Abstract
Bakgrunn
Ja-assosiert protein (YAP) er en transkripsjons co-aktivator og regulerer celleproliferasjon og apoptose. Vi har undersøkt klinisk og biologiske betydningen av YAP i livmorkreft (EMCA).
Metoder
YAP uttrykk i 150 primære tumor vev fra pasienter med EMCA ble evaluert av immunhistokjemi og sin tilknytning til clinicopathological data ble vurdert. De biologiske funksjoner av YAP ble bestemt i EMCA cellelinjer gjennom knockdown /overekspresjon av YAP. Rollen til YAP i moduler stråling følsomhet ble også undersøkt i EMCA celler.
Resultater
Økt atom YAP uttrykk var signifikant assosiert med høyere kvalitet, scene, Lympho-vaskulære rommet invasjon, postoperativ tilbakefall /metastase og total overlevelse i østrogen mediert EMCA, kalt type 1 cancer (p = 0,019, = 0,028, = 0,0008, = 0,046 og = 0,015, henholdsvis). I multivariat analyse ble atom YAP uttrykk bekreftet som en selvstendig prognostisk faktor for total overlevelse ved type 1 EMCA. YAP knockdown etter siRNA resulterte i en signifikant reduksjon i celleformering (p 0,05), forankringsavhengig vekst (p = 0,015) og migrasjon /invasjon (p 0,05), og en betydelig økning i antall celler i G0 /G1 fase (p = 0,002). Omvendt, YAP overekspresjon fremmet celleproliferasjon. Klonogene analysen vist forbedret Radiosensitivity med ca 36% i YAP hemmet celler.
Konklusjoner
Siden YAP fungerer som en transkripsjons co-aktivator, dens differensial lokalisering i kjernen av kreftceller og påfølgende innvirkning på celleproliferasjon kan ha viktige konsekvenser i forhold til sin rolle som et onkogen i EMCA. Nuclear YAP uttrykket kan være nyttig som en prognostisk indikator eller terapeutiske målet, og forutsi stråling følsomhet hos pasienter med EMCA
relasjon:. Tsujiura M, Mazack V, Sudol M, Kaspar HG, Nash J, Carey DJ, et al . (2014) Ja-Associated Protein (YAP) modulerer Oncogene Funksjoner og stråling følsomhet i livmorkreft. PLoS ONE 9 (6): e100974. doi: 10,1371 /journal.pone.0100974
Redaktør: Hong Wanjin, Institutt for molekylær og cellebiologi, Biopolis, USA
mottatt: 22 februar 2014; Godkjent: 01.06.2014; Publisert: 27 juni 2014
Copyright: © 2014 Tsujiura et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Midler til arbeidet som er gjort i denne publikasjonen var fra Grant SRC-075 Clinic forskningsfond, Geisinger Medical Center og Rice Cancer Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Endometriekreft (EMCA) er den fjerde vanligste kreftformen og den vanligste gynekologisk kreft i amerikanske kvinner, med ca 8200 dødsfall og 49500 nye tilfeller i USA i 2013 [1]. Mens kvinner med EMCA generelt har en god prognose med 81,5% 5-års overlevelse (2003-2009), har forekomsten og dødeligheten av EMCA fortsatte å stige i gjennomsnitt 1,1% og 0,4% henholdsvis hvert år de siste 10 årene [2 ]. Senere tids økning i forekomsten av endometrial kreft priser har blitt vurdert i stor grad tilskrives fedme-epidemien [3]. Selv om forbedringer i diagnostiske teknikker og peri-operative ledelsen har ført til en økning i tidlig deteksjon av EMCA og gunstig prognose, kvinner diagnostisert med avansert eller residiverende sykdom har mye dårligere overlevelse og begrensede adjuvant behandling. Genuttrykkstudier har identifisert noen gener som er forskjellig uttrykt i EMCA, for eksempel
PTEN
,
KRAS
,
CTNNB1
,
PIK3CA Hotell og
FGFR2 product: [4], [5], [6], [7]. I klinisk setting, men noen få molekyler har blitt analysert som terapeutisk og /eller diagnostiske biomarkører. Derfor er viktig for å tilpasse behandlinger og forbedre resultatet og livskvalitet hos pasienter med EMCA identifikasjon av biologiske markører og deres nedstrøms mål.
