det primære antistoff ble membranene vasket to ganger med TBST i 20 minutter, etterfulgt av geit-anti-kanin eller anti-mus-IgG-pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (fortynnet 1:3000) i 1 time ved romtemperatur og vasket 3 ganger med TBST i 1 time. Membranene ble utviklet ved hjelp av en forbedret chemiluminescence pepperrotperoksidase substrat (Millipore, Bedford, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Sanntids Kvantitativ revers transkriptase Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR)
KRAS-overexpressed COLO320DM, KRAS-slått ned SW480
G12V og DLD-en
G13D celler behandlet med ulike konsentrasjoner av oksaliplatin, irinotecan, og 5-FU for 24, 48 og 72 timer, henholdsvis, ble samlet og lysert i en Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og lagret ved -20 ° C. RNA fra disse cellene ble ekstrahert i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert fra total RNA (1 mikrogram) med Applied Biosystems High-Capacity cDNA Arkiv kit i henhold til produsentens instruksjoner. Den cDNA fra 50-ng total RNA ble kvantifisert ved bruk av Taqman Universal eller SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) på en ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Perkin-Elmer /Applied Biosystems). Primersekvensene av ERCC1 (ABI Taqman-analyse ID: Hs01012158_ml), TOPO I (ABI Taqman-analyse ID: Hs00243257_ml), TS (ABI Taqman-analyse ID: Hs00426586_ml), og β-aktin-genet (ABI Taqman-analyse ID: Hs99999903_ml) som en endogen kontroll ble alle kjøpt fra Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). Forhold for PCR var 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter og 40 sykluser med 95 ° C i 15 sekunder (denaturering) og 60 ° C i 1 minutt (annealing /forlengelse). Den relative mRNA mengden av målgenet /endogene kontroll gen (β-aktin) ble beregnet ved anvendelse av ΔCt (terskelsyklus) metode, som følger: relative uttrykk = 2-ΔCt, hvor ΔCt = Ct (målgenet) – Ct (β p-aktin).
Statistical Analysis
for cellelinje studier ble alle data gjentas i minst 3 uavhengige eksperimenter. Kvantitative data blir representert som gjennomsnitt ± SD. Sammenligninger mellom data innenfor de samme eksperimentene ble analysert ved hjelp av Student
t
test. En
p
-verdi av. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Knocking ned KRAS i KRAS-mutant CRC cellene øker Oxaliplatin Resistance og årsaker ERCC1 Overuttrykte
Knocking ned KRAS i DLD-en
G13D celler resulterte i cellene mer motstandsdyktige overfor oksaliplatin, men ikke til irinotecan, og 5-FU, standard kjemoterapeutika for CRC, og ikke til doxorubicin, bredspektret kjemoterapeutisk middel for andre store kreftformer. To forskjellige KRAS-sirnas ble transfektert til DLD-en
G13D celler. IC
50 av de første-paret foreldre DLD-en
G13D /KRAS-siRNA (1) -DLD-en
G13D celler behandlet med oksaliplatin i 72 timer var 3,97 /33,07 mikrometer. Den andre-paret foreldre DLD-en
G13D /KRAS-siRNA (2) -DLD-en
G13D celler var 3,97 /13,49 mikrometer. IC
50 over sammenkoblede foreldre DLD-en
G13D /KRAS-siRNA-DLD-en
G13D celler behandlet med irinotecan, 5FU og doxorubicin forble uendret (figur 1A). ERCC1, TOPO jeg og TS, som ble antatt å være biomarkører for å forutsi følsomheten av oksaliplatin [1], irinotecan [10] og 5-FU [2], henholdsvis, ble ytterligere undersøkt ved western blot og QRT-PCR (figur 1B, and1C ) for å utforske mekanismene bak våre funn. Bare ERCC1 uttrykk ble oppregulert etter KRAS knockdown; i motsetning til dette TOPO I og TS holdt seg konstant både i protein og mRNA-nivåer. KRAS knockdown effektivitet ble evaluert av western blot, som viste svekket av KRAS uttrykk etter 72-timers for banket ned KRAS-genet (figur 1B).
For ytterligere å befeste vår observasjon, vi brukte en annen CRC celle, SW480 , som næret en annen KRAS mutant subtype, G12V, å gjenta de samme eksperimentelle prosedyrer. I sammendraget, foreldre SW480
G12V celler var, som forventet, mer følsomme for oksaliplatin enn KRAS slått ned SW480
G12V celler. IC
50 av foreldre SW480
G12V /KRAS-siRNA-SW480
G12V celler behandlet med oksaliplatin i 72 timer var 2,08 /13,53 mikrometer, men at foreldrenes SW480
G12V /KRAS-siRNA- SW480
G12V celler behandlet med irinotecan, 5FU og doxorubicin uendret (figur 2A). ERCC1, TOPO jeg, og TS ble samtidig undersøkt ved western blot og QRT-PCR (Tall 2B og 2C), og igjen bare ERCC1 ble oppregulert etter KRAS knockdown, med TOPO I og TS nivåer uforandret i protein og mRNA nivåer. Tilsvarende ble KRAS knockdown effektivitet målt ved western blot, som viste en nedgang i KRAS uttrykk etter 72-timers for banket ned KRAS-genet (figur 2B).
overekspresjon KRAS i KRAS Villtype CRC Cells Leads til oxaliplatin Følsomhet og ERCC1 Nedregulering
Overuttrykte KRAS i COLO320DM celler ved KRAS-mutant vektorer resulterte i cellene mer følsomme overfor oksaliplatin. IC
50 av foreldre COLO320DM /KRAS
G13D-DDK-myc-COLO320DM celler behandlet med oksaliplatin i 72 timer var 2,86 /0,26 mikrometer, men at foreldrenes COLO320DM /KRAS
G13D-DDK-myc- COLO320DM celler behandlet med irinotecan, 5FU, og doxorubicin forble uendret (figur 3A). ERCC1, TOPO I, og TS ble undersøkt ved western blot og QRT-PCR (figurene 3B og 3C), som viste at bare ERCC1 ble nedregulert uten noen endring i protein og mRNA-nivåer i TOPO I og TS etter KRAS overekspresjon. Uttrykket av ektopisk KRAS og endogen KRAS ble målt ved western blot, som viste et robust uttrykk for ektopisk KRAS, med en konstant uttrykk for endogene KRAS etter 24-timers overekspresjon av KRAS-genet (Figur 3B).
de samme resultater ble også funnet i COLO320DM celler transfektert med KRAS
G12V-mutant vektor. IC
50 av foreldre COLO320DM /KRAS
G12V-DDK-myc-COLO320DM celler behandlet med oksaliplatin i 72 timer var 2,55 /0,25 mikrometer, men at foreldrenes COLO320DM /KRAS
G12V-DDK-myc- COLO320DM celler behandlet med irinotecan, 5FU, og doxorubicin forble uendret (figur 4A). Igjen ble bare ERCC1 downregulated uten noen endring av TOPO jeg og TS i protein (figur 4B) og mRNA nivåer (Figur 4C) etter KRAS overekspresjon. Ekspresjonen av ektopisk KRAS og endogene KRAS etter 24 timers overekspresjon av KRAS-genet er vist i figur 4B. For å styrke ytterligere funn som KRAS
G12V-DDK-myc-COLO320DM cellene mer følsomme for oksaliplatin enn foreldre COLO320DM celler, flowcytometri med annexin V-FITC ble utført. Følgelig øket prosentandel av apoptose, fra 22,5% ± 0,2% til 39,1% ± 0,2% av apoptose (P 0,001), har blitt funnet når sperre COLO320DM celler, transfektert ved KRAS
wt-DDK-myc-vektor, ble sammenlignet med COLO320DM celler, transfektert med KRAS
G12V-DDK-myc-vektor, der begge ble behandlet ved samme konsentrasjon av oksaliplatin på 5 mikrometer (Figur 4D).