EMCA har blitt kategorisert i to typer. Type 1-kreft står for ca 80% av EMCA og er karakterisert som østrogenavhengig, østrogen reseptor (ER) og progesteron reseptor (PR) positiv med endometrioid morfologi og generelt en gunstig prognose [8]. Omvendt er estrogen-uavhengig type 2 kreft, ER /PR negativ, dårlig differensiert og forbundet med en mye dårligere prognose [9]. Standard behandling for begge typer inneholder en kirurgisk fjerning av livmoren, livmorhalsen, bilaterale eggledere og eggstokker. Pasienter med tumorer demonstrere høy risiko funksjoner kan i tillegg gjennomgå lymphadenectomy. Tidlig stadium EMCA med høyrisiko funksjoner, som for eksempel dypt myometriets invasjonen, er Lympho-vaskulære rommet invasjon (Wire) og høy klasse assosiert med en 15-25% risiko for tilbakefall [10]. Adjuvant radioterapi, er den vanligste form for terapi for tidlig stadium høyrisikopasienter, har blitt funnet i flere undersøkelser for å redusere bekken og vaginal gjentakelse 12-14% uten behandling til 3-4% med terapi, men likevel uten en tilsvarende økning i total overlevelse [11], [12]. Med andre ord, eksponerer strålebehandling et stort antall kvinner til toksisitet uten noen klar fordel i total dødelighet, spesielt de fleste pasienter som vil være fri for sykdom i fravær av tilleggsbehandling. Strålebehandling brukes også til tidligere ubehandlede pasienter med lokal /regional gjentakelse. Imidlertid, til tross for stråling, 50% av pasienter med lokalt tilbakefall vil til slutt dø av sykdommen [13], noe som tyder på at disse pasientene har strålingsresistente tumorer og kan ha nytte av alternativ behandling slik som kjemoterapi. Identifisere markører for strålesensitivitet /motstand ville tillate skreddersydd terapi til den mest effektive diett og redusere unødvendig strålings-indusert toksisitet.
Ja-assosiert protein (YAP) ble først identifisert i kraft av sin evne til å assosiere med Yes og Src-protein-tyrosin-kinaser [14].
YAP
genet ligger på menneskelig kromosom 11q22 koder en transkripsjons co-aktivator og er en av de to viktigste nedstrøms effektorer av Hippo svulst undertrykkende vei [15]. Hemming av Hippo vei fører til YAP aktivering, kjernefysiske lokalisering og økt aktivitet av transkripsjons målgener, slik som
CTGF Hotell og
AREG product: [16], [17]. Motsatt, aktivering av Hippo vei fører til YAP fosforylering, cytoplasma lagring og inaktivering. Den YAP serin 127 til alanin (S127A) mutant er en konstitutivt aktiv form som forblir i kjernen og er transkripsjonelt aktive. YAP regulerer balansen mellom celleproliferasjon og apoptose [18], [19], [20], og forsterkes i en rekke humane maligniteter, inkludert bryst-, øsofageal, hepatocellulær, ependymom, ondartet mesothelioma og medulloblastom [21], [22] , [23], [24], [25], [26]. I tillegg korrelerer YAP uttrykk med dårlig prognose i forskjellige kreftformer, slik som kolorektal, øsofageal, gastrisk, hepatocellulær, lunge og ovarie [22], [27], [28], [29], [30], [31], [32], etter
Det er også crosstalk mellom YAP og steroidhormoner. Dhananjayan et al. viste at YAP og WW domene bindende protein-2 (WBP-2) er co-aktivatorer av ER og PR [33], som spiller en nøkkelrolle i den normale menstruasjonssyklusen og i etiologien av type 1 EMCA. Selv om flere rapporter vist onkogene funksjoner for YAP i ulike kreft hos mennesker, forblir dens biologiske og kliniske relevansen i EMCA uklart. I tillegg fremmer YAP overekspresjon radioresistance i medulloblastoma celler gjennom YAP /IGF2 /Akt vei [34], noe som tyder på YAP kan fungere i moduler stråling følsomhet /resistens. Disse funnene oppfordret oss til å undersøke hvorvidt YAP kan spille en rolle i onkogenese og utvikling av EMCA og modulering av stråling følsomhet.
I denne studien undersøkte vi den potensielle nytten av YAP som en prognostisk og terapeutisk indikator i EMCA og den biologiske funksjon av YAP i EMCA. Videre vurderes vi YAP effekt om stråling følsomhet. Følgelig våre data gi bevis for at kjernefysisk YAP uttrykk er en markør for dårlig prognose og kan ha terapeutiske implikasjoner for behandling av pasienter med EMCA.
Materialer og metoder
Pasienter og vevsprøver
studiet ble godkjent av Institutional Review board på Geisinger Medical Center (Geisinger Medical Center IRB Protocol # 2011-0163) og en fraskrivelse av samtykke ble innhentet fra IRB Center for å utføre studien. Totalt 150 primær EMCA vev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk en hysterektomi på Geisinger Medical Center mellom 2008 og 2011, inkludert 120 tilfeller av type 1 EMCA og 30 tilfeller av type 2 EMCA. Demografisk og prognostisk informasjon, inkludert alder, kroppsmasseindeks (BMI), klasse, scene, Wire og overlevelse data ble innhentet fra alle fag. Makroskopiske og mikroskopiske klassifiseringer av svulster ble basert på International Federation of gynekolog og fødselsleger (FIGO) staging system [35], [36].
Immunohistochemistry
Parafin vevsprøver ble kuttet til en tykkelse på 5 mikron og utsatt for immunhistokjemisk farging av YAP protein med avidin-biotin-peroksidase-metoden. Antigen gjenfinning ble utført ved å varme opp prøvene i citrat-buffer (pH 6,0) i 5 minutter på høy effekt, deretter 10 minutter medium strøm, ved bruk av en mikrobølgeovn. Objektglassene ble avkjølt og skylt i destillert vann, og farget med DAKO Autostainer som følger: Platene ble inkubert i 3% hydrogenperoksid 5 minutter med etterfølgende rensing i TBST-buffer. Prøvene ble så inkubert i YAP antistoff (1:200, NB110-58358) fra Novus Biologicals (Littleton, CO) i 30 minutter med en påfølgende vask TBST og inkubert i Dako Envision + HRP-kanin-oppløsning (Dako, Carpinteria, CA) (fortynnet i henhold til produsentens instruksjoner) i 30 minutter. Etter en TBST vask, ble slides så inkubert i Dako DAB-løsning i 10 minutter og skyllet igjen med TBST-buffer. Objektglassene ble deretter motfarget som følger: 20 andre inkubasjon i gjellene Hematoxylin flekk, etterfulgt av en vannkran vask. Skinnene var dehydrert og deretter lufttørket, og prøver ble montert i monteringsmedium. Immunostained lysbilder ble evaluert for både kjernekraft og cytoplasma kjertel farging av YAP ved en gynekologisk patolog, (HK) ledelsen til intensitet ved hjelp av en 5 poeng (0-4) skala.
EMCA cellelinjer
Tre humane type 1 EMCA cellelinjer, HEC-1-A, HEC-1-B og Ishikawa, ble anvendt i denne studien. HEC-en-A (ATCC HTB112) og HEC-1-B (ATCC HTB113) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Ishikawa celler ble gitt av Dr. Jennifer Richer (University of Colorado) [37], [38], [39]. HEC-1-A ble dyrket i McCoys 5A medium (ATCC, Manassas, VA) supplert med 10% (v /v) serum føtalt bovint (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), HEC-1-B i Eagle «s minimale essensielle medium (EMEM) (ATCC, Manassas, VA) supplert med 10% (v /v) FBS og Ishikawa i minimalt essensielt medium (MEM) (Life Technologies, Carlsbad, CA) supplert med 1% ikke-essensielle aminosyrer ( NEAA), 6 ng /ml insulin og 5% (v /v) FBS. Antibiotika (10 enheter /ml penicillin og 10 ug /ml streptomycin) ble tilsatt til alle kulturmedier. Alle cellelinjer ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% karbondioksyd.