Validating ERCC1 Expression som prediktor for oxaliplatin Sensitivity
Knocking ned ERCC1 i KRAS villtype CRC celler gjenoppretter oksaliplatin følsomhet.
for ytterligere å bekrefte forholdet mellom ERCC1 uttrykk og oksaliplatin følsomhet, vi banket ned ERCC1 genet ved hjelp av to forskjellige ERCC1-sirnas i KRAS-villtype celler (COLO320DM). Vi fant ut at IC
50 av den første-paret foreldre COLO320DM /ERCC1-siRNA (1) -COLO320DM celler behandlet med oksaliplatin i 72 timer var 2,75 /0,91 mikrometer (figur 5A). Den andre-paret foreldre COLO320DM /ERCC1-siRNA (2) -COLO320DM celler var 2,75 /0,83 mikrometer (figur 5A). Protein og mRNA uttrykk nivåer av ERCC1 ble nedregulert etter ERCC1 ble slått ned av ERCC1-siRNA i COLO320DM celler (figur 5B).
overekspresjon ERCC1 i KRAS-mutant CRC celler fører oksaliplatin motstand.
Overuttrykte ERCC1 i SW480
G12V celler ved ERCC1-overekspresjon vektor forårsaket SW480
G12V celler til å bli mer motstandsdyktig mot oksaliplatin. IC
50 av foreldre SW480
G12V /ERCC1-GFP-SW480
G12V celler behandlet med oksaliplatin i 72 timer var 1,87 /11,03 um (figur 5C). Western blot ble brukt til å bestemme ERCC1-GFP overekspresjon nivå etter transfeksjon (figur 5D).
Diskusjoner
Vår studie viser at KRAS mutasjon er en prediktor for oksaliplatin følsomhet i tykktarm kreft celler ved ERCC1 downregulation. Dette kan gi et viktig skritt for å personlig kjemoterapi i tykktarmskreft.
I pre-rettet behandling era, Tournigand et al [11] publiserte avgjørende artikkelen indikerer at førstelinje kjemoterapi med enten irinotecan /5FU /lecovorin (FOLFIRI) eller oksaliplatin /5-FU /folinsyre (FOLFOX6) i «ikke-valgt» metastatisk CRC pasienter, sekvensielt etterfulgt av den andre etter progresjon, ikke påvirke total overlevelse (OS). Sin artikkel også at begge regimene kan anbefales som en førstelinjebehandling for avansert CRC. I den moderne æra av målrettet terapi, har nåværende behandling blitt avanserte til personlig behandling etter villtype KRAS-genet ble identifisert som en prediktor for EGFR monoklonalt antistoff. KRAS-status har blitt anbefalt å bli rutinemessig sjekket inn daglig onkologisk praksis. For å identifisere bedre prediktorer i dagens cellegift eller nyere behandlingsmålene for KRAS-mutant CRC pasienter er berettiget. Vår studie ble initiert for å finne bedre prediktorer i dagens cellegift, som hypotesen ble generert fra subgruppeanalyser av randomiserte prospektive kliniske studier, PRIME [8] og OPUS [7], versus CRYSTAL [9]. Ifølge våre funn, kan KRAS-mutante CRC pasienter mer nytte av å motta førstelinje oksaliplatinbasert regimer enn KRAS-villtype pasienter. Dette fenomenet garanterer ytterligere bekreftelse av store prospektive kliniske studier.