Western blot-analyse
Cellene ble lysert i Tris-buffer (10 mmol /l, pH 7,4) inneholdende 5 mmol /l EDTA, 300 mmol /l NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksykolat, 0,1% SDS og en protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og underkastet SDS-PAGE . Anti-YAP antistoff (NB110-58358) ble kjøpt fra Novus Biologicals (Littleton, CO); anti-fosfor-YAP (ser127) (# 4911) fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA); anti-NF2 (sc-331) fra Santa Cruz; anti-LATS2 (ab70565) og anti-GAPDH (ab9485) fra Abcam (Cambridge, Storbritannia). Passende pepperrotperoksidase-konjugert sekundære antistoffer (Anti-Rabbit /mus, GE Healthcare, Little Chalfont, UK) ble brukt. Proteinbånd ble visualisert med en forbedret chemiluminescence substrat (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) og oppdaget ved hjelp av LAS-3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan).
immunfluorescens og bildebehandling
dyrkede celler ble vasket med PBS og fiksert i 4% (vekt /volum) paraformaldehyd. Etter permeabiliseringen med 0,2% Triton X-100 i PBS, ble cellene blokkert i 5% (w /v) geiteserum i PBS og inkubert med primært antistoff (YAP, 1:500) ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av Alexa Fluor 488 geite-anti kanin (1:500) som sekundært antistoff i 30 minutter ved romtemperatur. Etter å ha blitt montert med 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) for kjernen farging, celler ble undersøkt ved hjelp av en fluorescens mikroskop (Olympus IX81, Olympus, Tokyo, Japan).
Kort interfering RNA (siRNA ) behandling
siRNA rettet mot
YAP
genet (sc-38637, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) ble brukt for tap-av-funksjon eksperimenter. Kontrollen siRNA (SC-37007, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) ble anvendt som en negativ kontroll. Hver siRNA (37,5 nM) ble transfektert inn EMCA celler ved hjelp Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Knockdown av en mål-genet ble bekreftet ved Western blotting.
celleproliferasjonsanalyse
Antallet levedyktige celler ved forskjellige tidspunkter etter transfeksjon av sirnas ble vurdert ved en kolorimetrisk vannløselig tetrazoliumsalt analysen (Cell telling kit-8; Dojindo, Kumamoto, Japan). som beskrevet andre steder [40]
Soft agar assay
for in vitro testing av forankringsuavhengig koloni utvikling, 5000 celler transfektert med sirnas i 48 timer ble platet ut i 1 ml 0,4% agar i smeltet EMEM med 10% (v /v) FBS i 6-brønners plater lagt over med 1,5 ml av 0,9% smeltet agar i det samme medium. Platene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% karbondioksyd. Pletteringen ble utført i sextuplicate og en liten mengde av EMEM komplett medium ble forsiktig tilsatt med få dagers mellomrom på toppen av hver brønn for å sikre nærings forsyninger og for å hindre uttørking. Etter inkubasjon i omtrent fire uker, ble cellene fiksert og farget med en oppløsning inneholdende 2% etanol og 0,03% krystallfiolett, og antallet kolonier ble bedømt ved to uavhengige blindet søkere.
invasjon og migrasjon Assays
Transwell migrering og invasjon analyser ble utført ved anvendelse av 24-brønners BioCoat celledyrkningsinnsatser (BD, Franklin Lakes, NJ). Den øvre overflate med en diameter på 6,4 mm filtre med 8-um porer porer ble forbelagt med (invasjon assay) eller uten (migrering assay) ekstracellulære matriks belegg (Matrigel). 50.000 siRNA transfekterte celler i serumfritt medium ble podet på det øvre kammer av hvert innsats, med fullstendig medium tilsatt til den nederste kammer. Etter 24 timer inkubering, overføres eller invaderende celler på den nedre overflate av filterne ble fiksert og farget med differensial Quik Stain Kit (elektronmikroskopi Sciences, Hatfield, PA), og antallet fargede celler som hadde migrert /invadert til bunnen på filteret ble tellet direkte av to uavhengige blindet søkere.
cellesyklusanalyse
for flowcytometrisk analyse, ble cellene trypsinert 72 eller 96 timer etter transfeksjon av sirnas, etterfulgt av inkubasjon i en fargings buffer (0,1% Triton X-100, 0,2 mg /ml RNase A og 40 ug /ml propidiumjodid i PBS). Celler ble analysert for DNA innhold ved hjelp av Beckman Coulter, Cytomics FC 500 (Brea, California).
Expression konstruerer og kolonidannelse analysen
plasmider uttrykker villtype YAP (pEGFP-C3-WT YAP) ble oppnådd ved å klone hele kodende sekvens av YAP med 504 aminosyrer [41] inn i vektoren pEGFP-C3 (en gave fra Gregory Matera og Channing Der, University of North Carolina, Chapel Hill, NC). S127A mutant form av YAP (pEGFP-C3-S127A-YAP) ble generert gjennom PCR-mediert seterettet mutagenese av pEGFP-C3-WT-YAP. pEGFP-C3-WT-YAP, pEGFP-C3-S127A-YAP eller den tomme vektoren (pEGFP-C3-EV) som en kontroll ble innført i EMCA celler ved anvendelse av Lipofectamine LTX og Plus reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Ekspresjonen av YAP protein i transfekterte celler ble bekreftet ved western-blotting. Etter inkubasjon i omtrent fire uker med hensiktsmessige konsentrasjoner av G418, ble cellene fiksert og farget med en oppløsning inneholdende 10% formaldehyd og 1% krystallfiolett. De fargede området ble beregnet ved hjelp av densitometri ImageJ programvare.
klonogene analyse og bestrålingsbetingelser
Overlevelse etter bestråling ble definert som evnen til cellene for å opprettholde deres klonogene kapasitet. I korthet ble et økende antall celler transfektert med kontroll siRNA eller YAP-spesifikk siRNA i 48 timer ble sådd ut i 6-brønns plater. Celler ble bestrålt med på 0 til 6 Gy ved hjelp av en lineær akselerator og returnert til inkubatoren i flere uker før cellene i kontrollbrønnene var blitt dannet tilstrekkelig store kolonier. Kolonier ble dannet ble fiksert og farget med en oppløsning inneholdende 10% formaldehyd og 1% krystallfiolett og de med minst 50 celler ble talt ved to uavhengige blindet søkere. Antallet kolonier oppnådd fra tre replikater ble midlet for hver tilstand. Disse gjennomsnittsverdiene ble korrigert i henhold til plating effektiviteten av respektive kontroller for å beregne celleoverlevelse for hvert dosenivå. Den lineære kvadratisk likning ble montert til datasett for å generere overlevelseskurver, og dose ekstrautstyr faktor ble beregnet til 10% gjenlevende fraksjon (DEF 0.1).
Statistisk analyse
Korrelasjon mellom atom /cytoplasma farging nivåer og clinicopathological faktorer ble vurdert av t-test, chi kvadrat test eller Fisher test tilsvarende. Mann-Whitney
U
-test og Student t- test ble brukt for å sammenligne forskjellen i biologisk atferd mellom transfekterte celler og kontrollceller. For analyse av overlevelse, ble Kaplan-Meier overlevelseskurver konstruert for grupper basert på univariate prediktorer og forskjeller mellom gruppene ble testet med log-rank test. For disse variablene er statistisk signifikant i univariate analysen ble Cox modell med sannsynligheten ratio test som brukes for videre evaluering av multivariat overlevelsesanalyse. P-verdi 0,05 ble betraktet som signifikant. Statistiske analyser ble utført ved bruk av JMP 10 (SAS Institute Inc., Cary, NC).