Våre data viste at KRAS mutasjon i CRC celler forårsaket ERCC1 downregulation. Denne signifikante funn kunne tilsi at noen andre ukjente druggable mål kan fortsatt være ansvarlig for KRAS-mutant CRC behandling i tillegg til den tradisjonelle RAS /RAF /MEK /ERK-veien. For å utforske disse ukjente mål, kan studier designet fra epigenetisk og /eller genetisk synspunkt synspunkter være nyttig. Fra epigenetisk synspunkt, fører hypermethylation genet Slå er velkjent [12], [13]. I vår studie har vi funnet at proteinet uttrykk for ERCC1 i DLD-en (KRAS
G13D mutasjon) celler er oppregulert etter 5′-azacitidin (de-metyleringsmiddel) behandling i 96 timer (Figur 6A), som indikerte at nedregulering av ERCC1 i KRAS-mutant CRC celler kan være delvis gjennom ERCC1 hypermethylation. Vi fant også at nedregulering av protein uttrykk for ERCC1 i COLO320DM (KRAS villtype) celler transfektert med KRAS-mutant-vektor for 24 og 96 timer kan gjenopprettes ved 5′-azacitidin (figur 6B). Dette innebar videre at nedregulering av ekspresjon ERCC1 i CRC-celler er ikke bare delvis gjennom hypermethylation, men bestemmes også av endringer av KRAS ekspresjon i CRC-celler. Fordi nedregulering av ERCC1 i COLO320DM celler, transfektert med KRAS
G13D-mutant-vektor, kan være forårsaket av hypermethylation av ERCC1, vi videre sjekket DNMT3B (DNA metyltransferase 3B), hvis viktigste rolle er å fortsette prosessen med metylering. Vi fant at DNMT3B ble oppregulert når ERCC1 ble dowenregulated i COLO320DM celler, transfektert med KRAS
G13D-mutant-vektor (figur 6B). DNMT3B kan igjen undertrykke ved 5′-azacitidin, som avbildet som DNMT3B er trolig ansvarlig for metylering prosessen. Derfor våre data viste at ERCC1 downregulation i KRAS-mutant CRC celler kan være gjennom ERCC1 hypermethylation. Vi foreslo at KRAS-mutant CRC celler kan ha høyere metylering rente på CpG øyene ERCC1 promoter regionen enn KRAS-mutante celler transfektert med KRAS-siRNA. Denne hypotesen kan valideres ved å sammenligne de mulige forskjeller i hypermethylation på ERCC1 promoter region mellom KRAS-mutant celler og KRAS-mutant celler transfektert med KRAS-siRNA ved metylering spesifikk PCR og /eller natriumbisulfitt sekvense analyse [14]. Hele konseptet er at KRAS aktivere mutasjon kan føre DNMT3B oppregulering. Deretter DNMT3B kan binde seg til promotor-regionen i ERCC1 å resultere i hypermethylation av ERCC1 genet. Endelig hypermethylation av ERCC1 genet fører til nedregulering av ERCC1 uttrykk. Alternativt, fra genetisk synspunkt, som KRAS mutasjon er en aktiverende mutasjon, som har blitt bredt akseptert [15], [16], foreslo vi at det kan være en eksisterte ukjent faktor, som kan hemmes ved aktivering av KRAS gen eller nedstrøms signaler. Denne faktoren må også være en aktiverende faktor for å aktivere ERCC1 genet. Deretter, når KRAS genet er mutert (aktivert), denne faktoren kan bli hemmet, og mengden av denne faktoren kan bli avvist. Deretter kan ekspresjonen av ERCC1 undertrykkes på grunn av mangel på denne faktor. For å gjennomføre denne typen studier, reporter genkonstruksjoner bruker ERCC1 promoter, kan luciferase aktivitetsanalyse og kromatin immunoprecipitation bli dermed behov [17].
Selv om de detaljerte mekanismene bak disse funnene forblir unnvikende, crosstalks mellom det muterte KRAS-genet og DNA-reparasjon maskiner trasé, som også kan være ansvarlig for effekten av oksaliplatinbasert behandling, har blitt undersøkt [18], [19]. I tillegg kan ulike nye generasjoner av microarray-baserte teknologier, som sammenligner samme gitt celler med /uten KRAS mutasjon ved å banke ned og overekspresjon KRAS genet følgelig være en annen nyttig måte å definere nye mål for KRAS-mutant CRC behandling [5], [6].
Overekspresjon av ERCC1 er forbundet med motstanden til platinabasert kjemoterapi [1], [20], [21], [22], [23], [24], som har vært demonstrert i ulike typer kreft, inkludert esophageal kreft [25], ikke-småcellet lungekreft [26], og blærekreft [27]. Disse funnene er også kompatibel med den aktuelle studien. I vår studie har vi vist at KRAS villtype (COLO320DM) CRC cellene mer motstandsdyktig mot oksaliplatin enn de samme gitte celler (COLO320DM) transfektert med KRAS-mutant-vektorer.