Resultater
YAP protein uttrykk i grunnskolen EMCA vev
For å avgjøre om YAP er uttrykt i menneskelig EMCA ble YAP protein uttrykk i grunnskolen EMCA vev vurdert av immunhistokjemi. Representative mikrografer som viser kjernekraft og cytoplasma YAP uttrykk er vist i figur S1. Siden den intracellulære lokalisering av YAP er generelt ansett som viktig for sin onkogene funksjon [42], både kjernefysiske og cytoplasmatiske fargenivåer ble analysert og scoret for intensitet ved hjelp av en fem punkts skala (0-4). Demografiske data og YAP fargingsnivå som sammenligner type 1 og 2 EMCA er oppsummert i Tabell 1. Type 2 EMCA hadde høyere stadium, høyere frekvens av Lvsi og postoperativ metastase /gjentakelse, og høyere atom YAP ekspresjon sammenlignet med type 1 EMCA. Vi evaluerte neste sammenhengen mellom clinicopathological faktorer og YAP flekker i type 1 og type 2 EMCA, individuelt. Som vist i tabell 2, ble høyere atom YAP ekspresjon signifikant assosiert med høyere kvalitet, patologisk stadium, Lvsi og postoperativ tilbakefall /metastase i type 1 EMCA (p = 0,019, = 0,028, = 0,0008, = 0,046, respektivt). Ingen signifikant sammenheng mellom kjernekraft YAP uttrykk og disse variablene ble observert i type 2 EMCA (tabell S1). Cytoplasmatiske uttrykk for YAP var ikke assosiert med clinicopathological faktorer i enten type 1 eller type 2-kreft (data ikke vist). Kaplan-Meier overlevelses estimater viste at økt atom immunoreaktivitets av YAP var signifikant assosiert med dårligere total overlevelse i type 1 kreft. (P = 0,015, log-rank test, figur 1). Univariat analyse indikerte avansert stadium og tilstedeværelse av Lvsi også korrelert med dårlig total overlevelse (p = 0,0005 og 0,003, log-rank test, henholdsvis figur S2). Det var ingen sammenheng mellom total overlevelse og YAP cytoplasmisk farging i type 1 EMCA eller YAP atom /cytoplasma flekken i Type 2 EMCA (Figur S3). Ved multivariat Cox regresjonsanalyse som anses scenen, Wire og kjernekraft YAP nivå, bare atom YAP nivå (skår 2/3/4 versus scorer 0/1) uavhengig assosiert med total overlevelse (p 0,021). Våre data viser at atom YAP er assosiert med dårlig prognostiske funksjoner og redusert total overlevelse i Type 1 EMCA.
Økt atom immunoreaktivitets av YAP var signifikant assosiert med dårligere total overlevelse (P = 0,015, log-rank test).
YAP protein uttrykk i EMCA cellelinjer
for å få ytterligere innsikt i de biologiske rollene til YAP i EMCA, valgte vi å bruke tre type 1 EMCA celle linjer; HEC-1-A, HEC-1-B og Ishikawa. Vi først evaluert protein nivåer av YAP og fosfor-YAP (inaktiv YAP) (figur 2A). HEC-1-B viste de høyeste nivåene av total YAP og svært lave nivåer av inaktive fosfor-YAP av western blotting. I kontrast, HEC-1-A uttrykte de laveste nivåene av total YAP og de høyeste nivåene av inaktive fosfor-YAP. Immunfluorescens bekreftet høye nivåer av nukleær og cytoplasmisk YAP i HEC-1-B-celler og lave nivåer av nukleær og cytoplasmisk YAP i HEC-en-A-celler, i overensstemmelse med resultatene av Western blotting (figur 2B). Derfor HEC-1-B-celler ble brukt for en tap-av-funksjon eksperiment, og omvendt HEC-en-A-celler ble anvendt for en forsterkning-av-funksjon eksperiment.
(A) Ekspresjon av YAP og fosfor-YAP (Ser127) i tre EMCA cellelinjer av western blotting. (B) Immunofluorescent cytokjemiske farging av endogen YAP hjelp av anti-YAP antistoff (YAP: grønn, DAPI: blå).
YAP knockdown i EMCA celler
For å utvide våre immunhistokjemiske resultatene demonstrerer en sammenheng mellom atom YAP og dårlige prognostiske funksjoner i EMCA pasienter, bestemt vi effekten av YAP knockdown på celleproliferasjon ved hjelp av YAP-spesifikke siRNA (siYAP) og kontroll siRNA (siCont) i HEC-1-B-EMCA celler. Endogen ekspresjon av YAP protein ble effektivt inhibert ved 72 og 96 timer etter forbigående transfeksjon av siRNA (figur 3A). Celleproliferasjon ble signifikant redusert i de inhiberte celler YAP sammenlignet med kontrollcellene med 26,2% (72 timer) og 42,9% (96 timer), henholdsvis (figur 3A). Dette lignende veksthemmende virkning på celleformering ble bekreftet ved bruk av en alternativ YAP siRNA-sekvens (data ikke vist).
(A) hemmet protein ekspresjon av YAP ved YAP-spesifikk siRNA (siYAP) ble bekreftet ved Western-blotting både 72 og 96 timer etter transfeksjon (til venstre). Antall levedyktige celler mellom 24-96 timer etter transfeksjon av siYAP eller kontroll siRNA (siCont) ble evaluert i HEC-1-B-celler ved bruk av det vannløselige tetrazoliumsalt assay (Celletelling kit-8) (til høyre). 26,2% og 42,9% hemning av celleproliferasjon ble bekreftet ved knockdown av YAP ekspresjon ved 72 og 96 timer henholdsvis. (* P 0,05 (Mann-Whitney U-test)). Resultatene er vist i gjennomsnitt ± standardavvik (søyler) i fire eksperimenter. Lignende tendenser ble oppnådd i andre to uavhengige forsøk. (B) Antall kolonier i bløt agar ble sammenliknet mellom YAP hemmet celler og kontrollcellene for å evaluere forankringsuavhengig cellevekst i HEC-1-B-celler. Representant bilde av dannet kolonier i soft agar (til venstre). Kvantitativ analyse av antall dannede kolonier (til høyre), som viser en signifikant reduksjon i siYAP transfekterte celler. (* P 0,05 (Mann-Whitney U-test)). Kolonner og barer representerer midler og standardavvik i sextuplicate eksperimenter. Lignende tendenser ble oppnådd i en annen uavhengig eksperiment. (C) Transwell migrering og invasjon assay. Representant bilde av migrert /invadert HEC-1-B-celler (til venstre). Kvantitativ analyse av antall migrerte /invaderte celler (høyre), som viste en signifikant reduksjon i siYAP transfekterte celler. (* P 0,05 (Mann-Whitney U-test)). Kolonner og barer representerer midler og standardavvik i fire eksperimenter. Lignende tendenser ble oppnådd i en annen uavhengig eksperiment. (D) Strømningscytometrisk analyse. Representative resultater av befolkningen i hver fase av cellesyklusen i HEC-1-B-celler EMCA 72 og 96 timer etter transfeksjon med siCont /siYAP (til venstre). Kvantitativ analyse i befolkningen i hver fase (til høyre). siYAP transfekterte celler viste en betydelig opphopning av celler i G0 /G1 fase og betydelige reduksjoner i S og G2 /M faser på 72 og 96 timer (* P 0,05, ** P 0.001, Students t- test). Kolonner og barer representerer midler og standardavvik i tre eksemplarer eksperimenter. Lignende tendenser ble oppnådd i en annen uavhengig eksperiment.
Vi har også bestemt rolle YAP i forankringsuavhengig cellevekst, migrasjon og invasjon evne, ofte betraktet kjennetegn ved maligne transformerte celler. I myke agar-kolonidannelse analyser, knockdown av YAP i HEC-1-B-celler ble redusert evne til kolonidannelse sammenlignet med kontrollceller (p = 0,015, figur 3B). I cellemigrering /invasjons analyser, ble en signifikant reduksjon i antallet celler som migrerte /invaderte gjennom ubelagte /Matrigel-belagte membraner observert i siYAP transfekterte celler sammenliknet med siCont transfekterte celler (p 0,05, figur 3C). Disse eksperimentene viser at YAP uttrykket er assosiert med celleproliferasjon, forankringsuavhengig vekst og migrasjon /invasjon potensial i dette EMCA cellelinje.
Cell syklus analyse i EMCA celler
For å avgjøre om veksthemming fremkalt ved YAP knockdown forårsaket forandringer i cellesyklus, strømning ble utført cytometrisk analyse i HEC-1-B-celler transfektert med EMCA YAP-spesifikke og kontroll sirnas. I samsvar med resultatene av celle proliferasjonsanalyser, siYAP behandlet HEC-1-B-celler, viste en betydelig akkumulering av celler i G0 /G1 fase og signifikant reduksjon i S- og G2 /M-fase ved 72 og 96 timer, sammenlignet med siCont behandlede celler (Figur 3D). Samlet utgjør disse data tyder på at YAP knockdown produserer G0-G1 cellesyklus arrest i denne EMCA cellelinje.
YAP overekspresjon i EMCA celler
Basert på våre resultater fra tap-av-funksjon analyser, hypotese vi at overekspresjon av YAP i EMCA celler med lave endogene YAP nivåer vil øke celleproliferasjon. Vi undersøkte evnen til å danne kolonier etter forbigående transfeksjon av YAP uttrykker konstrukter i HEC-en-A-celler, som viste relativt lave nivåer av YAP og høye nivåer av fosfo-YAP (figur 2). Overekspresjon av GFP-merket villtype YAP og GFP-merket konstitutivt aktiv S127A mutant YAP i HEC-1-A-celler ble verifisert av western blotting (figur 4A). -Celler som overuttrykker WT-YAP eller S127A-YAP produsert vesentlig flere kolonier sammenlignet med celler transfektert med tom kontrollvektor (EV). Mens S127A-YAP transfekterte celler produsert flest kolonier, ble en signifikant forskjell som ikke er observert i forhold til WT-YAP transfektert celler (figur 4B). Disse resultatene støtter videre en rolle for YAP i celle spredning av EMCA.
(A) Endogene uttrykk for YAP (ca. 65 kDa) og eksogene uttrykk for YAP merket med GFP protein (ca 92 kDa totalt) i HEC -1-A-celler transfektert med vill-type YAP (WT-YAP) og S127A mutant YAP (S127A-YAP). (B) Representant bilde av kolonidannelse analysen (til venstre). Cellene ble transient transfektert med tom vektor (EV) /WT-YAP /S127A-YAP og valgt med passende konsentrasjoner av G418 i fire uker. De resistente kolonier dannet av YAP-transfekterte celler var betydelig tallrike sammenlignet med kontrollgruppen (Mann-Whitney U-test). Kolonner og barer representerer midler og standardavvik i fire eksperimenter. Lignende tendenser ble oppnådd i en annen uavhengig eksperiment.
Rolle YAP i moduler stråling følsomhet
Gitt betydningen av strålebehandling i EMCA behandling og nylig publiserte data implicating YAP i moduler stråling følsomheten av medulloblastom-celler, vi neste bestemmes effekten av YAP på strålesensitivitet i EMCA celler ved hjelp av en klonogene overlevelsesanalyse. Knockdown av YAP ekspresjon ved siRNA redusert klonogene overlevelses i HEC-1-B-celler, noe som resulterer i en økning i strålingsfølsomhet med en DEF 0,1 til 1,36 (fig 5). Nærmere bestemt, 90% celledreping ved stråling i siYAP transfekterte celler som kreves 3,48 Gy, mens den samme grad av celledreping i siCont transfekterte celler kreves 4,72 Gy. Derfor våre resultater viser en økt følsomhet for stråling med tap av YAP uttrykk i HEC-1-B-EMCA celler.
knockdown av YAP uttrykk av siRNA redusert klonogene overlevelse i HEC-1-B-celler, noe som resulterer i en økning i strålingsfølsomhet med en dose forbedring faktor ved 10% overlevelse (DEF 0,1) på 1,36. Resultatene er vist i gjennomsnitt ± standardavvik (søyler) i triplikat eksperimenter. Lignende tendenser ble oppnådd i tre andre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
Våre data identifisere de onkogene funksjoner av YAP i EMCA. The Hippo vei, spesielt den direkte oppstrøms regulator, LATS1 /2, modulerer negativt YAP aktivitet ved fosforylering av sin S127 nettstedet. Fosforylert-YAP er segregert i cytoplasma og målrettet for ubiquitin-mediert proteolyse [43], [44]. Derfor har den subcellulære lokalisering av YAP vært betraktet som avgjørende for dets biologiske funksjoner i forskjellige cancere [42]. Nuclear YAP uttrykk som en dårlig prognostisk markør har blitt vist i andre typer av kreft, slik som spiserøret, mave og ovarie [22], [28], [31], [32]. Våre immunhistokjemiske studier viste at høyere nivåer av atom YAP var assosiert med dårlig prognostiske faktorer, som for eksempel avansert stadium, klasse, Lvsi, postoperativ tilbakefall /metastasering og total overlevelse.
